卵泡刺激素对原癌基因c-myc在鸡卵泡上表达的影响

[目的]本试验旨在研究c-myc基因在鸡卵泡上的表达及卵泡刺激素(FSH)对其的诱导作用，为明确c-myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层，检测c-myc mRNA和蛋白的表达；应用50 ng·mL^-1FSH处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度，检测颗粒层和膜层c-myc、标记基因和周期相关基因的表达；体外分离、培养小黄卵泡颗粒细胞，预培养16 h,用siRNA干扰c-myc 24 h后，加入50 ng·mL^-1 FSH处理24 h,检测c-myc mRNA的表达。[结果]c-myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达水平都显著高于排卵前卵泡，卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比，FSH处理后，小黄卵泡颗粒层厚度增加约25.5%(P<0.05),密度增加约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上，FSH降低了c-myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(star)mRNA的表达水平...     

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养

[目的]建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)体外培养模型.[方法]从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rpGM-SCF)和重组猪的白细胞介素4(rpIL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力.[结果]经体外诱导的DC具有典型的树突状形态;LPS刺激的DC表型分子CDla、CD80、CD86、SLAⅡ、CD172a与LPS未刺激的DC有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力有所增强.[结论]该试验成功建立了猪MoDC的体外诱导培养方法,为进一步研究猪MoDC在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础.     

猪卵泡液和促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究猪卵泡液(pFF)的浓度和促性腺激素(FSH和LH)处理时间对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响.结果表明,在猪卵丘细胞-卵母细胞复合体体外成熟培养46～48 h中的后23～24 h去除促性腺激素可有利于卵丘细胞的扩散,但对卵细胞的核成熟无显著影响(P>0.05);添加适量(10%)的pFF对猪卵母细胞体外成熟有一定的促进作用,但添加浓度太高则相对抑制卵子核成熟进程.     

影响猪卵母细胞体外成熟的若干因素

介绍了以屠宰场废弃的猪卵巢为材料,通过系统技术途径得到猪早期胚胎的基本方法。重点探讨了不同发育阶段、不同培养系统、不同添加成分培养液以及不同培养时间等因素对猪卵母细胞体外成熟的影响,并对其体外受精卵裂能力进行了比较与评价。结果表明,采用mTCM199作为体外成熟基础培养液,并添加直径5~8 mm卵泡的卵泡液(pFF)和雌二醇(E2),直径为2~8 mm的卵巢卵泡COCs经体外成熟培养40 h,可得到较高的成熟率(66.7%)和体外受精卵裂率(29.2%)。本研究初步建立了猪2-细胞~4-细胞早期胚胎的体外批量生产技术,可望进一步改进和完善后应用于养猪业科研与生产实践。     

WNT6基因对蛋鸡卵泡颗粒细胞的影响及机制研究

[目的]本文旨在研究WNT6基因在蛋鸡卵泡发育过程中的生物学功能及其作用机制。[方法]以300日龄海兰蛋鸡为研究对象，检测WNT6 mRNA在不同组织中表达特征。对体外培养的鸡卵泡颗粒细胞进行敲减和过表达WNT6基因后，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，ELISA检测细胞培养基中的孕酮(P4)含量，荧光定量PCR检测卵泡刺激素受体(FSHR)和StAR、CYP11A1等基因表达水平。设立卵泡刺激素(FSH)浓度梯度处理体外培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞，研究FSH对WNT6及WNT通路相关基因表达水平的影响。[结果]WNT6 mRNA在蛋鸡卵泡颗粒细胞内特异表达，在处于卵泡选择关键时期的小黄卵泡颗粒细胞内具有最高表达水平；与对照组相比，过表达WNT6极显著促进颗粒细胞增殖(P<0.01),极显著提高颗粒细胞P4合成量(P<0.01),并显著提高FSHR、CYP11A1、StAR、CYP19A1和HSD3B1基因表达水平(P<0.05);相反，敲减WNT6后颗粒细胞增殖被抑制(P<0.01),P4合成量极显著显著减少(P<0.01),并显著降低FSHR、CYP11A1...     

Roscovitine同期化供核细胞对猴—猪异种核移植胚胎发育的影响

[目的]探讨Roscovitine同期化供核细胞对食蟹猴—猪异种体细胞核移植胚胎体外发育的影响,为提高灵长类的核移植效率奠定基础.[方法]活体采集4岁雄性食蟹猴的耳组织,经组织块培养获得纯化的食蟹猴耳成纤维细胞,细胞经固定、染色后用流式细胞仪分析细胞周期分布.以不同同期化方法处理的食蟹猴耳纤维细胞为供体细胞,以体外成熟、去核的猪卵母细胞为受体细胞,利用电融合法构建食蟹猴—猪异种核移植胚胎,观察异种核移植重构胚胎的体外发育情况.[结果]以15 μmol/L Roscovitine处理食蟹猴耳成纤维细胞24、48、72 h获得的G0/G1期细胞比率分别为76.51％、89.69％和90.49％,其中处理48和72h的G0/G1期细胞比率显著高于对照组（P＜0.05）.血清饥饿、接触抑制72 h同期化获得的G0/G1期细胞比率分别为91.12％和90.46％.Roscovitine同期化处理食蟹猴耳成纤维细胞48 h可有效提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率（15.05％）,显著高于血清饥饿同期化处理和接触抑制同期化处理的效果（P＜0.05）.[结论]Roscovitine可有效同期化食蟹猴耳成纤维细胞在G0/G1期,最终提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率.     

桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型抗病毒效果初探

[目的]通过对某猪场采集的组织样本进行猪圆环病毒2型分离鉴定及培养,探讨桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型抗病毒效果.[方法]将从某猪场采集的疑似猪圆环病毒2型阳性病料经无菌处理后接种于猪肾细胞进行病毒的分离培养,PCR方法鉴定,细胞体外培养分离株病毒并分析其生长特性,然后通过桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液处理病毒侵染的细胞,荧光定量PCR方法测定细胞内病毒载量.[结果]分离培养出猪圆环病毒2型分离株BY-F6代与GenBank中已收录的猪圆环病毒2型ORF2序列同源性可达到99.47％～99.60％;该病毒可在猪肾细胞中进行体外培养,48 h为病毒的复制高峰期,TCID50为10-4,3/0.1mL.6.25 mg/mL的桂枝复方水煎液体外对猪圆环病毒2型具有显著的预防作用(P＜0.05)及极显著的治疗作用(P＜0.01),3.13 mg/mL的桂枝复方水煎液可显著降低细胞内猪圆环病毒2型的复制(P＜0.05),桂枝复方水煎液不具有体外直接杀灭猪圆环病毒2型的能力.5.00 mg/mL的大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型具有显著的预防作用(P＜0.05)及极显著的杀灭作用(P＜0.01),2.50 mg/mL的大黄复方水煎液可直接参与杀灭猪圆环病毒2型,显著降低细胞内该病毒的载量(P＜0.05),大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型感染后的治疗作用不佳.[结论]桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对从某猪场分离及鉴定的猪圆环病毒2型具有一定的抑制作用.     

甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及增殖的影响

[目的]本试验旨在探究甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及增殖的影响。[方法]首先采用免疫组化法鉴定甲状腺素受体(TRα/β)在猪卵巢组织的表达情况,随后体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,选取低(10-8mol·L~(-1))、中(10-7mol·L~(-1))、高(10-6mol·L~(-1))3种浓度的甲状腺素(T4)孵育24 h,采用酶联免疫法检测细胞培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,并采用蛋白印迹法检测颗粒细胞内激素合成相关酶蛋白(3β-HSD、CYP19)的表达情况。采用MTT法检测各浓度甲状腺素对细胞活力的影响,利用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光染色验证不同浓度甲状腺素对颗粒细胞增殖的影响。[结果]免疫组化结果显示:TRα/β在猪卵巢不同发育阶段卵泡的颗粒细胞、膜细胞中有广泛表达,在卵母细胞的胞质中也有分布,在闭锁卵泡中也见明显表达。猪卵巢原代颗粒细胞经甲状腺素处理后,细胞培养液中的孕酮和雌激素水平都显著低于空白对照组(P0.05),并且各剂量处理组间孕酮呈现出剂量依赖性降低趋势;雌激素在低浓度和高浓度甲状腺素处理组较中浓度处理组高。蛋白免疫印迹结果显示:与对照组相比,3β-HSD和CYP19蛋白在较高浓度甲状腺素(10-7和10-6mol·L~(-1))处理组的表达量均显著降低(P0.05);而在低浓度甲状腺素(10-8mol·L~(-1))处理组,CYP19蛋白表达量显著降低(P0.05),但3β-HSD蛋白表达无显著差异。此外,MTT细胞毒性和增殖试剂盒检测结果显示:不同浓度甲状腺素处理并不影响细胞活力,这与PCNA免疫荧光强度统计结果一致,进一步证实了甲状腺素对原代颗粒细胞增殖没有影响。[结论]甲状腺素能够作用于卵巢颗粒细胞,干扰类固醇激素的合成,其作用机制可能是通过改变激素合成相关蛋白3β-HSD和CYP19的表达来完成的。而甲状腺素对颗粒细胞激素合成的干扰效应并不影响细胞增殖状态。     

猪圆环病毒2型体外诱导RAW264.7细胞氧化应激模型的建立

[目的]探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染量、感染时间与被感染RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性,为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据.[方法]PCV2原液调至5×106/mL,经10、102、103和104倍稀释(10-1、10-2、10-3和10-4释度)后,感染作用RAW264.7细胞2h,弃病毒液,加入含5% FBS的DMEM培养液继续培养,分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞,测定一氧化氮(NO)、活性氧自由基(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)等指标.[结果]10-1PCV2感染RAW264.7细胞后能有效升高细胞NO、ROS水平,降低细胞GSH水平和GSH/GSSG,升高细胞XOD、MPO和iNOS活性,表明以10-1pcv2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态,诱导细胞产生氧化应激.[结论]PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激,并确立10-1 PCV2(5× 105/mL)体外感染RAW264.7细胞4~24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件.     

山豆根多糖对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子的影响

[目的]探讨山豆根多糖(SSP)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子水平的影响,为研发出治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型兽药提供参考依据.[方法]以50、100、200和400 μg/mL SSP作用于PRRSV体外感染8h的RAW264.7细胞,通过MTT法评价SSP对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率,ELISA检测SSP对PRRSV体外感染RAW264.7细胞培养上清液中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1.[结果]PRRSV感染RAW264.7细胞8h极显著降低了细胞存活率(P<0.01,下同),而200~400 μg/mL SSP能极显著升高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率.PRRSV感染RAW264.7细胞8h可极显著升高细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平,而SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌上述炎性因子水平,其中以200~400μg/mL SSP的抑制效果最佳.[结论]SSP通过提高炎症细胞存活率及抑制其分泌炎性因子水平,从而有效干预PRRSV感染免疫细胞的炎性反应.     

胰岛素对初情期前母猪垂体细胞促性腺激素释放及生长激素分泌的影响

[目的]探讨胰岛素对猪垂体前叶细胞无血清单层培养细胞分泌促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、生长激素(CH)的影响。[方法]24头140日龄、体重17 kg的母猪被分成高、中、低3个能量组,利用无血清单层培养垂体模型,并用放射免疫法测定细胞液促卵泡素、促黄体素和生长激素浓度。[结果]在不同能量水平上,胰岛素对单层无血清培养垂体细胞FSH、LH及GH释放能力的影响有显著差异(P<0.05),高能组较高,低能组较低。[结论]首次研究了在初情期前母猪体外培养垂体细胞中添加胰岛素对垂体细胞分泌激素的影响,证实代谢激素在初情期前母猪下丘脑-垂体-卵巢水平上调节生殖机能。     

猪圆环病毒2型感染猪肠上皮细胞对CD4+T细胞分化关键分子mRNA的影响

[目的]探讨猪圆环病毒2型感染的猪肠上皮细胞对CD4+T细胞分化关键分子mRNA的影响.[方法]利用免疫磁珠法分离猪外周血CD4+T细胞,与猪圆环病毒2型感染48 h的猪肠上皮细胞共培养,收集共培养后72 h的T细胞,荧光定量PCR检测CD4+T细胞分化关键分子变化.[结果]荧光定量PCR检测显示,细胞因子 IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β1 与转录因子 T-bet、GATA3、RORγt、Foxp3的 mRNA 水平均被显著下调,而IL-10的mRNA水平被显著上调.[结论]感染猪圆环病毒2型猪肠上皮细胞抑制CD4+T细胞分化关键分子mRNA水平,提示CD4+T细胞向Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、调节性T细胞分化被抑制,而IL-10的上调激活CD4+T细胞向高分泌IL-10的CD4+T细胞分化.     

鸡传染性支气管炎病毒介导的细胞内受体及抗病毒基因的表达

[目的]研究传染性支气管炎病毒对细胞模式识别受体(PRRS)及天然抗病毒基因转录的激活作用.[方法]IBV M41毒株感染DF-1细胞,应用荧光定量PCR测定细胞内受体(MDA5、LGP2、MAVS和NLRC5)和抗病毒相关基因(IRF7,IFN-a/β,NF-κB1)在禽传染性支气管炎感染过程中不同时间点的转录水平表达变化.[结果]在感染的细胞中几种细胞内受体在感染不同时间点均有不同程度的升高.IFN-α、IRF7和NF-κB1的表达在感染后显著升高,而IFN-β在感染36 h内被抑制,48 h被激活.[结论]鸡传染性支气管炎病毒体外感染DF-1细胞后能显著激活细胞内受体及抗病毒基因的表达.     

对猪小腔卵泡孤雌激活胚胎发育力的初步探索

为探讨直径为2 mm以下和2～6 mm猪卵泡卵母细胞的体外培养分裂率与囊胚率差异,采用相同体外成熟培养条件,来培养从不同直径的2种卵泡中所抽出的卵母细胞,在卵母细胞成熟培养后44～48 h,对卵母细胞进行化学激活和体外培养,观察胚胎体外发育能力;在培养48 h时进行分裂数据统计,培养168 h时统计囊胚个数。结果发现,2 mm以下猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率差异显著,分别为62.46%、81.76%(P0.05);2 mm以下猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率差异不显著,分别为11.71%、15.30%。说明正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞在体外成熟后,孤雌激活胚分裂率依次降低,孤雌胚胎的分裂能力随卵泡直径的增大而增强;正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞体外成熟后,孤雌激活胚囊胚率随卵泡直径的增大有一定增高,但变化不显著。     

LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的建立

[目的]采用脂多糖(LPS)作为刺激源,建立奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)氧化损伤模型.[方法]体外培养BEEC并进行细胞鉴定,用不同浓度的LPS刺激细胞,在不同时间点用CCK-8法测定细胞存活率,以确定BEEC氧化损伤模型条件.倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测细胞中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT).[结果]与空白对照组相比,当LPS浓度为80μg/mL,作用时间为12 h时,造成细胞损伤,其细胞凋亡率、ROS产生量和MDA含量明显高于对照组,SOD和CAT活性显著低于对照组.[结论]建立奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的条件为LPS作用浓度80 μg/mL,作用时间12 h.     

光周期对棉花愈伤组织发生及体胚发生相关基因表达的影响

[目的]研究光周期对棉花愈伤组织发生及体胚发生相关基因表达的影响.[方法]利用石蜡切片对不同培养时期下胚轴细胞形态进行观察;RT-PCR技术对体胚发生相关基因表达量进行分析.[结果]石蜡切片观察发现,光处理后继代培养3d的下胚轴在b处理(暗处理3d后光处理3d)下形成层细胞增殖较快;继代培养7d时,新陆早33号、45号、50号和珂字棉312号在皮层部位都观察到次生分生细胞团的出现;其中,新陆早45号在b处理和c处理(暗处理12 h后光处理12 h,培养6d)下以及珂字棉312在四个光周期处理下形成层部位也观测到明显的次生分生细胞团.实时荧光定量PCR表明,光周期b处理下的下胚轴材料GhLEC1、GhSERK1基因相对表达量较高.[结论]光周期b处理更有利于愈伤组织发生,并且该处理下体胚发生相关基因的表达量相对最高.     

大蒜素对猪卵巢卵泡颗粒细胞凋亡的影响

为了探究大蒜素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及H_2O_2引起的颗粒细胞凋亡的影响,采用免疫组化法鉴定凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3在成年母猪卵巢组织中的表达情况,体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,采用放射免疫(RIA)方法检测培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,采用MTT法检测大蒜素对细胞增殖活性的影响,进一步检测卵巢颗粒细胞的凋亡情况。免疫组化结果显示,Cleaved Caspase3在猪卵巢不同发育阶段卵泡的颗粒细胞、膜细胞中有广泛表达,在卵母细胞的胞质中也有分布,在闭锁卵泡中也见明显表达。猪卵巢原代颗粒细胞经大蒜素处理后,细胞培养液中的孕酮含量显著低于H_2O_2处理组,而雌激素水平显著高于H_2O_2处理组,与对照组无明显差异。此外,免疫荧光结果显示,与H_2O_2处理组相比,大蒜素处理组减少了颗粒细胞的凋亡,进一步证实了大蒜素对H_2O_2引起的颗粒细胞凋亡具有缓解作用;进一步应用MTT细胞毒性和增殖试剂盒进行检测,结果显示,与H_2O_2处理组相比,大蒜素处理显著提高了细胞增殖活性。结果表明,大蒜素能够作用于卵巢颗粒细胞,缓解H_2O_2造成的氧化应激,本结果为畜牧生产中进一步应用大蒜素提供参考依据。     

抑制猪支持细胞外泌体对精原干细胞自我更新及分化的影响

[目的]本文利用体外模型检测猪支持细胞分泌外泌体的能力及其对猪精原干细胞(porcine spermatogonial stem cells, pSSC)自我更新及分化状态的影响。[方法]通过两步酶消化法分离猪支持细胞和pSSC并建立猪支持细胞-pSSC体外共培养模型，抑制猪支持细胞外泌体的分泌，检测pSSC自我更新及分化指标，研究支持细胞外泌体对pSSC命运的影响。[结果]分离得到的支持细胞的Wilm肿瘤蛋白1(WT1)阳性率为(87.1±0.02)%,整合素β-1蛋白(ITGB1)阳性率为(94.2±0.01)%,分离得到pSSC的早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)阳性率为(80.6±0.02)%;通过Western blot分析、免疫荧光检测证实支持细胞外泌体的存在；证实20μmol·L^-1 GW4869可以抑制外泌体分泌且不损害支持细胞；GW4869处理后的支持细胞与pSSC共培养发现试验组较对照组pSSC状态差异较为明显，且RT-PCR结果显示猪精原干细胞PLZF基因表达水平显著升高；肥大/干细胞生长因子受体基因(KIT)、胸腺细胞抗原1基因(THY1...     

猪卵泡液与猪卵母细胞体外成熟与凋亡的关系

本研究就猪卵泡液对猪卵母细胞的体外成熟及凋亡进行了探索试验一证明,体外培养46-48h,成熟液添加5%猪卵泡液能促进成熟,核成熟率为41.2%,成熟液添加20%猪卵泡液则抑制成熟,核成熟率为23.1%,二者差异显著;试验二证明,添加猪卵泡液可以促进猪卵母细胞体外存活时间的延长,体外培养第16天,含0%、5%、10猪卵泡液的存活率分别为2.6%、22.2%、18.6%,添加与否差异显著.     

延边奶山羊羔羊超数排卵及体外成熟的研究

[目的]对延边奶山羊羔羊超数排卵及体外成熟进行研究.[方法]以延边奶山羊为试验对象,研究不同超排方案对羔羊卵泡发育的影响,比较了羔羊超排处理后与成年母羊卵巢内的卵母细胞体外成熟的差异.[结果]延边奶山羊的最佳超排方案为CIDR＋PMSG 800 IU注射1次＋FSH（加拿大）20 IU/次,间隔12 h注射6次;宁波产FSH超排效果不稳定,卵泡回收率低.成年母羊卵母细胞的体外成熟率显著高于母羔羊超排卵母细胞.[结论]该研究为建立延边奶山羊JIVET技术体系提供依据.