我国木薯花叶病毒病的发生危害及其病原鉴定

为明确国内木薯花叶病毒病（cassava mosaic virus disease）的危害情况、田间症状及其病原类型,本研究于2018—2019年调查了该病在国内的分布情况、症状特征及种质来源等数据,采集了8省（区）19地的384份样品,利用特异性引物检测2种木薯花叶病毒侵染引起的症状类型,并通过序列比对明确其病原特点。结果表明：木薯花叶病毒病已经在我国发生,种茎调运是该病远距离传播的主要原因;国内木薯花叶病毒病病原有斯里兰卡木薯花叶病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus, SLCMV）和木薯普通花叶病毒（Cassava common mosaic virus, CsCMV）2种病毒,可分为单独感染、复合感染,其中SLCMV的检出率为21.1%,CsCMV的检出率为36.5%,SLCMV-CsCMV复合侵染率为15.1%;检测到的SLVMV与东南亚SLCMV序列同源性为99.4%~99.7%,检测到的CsCMV与拉丁美洲的CsCMV序列相似性为91%~96%。推测国内木薯花叶病毒病主要由2种病毒侵染引起,且普通花叶病毒有产生序列变异的可能性。     

致病性不同的大豆花叶病毒分离物外壳蛋白的基因序列分析

鉴定了致病性差异明显的6个大豆花叶病毒分离物，对这些分离物外壳蛋白（CP）基因进行了测序。6个分离物CP基因全长均为795bp，推测的CP全长均为265个氨基酸残基。序列同源性比较表明，症状反应相同的各SMV分离物间，CP基因核苷酸和推测的氨基酸序列同源性分别为98.2%～99.6%、99.6%～100.0%；而症状反应不同的分离物间，CP基因核苷酸和推测的氨基酸序列同源性分别为90.4%～96.7%和97.7%～99.6%。结果显示，致病范围相近的分离物，序列同源性较高。     

番茄斑驳花叶病毒海南分离物全基因组序列分析

本研究采用小RNA深度测序及RT-PCR检测技术鉴定海南省陵水县冬种番茄(圣女果)病株受到烟草花叶病毒属的番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)侵染。通过机械摩擦接种,将该病原病毒保存于本生烟植株上,命名为番茄斑驳花叶病毒海南分离物(ToMMV-HN)。采用RT-PCR分段扩增获得了该病毒分离物的全基因组序列。测序结果表明,该病毒分离物基因组全长6399 nt,含有4个开放阅读框,编码4种蛋白,与已报道的ToMMV9个分离物核苷酸和编码产物氨基酸序列相似性分别为98.0%～100%和99.2%～100%;与同属的番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、番茄棕色皱果病毒(Tomato brown rugose fruit virus,TBRFV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)代表分离物核苷酸序列相似性分别为84.7%、80.7%和79.0%。系统进化分析结果表明,ToMMV-HN与该病毒中国西藏和云南辣椒分离物亲缘关系最近,与美国加州和南卡州番茄分离物次之,与西班牙和巴西番茄分离物亲缘关系相对较远。本研究为我国番茄病毒病诊断和防控,尤其是抗病品种选育提供了基础资料。     

大豆花叶病毒5个分离物的鉴定及外壳蛋白序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其外壳蛋白(CP)基因片段并进行测序,结果表明:5个分离物CP基因全长均为795个核苷酸,编码产生265个氨基酸.同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为91.1%～97.1%,由此推导的氨基酸序列同源性为98.1%～99.2%.结合5个分离物在8个大豆品种上的致病性反应得出,5个分离物在8个鉴别寄主上的致病性反应和序列差异的比较表明,分离物在8个鉴别寄主上致病性反应相差越大,其CP基因氨基酸序列差异就越大,由此证实SMV的CP基因与致病性反应之间有一定的联系.     

中国大豆花叶病毒HC-Pro基因的克隆与序列分析

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆了我国6个大豆花叶病毒(SMV)分离物的HC-Pro基因全长cDNA,并测定了其全序列,探索其与病毒致病性和交叉保护作用的关系.结果表明:HC-Pro基因全长为1371nt,编码的HC-Pro蛋白为457个氨基酸,其中包含与病毒移动有关的CCC基序、与蚜传相关的PTK基序等功能结构域.6个SMV分离物的HC-Pro基因核苷酸序列同源性为89.2%～99.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为95.4%～99.8%,其中SMV分离物TS216和4434仅有1个碱基差异.将序列信息与6个SMV分离物在10个鉴别寄主上的症状反应以及分离物间的交叉保护作用进行综合分析发现, HC-Pro基因同源性高的SMV分离物在鉴别寄主上的致病性反应没有明显的相似性,而HC-Pro基因同源性高、亲缘关系近的部分SMV分离物之间交叉保护作用明显.结果证明6个SMV分离物的HC-Pro基因高度同源,同源性高低与其在鉴别寄主上的致病性反应没有明显联系,但同源性高、亲缘关系近的分离物间交叉保护作用可能较强.     

大豆花叶病毒致病基因的克隆与序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其CP、HC-Pro、P1和P3基因片段并进行测序。结果表明:5个分离物P1基因全长均为927个核苷酸,编码产生309个氨基酸。同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为88.0%~99.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为86.1%~100.0%。此外,5个分离物4个SMV基因CP、HC-Pro、P1和P3长度均为4 137个核苷酸,编码1 378个氨基酸。分析结果显示,5个分离物之间的核苷酸及氨基酸的同源性分别为92.6%~99.3%和95.1%~99.2%。根据系统进化树的分析,结合5个分离物在10个大豆鉴别寄主上的致病性反应,发现SMV的4个基因CP、HC-Pro、P1和P3与SMV的致病力及病样的来源地之间具有一定的关系。同时,这4个SMV基因能够将传统的SMV株系分离物与重组性分离物进行区分。     

海南黄灯笼辣椒顶死病病原病毒的分离鉴定

从海南省黄灯笼辣椒顶死病株上分离纯化得到一个病毒分离物.研究结果表明,该病毒分离物能通过汁液磨擦接种侵染供试植物中的4科11种植物,可由桃蚜传播;提纯病毒粒子呈球形,直径28～30 nm,外壳蛋白分子量约为28 ku;分离物与CMV抗血清在ELISA测定中呈阳性反应;提取病毒分离物RNA,应用RT-PCR方法克隆了病毒外壳蛋白（CP）基因.CP基因675 bp,编码218个氨基酸.对CP基因序列分析表明,该病毒分离物的CP基因核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ分离物的同源性均在92.1%以上,所推导的氨基酸序列同源性在96.3%以上,而与亚组Ⅱ分离物的核苷酸序列同源性均低于77.3%,所推导的氨基酸序列同源性均低于80.7%.据此将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒,归属于亚组Ⅰ.     

侵染玉米的甘蔗花叶病毒HC-Pro基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法从郑州地区感染甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)的玉米叶片中克隆病毒编码的辅助成分-蛋白酶基因(Helper component proteinase,HC-Pro),基因大小1380bp,编码460个氨基酸。序列比对和系统进化树分析表明,HC-Pro编码的氨基酸序列与北京、山东、河南、陕西、浙江、广东、西班牙、保加利亚和墨西哥等地的SCMV分离物中的氨基酸序列相似性在82%～92%,表明分离的SCMV可能是一个新的病毒分离物。利用半定量RT-PCR分析了HC-Pro在接种SCMV玉米自交系后的表达和积累的动态变化,结果表明,接种7d后,HC-Pro在心叶中积累到相当高的程度,9d后达到高峰,说明HC-Pro可能参与了SCMV在玉米植株中的系统侵染过程。     

侵染福建省甘蔗的高梁花叶病毒全长基因的分析

从福建农林大学甘蔗综合研究所培育的甘蔗品种福农95-1702中,采集表现花叶症状的甘蔗病叶,根据NCBI上已登录的甘蔗花叶病毒全长基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术进行全长基因克隆。结果表明,病毒分离物FJ10为高梁花叶病毒,全长不包括poly(A),有9 375 bp。整个基因只有一个开放读码框,编码成由3 071个氨基酸组成的多聚蛋白,FJ10含有一些与其它马铃薯Y病毒属病毒共有的氨基酸序列。序列分析结果表明,FJ10分离物与美国的分离物SrMV-H同源性最高,核苷酸序列同源性达91.2%,编码的多聚蛋白氨基酸序列同源性达96%,与来自中国浙江的甘蔗分离物核苷酸序列同源性为82%,氨基酸序列的同源性达89.6%。     

利用小RNA深度测序技术鉴定海南南瓜病毒种类

2016年在海南乐东、昌江、澄迈、海口、文昌、儋州等地采集疑似被病毒病感染的南瓜叶片样品6个,将样品合并,采用小RNA深度测序技术对上述混合样本的病毒种类进行鉴定,发现样本中含有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒(Papara ringspot virus,PRSV)、黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和中国南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl China virus,SLCCNV),通过PCR方法进一步验证了深度测序结果的准确性。SLCCNV在4个样品中存在,P-CJ分离物的DNA-A和DNA-B组分全长分别为2 735 bp(登录号为MF062251)和2 722 bp(登录号为MF062252)。DNA-A和DNA-B组分均与SLCCNV分离物的同源性最高,同源性分别为89.2%~99.3%和79.1%~98.8%;P-CJ分离物与从中国植物样品中分离到的SLCCNV聚在同一进化分支上。上述研究结果表明,P-CJ是SLCCNV的一个分离物。     

海南番木瓜环斑病毒全长cDNA克隆及其侵染性克隆构建

为了从分子水平上解析番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）的致病机理,寻找广谱、有效的抗病毒新策略,培育具有应用前景的抗病新品种,利用RT-PCR和快速cDNA末端扩增技术（RACE）对引起番木瓜环斑病毒病的PRSV海南海口分离物（PRSV-HN2）的基因组cDNA进行了全序列测定。PRSV-HN2全长cDNA包含10 326 nt（不包括3′端的polyA,GenBank登录号为KF791028）,能编码3 346个氨基酸。对PRSV-HN2基因组核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行了结构和功能分析,结果表明,其与其它23个PRSV分离物的核酸序列相似度达81％~91％,氨基酸相似度为88％~94％。利用酵母同源重组系统成功构建其侵染性克隆载体并通过农杆菌转化与侵染,最终获得其侵染性克隆。这为在分子水平上研究PRSV遗传变异、侵染及致病机理奠定理论基础。     

木薯细菌性枯萎病菌hrpG和hrpX基因的克隆和初步分析

根据黄单胞类病原菌hrpG和hrpX基因序列，设计简并引物，通过PCR扩增从我国木薯细菌性枯萎病菌中克隆到这2个基因。结果表明：10个菌株的hrpG基因编码区长度均为792 nt，编码263个氨基酸，相互之间最多有4个碱基和1个氨基酸的差异；而hrpX基因编码区长度均为1 431 nt，编码476个氨基酸，相互之间最多有4个碱基和3个氨基酸的差异。所获hrpG基因序列和辣椒斑点病菌等黄单胞菌同源基因相似性最高，核苷酸序列为95%，氨基酸序列为96%。所获hrpX基因核苷酸序列和辣椒斑点病菌等的相似性最高，为97%，而氨基酸序列和柑橘溃疡病菌等同源基因相似性最高，为99%。这2个基因的聚类分析结果表明，木薯细菌性枯萎病菌和豆褐色黄单胞菌、柑橘溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的亲缘关系最近。     

芝麻黄花叶病病原的分子鉴定

从芝麻黄花叶病株上分离得到花生条纹病毒2个分离物（Peanut stripe virus sesame isolate, PStV-se1和PStV-se2）,提取感病叶片的总RNA,RT-PCR扩增外壳蛋白基因（cp）片段。序列测定结果显示,cp基因含有861个核苷酸,编码分子量为32.4kDa的蛋白。2个株系cp基因与PStV其它株系核苷酸序列同源性为94.4%～99.9%,氨基酸序列同源性为93.7%～100%。株系间CP氨基酸序列系统进化树结果表明,芝麻分离物与中国其它寄主来源的PStV株系处于同一进化分支。     

海南胡椒中黄瓜花叶病毒分离物的分子鉴定

通过间接酶联免疫法,从海南罹病胡椒植株中检测到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV).从病叶中提取总RNA,用巢式RT-PCR方法扩增获得657 bp的CMV CP基因片段,并与pMDl8-T载体连接和转入大肠杆菌克隆,然后进行测序.序列分析结果表明,该分离物与CMV亚组I、亚组II之间的核苷酸序列同源性分别为92.54%～99.09%和76.97%～77.42%,推导氨基酸序列同源性分别为98.17%～100%和81.74%～82.65%.该分离物CP基因与印度胡椒分离物同源性相对较低,应属不同株系.     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10的cDNA克隆及全序列分析

基于RT-PCR策略克隆了水稻黑条矮缩病毒（rice black streaked dwarf virus,RBSDV）浙江分离株基因组S10,并测定了它的全序列。结果表明,水稻黑条矮缩病毒浙江分离物（RBSDV-Zj）基因组片段S10全长1801 nt（EMBL登录号为AJ297433）,仅含有一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码一个63.1 kD的多肽,与日本的水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别为93.8%和96.2%;与意大利玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus,MRDV）的基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为87.7%和92.0%,推测它们是同一病毒的不同地理小种。     

混合感染番木瓜PRSV/PLDMV株系基因组全长cDNA的克隆和实时荧光定量PCR分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)与番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)存在混合感染的现象,近年来混合感染发病率逐年递增,是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。运用RT-PCR和RACE方法从混合感染样品中克隆获得2种病毒基因组全长c DNA,分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM,Gen Bank登录号分别为KT633943和KT633944,基因组序列大小分别为10 325、10 153 nt(不包括3′端的poly A)。序列分析表明:PRSV-LM与单独感染样品中的PRSV海南分离物HN(Gen Bank登录号:EF183499)的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高,为94%;PLDMV-LM与单独感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF(Gen Bank登录号:JX974555)核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别高达99%和97%。进化树分析显示,PRSV-LM和PLDMV-LM分别与单独感染样品的PRSV和PLDMV海南分离物有共同的进化起源。进一步利用实时荧光定量PCR对混合感染样品的PRSV与PLDMV病毒积累量进行分析,结果表明,混合感染样品中PLDMV病毒积累量大约是PRSV含量的100倍。研究结果为进一步探究PRSV/PLDMV混合感染发病机制奠定基础。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

河北省藁城花生病毒病的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

采用RT-PCR技术对采自河北省农林科学研究院粮油作物研究所藁城堤上试验基地的12份花生叶片样品进行花生病毒病的检测,结果表明:从表现花叶和矮化症状的10份样品中检测到花生条纹病毒(peanut stripe virus,PStV),检出率高达90%,未检测到花生矮化病毒和黄瓜花叶病毒;对其中2个PStV分离物cp基因序列分析的结果表明,该cp全长864 bp。这两个分离物与已报道的PStV其他株系的cp核苷酸序列相似性分别为94.4%~99.2%和94.7%~99.7%,氨基酸相似性分别为95.5%~99.7%和95.8%~100.0%。PStV cp核苷酸序列构建的系统进化树中,这两个分离物与中国大陆其它分离物及美国分离物亲缘关系较近,而与中国台湾、泰国和越南分离物亲缘关系较远。     

花生青枯菌红安分离物的鉴定

从湖北红安发病花生根部分离到一个细菌分离物2C1,对该分离物进行了TZC显色反应,致病力的测定,16s rRNA、23s rRNA和鞭毛蛋白基因filc的PCR扩增,16s rRNA PCR扩增产物的序列分析。结果显示,分离物2C1在TZC培养基上表现出青枯菌的典型菌落形态,对花生具有强致病性,PCR扩增获得与预期大小的产物片段; 16s rRNA核苷酸序列具有与其它青枯菌分离物99%左右的一致性。上述结果表明：2C1是具有强致病力的花生青枯菌分离物。     

大豆rbcL基因克隆、序列分析及原核表达

利用叶绿体基因组保守性的特征,根据菜豆、豌豆、烟草的rbcL基因序列设计引物,从大豆叶绿体DNA中克隆rbcL基因,全长序列为1488bp,包括1449bp的开放阅读框,编码482个氨基酸。相似性比较显示,此序列与其它10个物种rbcL基因核苷酸的同源性为85.37%～95.31%,氨基酸的同源性为90.87%～96.47%。将该基因与表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌Rosseta感受态细胞,PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,阳性菌液IPTG诱导后经10%SDS-PAGE分析,结果显示：诱导表达出分子量约为60kD的特异融合蛋白。