两种致病性弧菌外膜蛋白抗原特性的分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和苯甲基磺酰氟(PMSF)两种方法提取两种海洋致病性弧菌——鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri和秦皇岛弧菌Vibrio qinhuangdaorasp.nov.的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE分析了其外膜蛋白的构成。电泳图谱显示,相对分子质量为44 000、36 000、34 000、26 000、23 000的蛋白条带为两种弧菌外膜蛋白中的共有条带。采用Western-Blotting法比较了两种弧菌外膜蛋白抗原性的异同,结果表明,鱼肠道弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、43 000、34 000、32 000、28 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应;秦皇岛弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应。两种弧菌中均存在相对分子质量为46 000、26 000的外膜蛋白,且具有共同的抗原性。     

两种致病性弧菌外膜蛋白抗原特性的分析

采用十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl）和苯甲基磺酰氟（PMSF）两种方法提取两种海洋致病性弧菌——鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri和秦皇岛弧菌Vibrio qinhuangdaorasp.nov.的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE分析了其外膜蛋白的构成。电泳图谱显示,相对分子质量为44 000、36 000、34 000、26 000、23 000的蛋白条带为两种弧菌外膜蛋白中的共有条带。采用Western-Blotting法比较了两种弧菌外膜蛋白抗原性的异同,结果表明,鱼肠道弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、43 000、34 000、32 000、28 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应;秦皇岛弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应。两种弧菌中均存在相对分子质量为46 000、26 000的外膜蛋白,且具有共同的抗原性。     

枯草芽胞杆菌Bs-916的全基因组分析

 【目的】对枯草芽胞杆菌Bs-916进行全基因组测序,为今后更好挖掘和利用该菌生防潜力提供较多的分子生物学信息。【方法】通过应用比较基因组学软件与另一测序菌株Bs168进行全基因组序列分析。【结果】Bs-916菌株全基因组大小为3 925 958 bp,GC含量为46.4%,与其它已测序全基因组芽孢杆菌相比,其GC含量最高;预测所得CDS数为4 056个,152个串联重复区域,转座子103个,IS（插入序列）序列数量37个, tRNA 46个,rRNA 39个;比较基因组学分析其含有8个NRPS/PKS基因簇,其中bacillomycin L,macrolactin,difficidin这3个基因簇在比较菌株Bs168中不存在;该菌还含有植酸酶基因、comAPQX及sfp等与生防因子相关的基因。【结论】Bs-916菌株全基因组含有多种抗菌物质编码基因簇,是一类具有极大生防潜力的典型根际革兰氏阳性菌株。该菌株全基因组序列的测定及其遗传操作方法的可行性,有利于其次生代谢产物的开发和利用。次生代谢产物具有潜在的应用价值,有望在未来开发成独特的农业生物工程制剂。     

40株新城疫病毒全基因组的比较研究

利用作者单位测得的和从GenBank检索得到的40株新城疫病毒(NDV)全基因组序列,采用SMS、DNAStar等生物信息分析软件,比较分析NDV全基因组的基本特征和分子进化规律.结果表明: 40株NDV全基因组核酸序列长度有3种:15186、15192、15198 nt,均符合6倍数规律;基因组A T含量占53%～54%,C G含量占46%左右;NDV基因组前三分之一(4500 nt前)序列存在高GC含量区,特别是在大约1200～2400 nt区域,GC含量最高达到69%;F基因片段构建的分子进化树显示,40株NDV划分为两大类(ClassⅠ,ClassⅡ),基因组长度为15198 nt的毒株属于ClassⅠ,其余的属于ClassⅡ;ClassⅡ毒株又分为基因Ⅰ～Ⅶ型,这些已测序的毒株中没有基因Ⅷ和Ⅸ型;病毒6个基因CDS序列构建的进化树显示,各基因进化基本保持一致,仅少数毒株存在差异,可能与病毒分子的基因重组有关.     

一株虾夷扇贝病原——科氏希瓦氏菌的分离鉴定及其致病性

为探究近年来养殖虾夷扇贝Patinopecten yessoensis脓疱病的发病原因,取病灶部位涂布培养,挑取优势单菌落,进行分离纯化、生理生化试验、药敏试验、溶血试验、人工感染试验和组织病理检验等研究。结果表明：从扇贝病灶部位中共分离获得12株优势菌株(YD-1～YD-12),经16S rDNA基因序列比对发现,12株优势菌株与科氏希瓦氏菌Shewanella colwelliana一致性均较高,选取序列一致性最高(99.86%)的分离菌株YD-1进行细菌培养和透射电镜观察发现,该菌株于培养基中呈圆润光滑的乳黄色菌落(直径1.0～1.5 mm),为具有端生鞭毛的杆状菌;菌株YD-1革兰氏染色为阴性;综合生理生化试验和分子生物学试验结果,鉴定分离菌株YD-1为科氏希瓦氏菌;药物敏感性试验显示,菌株YD-1对头孢噻肟、头孢哌酮、氯霉素和阿奇霉素等药物高度敏感;菌株YD-1于28、37℃时出现α溶血性;人工感染试验显示,菌株YD-1对虾夷扇贝具有较高致病性,半数致死浓度(LD₅₀)为2.08×10⁶ CFU/mL;人工感染的扇贝主要表现为外套膜...     

蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE—Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu^2＋、Mg^2＋、Fe^2＋对该酶有抑制作用,而Ca^2＋对其则有一定程度的激活作用;该酶在50—60℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟（PMSF）可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39 600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu2+、Mg2+、Fe2+对该酶有抑制作用,而Ca2+对其则有一定程度的激活作用;该酶在50⁶0℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20 000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟(PMSF)可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

一株广西鸡源H6亚型禽流感病毒全基因组序列分析及其重要生物学特性

2017年对广西地区活禽交易市场进行低致病性禽流感流行病学调查,从采集的鸡咽喉和泄殖腔拭子中分离鉴定出一株鸡源H6N6亚型禽流感病毒,命名为A/chicken/Guangxi/286C10/2017(H6N6)。应用RT-PCR方法分别对分离毒株的8个基因片段进行扩增,同时将产物进行克隆和测序,然后对测序结果进行同源性比对及遗传进化分析。另外,还通过固相受体结合试验对毒株的唾液酸受体进行测定。结果显示,该分离株的HA基因与广东分离株A/chicken/Guangdong/G3249/2014(H6)的核苷酸同源性最高,裂解位点符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因与江西分离株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016(H6N6)核苷酸同源性最高;内部基因中,PB1和NS基因来源于广东的鸡,PB2基因来源于越南的鸡,PA、NP和M基因来源于广西的鹅;同时,研究还发现该病毒的HA、NA、PA、NP和M基因来源H6亚型AIV,PB2、PB1和NS基因来源H9N2亚型AIV,推测A/chicken/Guangxi/286C10/2017(H6N6)可能是由不同地区、不同宿主来源的H...     

吉林地区高致病性PRRSV JL-04/12株的 分离鉴定与全基因组测序

【目的】确定吉林省某疑似高致病性PRRS猪场的病原,研究其基因特性。【方法】采集疑似感染高致病性PRRSV病猪的脏器组织,处理后接种MARC-145细胞,观察细胞病变,分离PRRSV;应用RT-PCR方法检测和确定分离毒株的基因型,采用间接免疫荧光、电镜观察和全基因组测序检测分离的病毒。【结果】分离毒株为北美洲型PRRSV,命名为JL-04/12,其基因组全长为15 320bp(不包括PolyA),可使MARC-145细胞产生典型的细胞病变。序列比对结果表明:JL-04/12株与经典毒株VR-2332和CH-1a的核苷酸同源性分别为89.5%和94.9%;与高致病性毒株JXA1、HUN4的核苷酸同源性为99.1%。分离毒株JL-04/12编码的2个非结构蛋白和GP2～GP4的氨基酸序列与HUN4株同源性较高,在97.2%～99.3%,而JL-04/12编码的GP5的氨基酸序列与JXA1株同源性较高,为98.5%;JL-04/12编码的GP6和N蛋白的氨基酸序列与高致病性PRRSV毒株JXA1和HUN4的同源性均为100%。PRRSV JL-04/12株的Nsp2不连续缺失30个氨基酸,与高致病性PRRSV毒株JXA1和HUN4的同源性最高,均为97.8%,判定该分离株为变异的高致病性PRRSV。【结论】从吉林省分离到1株高致病性PRRSV,说明高致病性PRRS变异病毒在吉林省仍然存在。     

基于细菌全基因组的大口黑鲈源维氏气单胞菌AV040株致病性与耐药性解析

2021年7月安徽某养殖场的大口黑鲈(Micropterus salmoides)苗在下塘期发生了爆发性死亡。在排除寄生虫和病毒感染后,从患鱼脾脏和肾脏分离到多株细菌,经鉴定,血平板单菌落β-溶血试验和回归感染筛选出一株致病力较强的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)AV040株。AV040全基因组测序(GenBank ID:CP095841)显示,253个编码序列为毒力基因,其中编码的黏附(adherence)分子156个、分泌系统(secretion system)85个、毒素(toxin)12个。腹腔注射AV040株对大口黑鲈(约10 g)和昆明白小鼠(约20 g)的半数致死浓度(median lethal dose, LD₅₀)分别为6.53×10⁶ CFU·g^-1和2.97×10⁷ CFU·g^-1;受染大口黑鲈表现为胸鳍、腹鳍、肛门、肝胰腺、脾脏和幽门垂出血;受染小鼠表现为蜷缩、眯眼和颤抖,肝脏和肠道出血。AV040全基因组中有5个耐药基因,并采用K-B...     

一株新城疫病毒分离株全基因组序列的克隆与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了10对引物,运用RT-PCR方法获取了三黄鸡新城疫病毒(SHJ00株)全基因组序列,并对其进行了比较分析。结果表明:此株三黄鸡新城疫病毒(SHJ00)的全基因组序列由15 192个碱基组成,在NP基因和P基因之间的非翻译区多了6个核苷酸ACACTC;与NDV一致,SHJ00基因由6个ORF组成,即3′-NP-P-M-F-HN-L-5′;测序后拼接的F基因长1 672 bp,包含完整的开放阅读框(1 662 bp),编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特性;根据NDV基因分型标准,三黄鸡新城疫病毒SHJ00株归属基因Ⅶ型新城疫病毒;F基因与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.9%~97.7%,其中与F48E9同源性为84.3%,与Lasota的同源性为82.0%;测序后拼接的HN基因长为1 716 bp,编码571个氨基酸,与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.0%~98.1%,其中与F48E9同源性为84.5%,与Lasota的同源性为81.4%。     

一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其生物学特性与全基因组分析

本研究旨在分离能够高效裂解耐药金黄色葡萄球菌的噬菌体,为噬菌体生物制品的研制提供候选材料。以耐氨苄西林金黄色葡萄球菌为宿主菌,用双层平板法分离噬菌体,通过透射电子显微镜观察噬菌体形态,并对其进行生物学特性分析及全基因组测序分析。结果分离得到一株金黄色葡萄球菌噬菌体,效价达2.75×10¹⁰ PFU/mL,命名为SP688。该噬菌体具有长的不收缩尾巴,属长尾噬菌体科,对7株耐氨苄西林金葡菌均有裂解效果,最佳感染复数为1,可在10 h内抑制细菌生长,在温度-20～54℃范围和pH值3～11之间活性稳定,对紫外线敏感。全基因组分析显示,SP688基因组为环状DNA,全长45 499 kb, GC含量为34.1%;预测到64个开放阅读框(ORFs),其中19个(29.69%)被预测功能。该噬菌体是一株新型裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的广谱噬菌体,可为噬菌体治疗提供材料。     

一株山羊源2型溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】分离鉴定四川某规模化山羊场引起山羊大规模呼吸道疾病和死亡的病原菌,并分析其致病和耐药机制。【方法】将病原分离纯化后,依次进行生化试验、小鼠致病性试验、药敏试验、16S rRNA序列分析及荚膜血清分型,并通过全基因组测序对分离菌株进行物种分型以及基因功能分析。【结果】从病死山羊鼻液、气管、肺脏和肝脏中分离出同一种菌,经鉴定为荚膜血清2型的溶血性曼氏杆菌,命名为MHLB002;对小鼠的LD50值为4.4×107 CFU/mL;药敏试验结果表明:该溶血性曼氏杆菌对头孢类、β-内酰胺类、磺胺类和喹诺酮类药物敏感,对部分大环内酯类和氨基糖苷类药物耐药;全基因组序列分析显示该菌基因组大小为2 580 488 bp,序列类型为ST-43,与MH1475菌株同源性最近,且2菌株基因组ANI值达98.60%;MHLB002菌株全基因组中共有19个ORF编码与致病性相关的基因,9个ORF编码耐药基因。【结论】本试验所分离出的荚膜血清2型溶血性曼氏杆菌,是引起该养殖场山羊大规模呼吸道疾病和死亡的致病菌,同时为预防和治疗山羊溶血性曼氏杆菌病提供理论依据。     

5种饲料组合投喂下克氏原螯虾生长及肌肉品质的比较分析

为探明较佳的克氏原螯虾养殖饲料种类及组合,开展5种饲料组合(A组:颗粒饲料,B组:大豆+玉米,C组:颗粒饲料+大豆+玉米,D组:颗粒饲料+鱼肉,E组:鱼肉)对克氏原螯虾生长及肌肉氨基酸、脂肪酸含量的影响研究.结果表明,A组试验虾平均成活率最高,达82.5％,分别较B组、C组、D组、E组高25.4％、26.9％、57.1...     

一株牦牛源产细菌素植物乳杆菌SWUN5815全基因组测序及序列分析

旨在分析一株牦牛源植物乳杆菌SWUN5815的全基因组序列测序,并对该菌株的功能特性基因进行挖掘.基于PacBio RSII测序平台对乳杆菌SWUN5815进行全基因组测序分析和GO、KEGG、COG和NR数据库进行基因组基本功能注释.结果 表明:1)植物乳杆菌SWUN5815的基因组大小为3.27 Mb,GC含量44...     

高致病性FAdV-4分离株fiber2结构蛋白表达 和细胞内定位的分析

初步鉴定一株高致病性4型禽腺病毒（fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4）并研究其生物学特性。应用PCR、动物实验、免疫印迹技术和激光共聚焦鉴定其致病性和传播途径,分析fiber2蛋白的表达特性及其在细胞内定位。结果显示,所分离的毒株为FAdV-4型强毒株,对鸡的致死率达100%,对鸭无明显致病性;病毒可以经过滴鼻点眼感染而非经过口腔感染;PCR扩增的fiber2基因的大小为1 440 bp,所构建的含fiber2基因的重组真核和原核表达质粒均可正确表达;共聚焦结果显示,fiber2蛋白主要定位于细胞核。结果可为进一步研究安徽省地区高致病性禽腺病毒的感染和疫苗制备提供基础。     

一株猪丹毒丝菌的全基因组测序及SpaA基因分析

本研究测定猪丹毒丝菌临床毒株SG7的全基因组序列,并运用生物信息学方法对测定的全基因组序列及猪丹毒丝菌表面保护性抗原A基因(SpaA)进行分析.SG7菌株的基因组全长为1834291.00 bp,G+C含量为36.3％,基因总数1846个.将SG7菌株与GenBank中8条完整的猪丹毒丝菌全基因组序列进行比较,发现国内...     

一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2010年我国爆发了使蛋鸭产蛋量急剧下降、由一种鸭黄病毒引起的疾病,通过对来自山东某发病鸭场的病料进行分离,得到实验室分离株Du/CH/LSD/110128。对其进行全基因组序列测定分析,确定该株病毒全基因组含有一个开放阅读框,编码一个由3 426个氨基酸组成的多聚蛋白。将试验测得株Du/CH/LSD/110128株与黄热病毒(Yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、伊利乌斯脑炎病毒(Ilheus virus)、西尼罗病毒(West Nilevirus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)和其他一些已公布序列的坦布苏病毒进行核酸同源性比较和遗传进化树分析,发现Du/CH/LSD/110128株与巴格扎病毒亲缘关系较近但介于病毒种的水平上,与其他株坦布苏病毒核酸同源性在87%以上,可以确定Du/CH/LSD/110128株属于新型鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)。     

一株高病毒载量 PCV2 毒株的基因组特征及序列分析

【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2,PCV2）流行毒株的遗传进化情况,丰富 PCV2 分子流行病学数据,为当地 PCV2 疫苗候选株的选用和研发提供参考。【方法】使用 qPCR 方法对疑似 PCV2 的样品进行检测,发现 1 株具有高病毒载量的 PCV2 毒株,命名为 GD222858。通过 PCR 方法进行全基因组分子克隆及遗传进化分析。使用 MegAlign 软件将该毒株 ORF1、ORF2 基因编码的氨基酸序列与 PCV2 同亚型参考毒株进行比对,分析氨基酸序列的相似性;采用 DNAStar 预测该毒株的 Cap 蛋白二级结构及 B 细胞表位,并与 4 株疫苗株 DBN-SX07-2（HM641752）、LG（HM038034）、SH（HM038027）、ZJ（AY686764）的 Cap 蛋白抗原指数进行比对分析。【结果】GD222858 毒株基因组长度为 1 767 bp。遗传进化分析表明该毒株属于 PCV2d 亚型。与国内外 82 株参考毒株的核苷酸相似性为 91.4%~99.6%,与越南毒株 Han8（GenBank 登录号：JQ181600）的亲缘关系最近。在 ORF1 编码的 Rep 蛋白处发现多个特异性突变位点 F70Y、F77L、W202R、N256S;ORF2 编码的Cap 蛋白相对保守。Protean 预测 Cap 蛋白的氨基酸第 5~18、24~25、39~41、48~49、57~65、99、101、112~114、139~140、145~150、162~165、175~181、188~189、205~211、227~232 位 置 处 均 可 能 存 在 潜 在 的 B 细 胞 表 位。GD222858 毒株的 Cap 蛋白抗原指数与 4 株疫苗株均有差异,在氨基酸 45~57、124~132、223~233 位置处抗原指数明显高于 4 株疫苗株,且与疫苗株 HM038034 差异最大。【结论】GD222858 毒株感染猪群的原因可能是 Rep 蛋白多个位点发生特异性突变及疫苗株选用不当所致。     

一株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列的遗传变异分析

[目的]了解H9N2亚型禽流感病毒分离毒株A／Chicken／Hebei／WD／98（简称WD98）与其他参考毒株的遗传变异关系。[方法]采用RT—PCR技术扩增了WD98分离株8个基因片段的全基因序列,并将其与7个参考毒株进行同源性比较及遗传进化分析。[结果]分离株WD98与7个参考毒株全基因组同源性为91．1％～95．8％,与A／duck／HongKong／Y280／97的全基因组核苷酸同源性最高（95．8％）,而与A／chicken／Pakistan／2／99同源性最低（91．1％）。WD98株的HA基因裂解位点为R—S-S—R↓G,其第226位受体结合住点为Q。[结论]禽流感病毒WD98毒株为低致病性禽流感病毒,不易感染人,与A／duck／HongKong／Y280／97亲缘关系最近,同属于欧亚种系A／Chicken／Beijing／1／94亚系。而在这同一亚系中,WD98株与A／Chicken／Beijing／1／94株的亲缘关系最远。