IBV抗体的银加强金标免疫技术检测

【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的银加强金标免疫技术（SECGA）;【方法】将胶体金标记纯化的兔抗鸡IgG,然后将IBV纯化抗原包被于NCM上（0.4ug/片）,封闭后在膜片上滴加不同稀释度（10×2X）的血清,作用10分钟,洗涤后浸于1：4金标兔抗鸡IgG液中作用60分钟,再银染10分钟观察结果;【结果】SECGA能检出IB阳性血清的抗体＞10×27,而不与ND、EDS76、IBD阳性血清发生有意义的交叉反应（抗体滴度＜10×22）。对鸡IgG的最小检测量为0.88ng。用SECGA、气管环中和试验、ELISA试验检测IB抗体有明显的相关性;【结论】银加强金标免疫技术（SECGA）可用于IB抗体的检测,具有敏感、特异、简单、快速、适于现场诊断等优点,适宜于广大基层单位使用。     

猪流行性腹泻病毒N重组表达蛋白间接ELISA检测方法建立

为了检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体水平,用纯化的猪流行性腹泻病毒N基因重组表达蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为0.5μg/m L,包被时间4℃过夜,5%脱脂乳的PBS封闭37℃2 h及4℃过夜。血清稀释度为1∶100;37℃作用45 min,辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G稀释度为1∶10 000,37℃温育60 min,底物显色37℃15 min。抗体临界值为OD450nm≥0.30判为阳性,OD450nm≤0.27判为阴性,介于二者之间判为可疑。经重复性试验和交叉试验,结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本184份,总阳性率为68.5%。     

基于猪囊尾蚴M13h蛋白的ELISA方法的优化

利用纯化的猪囊尾蚴重组蛋白M13h作为抗原包被酶标板,通过棋盘滴定方法筛选最佳反应条件,初步建立了猪囊尾蚴病间接ELISA检测方法.确定最佳包被量为1 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,酶标二抗的稀释倍数为1∶1000,二者的作用时间均为45 min；与猪弓形虫病、猪旋毛虫病、细颈囊尾蚴病、猪蛔虫病、包虫病...     

鸡柔嫩艾美耳球虫特异性抗体EtMIC4-N蛋白BAS-ELISA检测方法的建立

为了检测柔嫩艾美耳球虫感染鸡血清中特异性抗体水平,原核表达纯化EtMIC4-N蛋白,采用免疫印迹法确定其反应原性,再以纯化后的蛋白为包被抗原,以生物素标记的羊抗鸡IgG为二抗,以HRP结合链霉亲和素为酶标抗体,建立了检测柔嫩艾美耳球虫抗体的BAS-ELISA方法。经检测,EtMIC4-N蛋白最佳包被浓度为7μg/mL,最适封闭液为1%BSA,最佳血清稀释度为1:80,二抗稀释度为1:100000,酶标抗体稀释度为1:100000,最适显色时间为15min,组内和组间变异系数均小于10%。通过动物感染试验验证,结果表明建立的BAS-ELISA可以用于检测柔嫩艾美耳球虫特异性抗体的检测,并且具有简便,快速,灵敏,成本低等特点。     

黄曲霉毒素B1检测ELISA条件的优化

采用黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白偶联物(AFB1—BSA)抗原免疫Balb/C小鼠获得特异性抗体。以AFB1—STI为检测抗原,利用此抗体,进行间接竞争ELISA法试验。通过正交实验确定了最佳抗原包被反应质量浓度为1.0μg/mL;最佳抗原包被条件为:4℃过夜,一抗和酶标二抗IgG—HRP;最佳稀释度为1∶200000和1∶5000。在此优化条件下制备的抗体检测黄曲霉毒素B1具有很高的特异性和灵敏性,具有实际应用价值。     

人工合成氯霉素抗原免疫血清效价的比较及多克隆抗体的制备

【研究目的】人工合成氯霉素抗原及氯霉素多克隆抗体的制备,比较氯霉素人工抗原免疫血清效价。【方法】采用重氮化法,分别以BSA、OVA为载体蛋白合成CAP-BSA,CAP-OVA两种完全抗原,并对两种合成抗原的免疫效果进行比较。分别以这两种抗原作为免疫抗原用弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔,免疫四次后,心脏采血,分离血清,再用两种抗原分别作为包被原对兔血清进行间接竞争ELISA分析。【结果】大白兔经免疫后产生了抗氯霉素特异性抗体,两种抗原得到的抗体效价均达到1:8100,氯霉素最低检出限为9ng/mL。【结论】综合比较认为,CAP-OVA作为免疫原,CAP-BSA用作包被原是比较理想的实验方案,可用于制备氯霉素抗体和研制生产氯霉素酶联免疫试剂盒。     

猪圆环病毒2型间接ELISA方法的建立

为了猪圆环病毒2型（PCV2）抗体,本研究建立了快速、敏感的ELISA诊断方法。本研究应用原核表达的PCV2-Cap蛋白作为包被抗原,通过抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度的确定,待检血清稀释度的选择,阴阳性临界值的确定,然后进行特异性测定、重复性测定和符合率比较等,建立检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果显示,建立的间接ELISA方法只能检测出PCV2阳性血清;3次重复性试验的差异不显著;与韩国JBT公司的PCV2试剂盒的符合率达到了92.5%;对采集福建省内多个猪场204份血清样品进行检测,其阳性率达到了76.5%。实验表明,建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法具有特异性强、重复性和稳定性好的特点,可用于PCV2抗体的血清学诊断和流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法的建立及应用

为了建立一种准确、快速的副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法,以副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的特异性单克隆抗体1E2作为捕获抗体,兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体作为检测抗体,通过方阵滴定优化夹心ELISA检测方法最佳反应条件,并对该检测方法进行特异性、敏感性验证以及临床样品的检测应用。结果显示,该检测方法中单克隆抗体1E2最佳包被浓度为3.434μg/m L,兔抗副猪嗜血杆菌多抗的最佳稀释浓度为3.350μg/m L,用10 mg/m L明胶37℃封闭1 h优于其他封闭液,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多体最佳使用浓度为1∶4 000。该检测方法的特异性试验结果显示可检测出15个血清型的副猪嗜血杆菌病原,而与其他病原菌的检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示该方法能够检测出副猪嗜血杆菌的最低菌落浓度为1×106cfu/m L。利用该检测方法对临床115份副猪嗜血杆菌可疑病料进行检测结果显示可检出83份阳性样品,检出的阳性样品数高于细菌分离及PCR鉴定方法。上述结果表明所建立的副猪嗜血杆菌病原夹心ELISA检测方法特异性强、敏感性好并可应用到临床样品的检测。     

鸭病毒性肝炎间接血凝诊断抗原的制备

【研究目的】建立一种便于检测鸭病毒性肝炎抗体的方法。【研究方法】将纯化的鸭病毒性肝炎I型病毒(DHV-I)致敏双醛化红细胞,制备检测DHV抗体的间接血凝诊断抗原。【研究结果】使用该抗原对9种常见的禽传染病阳性血清、15只随机抽样的非免疫鸭血清进行检测,抗体均为阴性;检测被鸭病毒性肝炎I型病毒阻断后的阳性血清,抗体为阴性;用不同批次的诊断抗原检测同一血清样品结果显示一致;敏感性是琼脂扩散试验的32～64倍;对15只随机抽样的免疫鸭进行检测,阳性率达93%。【结论】该方法敏感性较高、特异性强、重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及鸭病毒性肝炎的流行病学调查。     

赤羽病病毒单克隆抗体的制备及c-ELISA抗体检测方法建立

为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合,以获得抗AKV的单克隆抗体;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原,山羊抗鼠HRP-IgG为二抗,建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应,与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应;建立的检测AKV抗体ELISA检测方法,诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比,1∶50血清稀释比,1∶2 000二抗稀释比,封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性,小于44%为阴性;所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系,建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体,为进一步开展AKV抗体...     

桃树矮化砧木灭菌方法的初探

【研究目的】通过对桃豫矮化砧木1号茎段灭菌效果的比较,探讨合理有效的灭菌方法,为桃树矮化砧木离体体系的建立奠定基础。【方法】采用75%乙醇和不同浓度的 HgCl2（升汞）、NaClO(次氯酸钠)爱尔施牌消毒片浸液等灭菌试剂对外植体进行灭菌。【结果表明】用75%乙醇+不同浓度的消毒片浸液混合使用的灭菌效果要明显好于75%乙醇+不同浓度的NaClO(次氯酸钠) 混合使用和75%乙醇+不同浓度的HgCl2（升汞）混合使用的灭菌效果。其中以75%乙醇灭菌30s+1.5g/L消毒片灭菌20min效果最好。     

兔CCR10基因的克隆与序列分析

摘 要：【研究目的】克隆并分析兔CCR10基因;【方法】基于电子延伸序列,设计1对克隆引物,兔盲肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coli JM109感受态细胞、检测阳性克隆、测序并进行序列分析。【结果】克隆的兔CCR10 基因长为723bp,编码由241个氨基酸残基组成的CCR10前体蛋白,三级结构预测表明CCR10具有一个多克隆免疫球蛋白区（PIG-X）。克隆的兔CCR10基因与绵羊、人的同源性分别为89.6%、89.9%,推导的氨基酸序列与绵羊、人的同源性分别为94.2%、93.8%,结构特征与绵羊、人的相一致。【结论】克隆了兔CCR10基因并注册GenBank (Accession. EU348829)。     

甘草甜素对金黄色葡萄球菌诱发小鼠实验性乳腺炎的影响

【目的】探讨甘草甜素对金葡菌所致小鼠乳腺炎控制效果；【方法】30只BALB/C雌孕鼠随机分成正常对照组（Con,n=10）、阳性对照组（P,n=10）和试验组（T,n=10）。阳性对照组和试验组母鼠于产后8-10d经乳头管注入50μl 7.0×102CFU细菌悬液，生理盐水组注入50μl 灭菌生理盐水。30只母鼠于接菌-12h、0h、12h、36h腹腔注射甘草甜素88mg/kg或生理盐水0.2ml。接菌后66h处死小鼠，取乳腺组织固定，进行组织学观察；【结果】观察显示P组的小鼠乳腺组织破坏得最为严重。P组小鼠乳腺组织间质宽度与正常对照组相比极显著增加（p＜0.01）,T组小鼠乳腺组织间质宽度极显著高于正常对照组（p＜0.01），与P组相比极显著减少（p＜0.01）；与正常对照组相比，P组小鼠乳腺组织中TNF-α、INF-γ含量极显著升高（p＜0.01），T组小鼠乳腺组织中TNF-α、INF-γ含量与P组相比极显著降低（p＜0.01）。【结论】结果表明，甘草甜素不仅减少乳腺内的细菌数，降低对组织的损伤，而且减轻乳腺炎症变化及全身反应，对乳腺具有一定的保护作用。     

外源ABA、Put和BR对亚适温条件下番茄幼苗叶片保护酶活性的影响

【研究目的】笔者研究了亚适温下不同浓度的脱落酸、腐胺、油菜素内脂对冷敏品种番茄“中蔬6号”幼苗保护酶活性的影响。【方法】选用不同浓度ABA、Put、BR溶液喷散番茄幼苗,清水处理作对照,每5d喷一次,共2次。然后在光照培养箱中模拟亚适温环境对番茄幼苗进行处理。【结果】亚适温下,番茄幼苗的MDA含量持续升高、SOD活性先升高后降低。对番茄幼苗进行适宜浓度的ABA、Put、和BR预处理,能够提高亚适温下番茄幼苗的SOD活性,降低MDA含量,有效地缓解亚适温引起的番茄幼苗叶片细胞的膜脂过氧化。降低MDA含量的最适浓度ABA为0.2mmol/L,Put为0.5mmol/L,BR为0.01mg/L;提高SOD活性的最适浓度ABA0.2mmol/L,Put为1.0mmol/L,BR为0.01mg/L。与对照相比,MDA含量分别降低47.7%、43.2%、42.2%,SOD活性分别提高29.2%、17.4%、28.6%;【结论】亚适温对番茄幼苗叶片细胞膜造成了伤害,膜脂过氧化产物MDA含量升高,SOD含量下降;喷施适宜浓度的ABA、Put、BR可以降低MDA含量,使SOD活性增加,减轻亚适温对番茄幼苗的伤害。     

8个热带、亚热带玉米群体的配合力和 杂种优势分析

【研究目的】对8个热带、亚热带玉米群体Pob45、Pob46、Pob501、Pob502、Pool33、Pool34、Pob25、Suwan1进行配合力及杂种优势分析。【方法】试验以自交系昌7-2、郑22、掖478、齐319、Mo17为测验种,采用NCⅡ遗传设计。【结果】Pob25和Pob502的产量一般配合力（GCA）较高,综合产量的一般配合力（GCA）、特殊配合力（SCA）和配合力总效应。【结论】得出塘四平头（昌7-2）×Pob501,塘四平头（昌7-2）×Pob25,Reid（掖478）×Pob25,塘四平头（昌7-2）×Suwan1,旅大红骨（郑22）×Pob502为5大杂优模式。     

不同锌水平对荷斯坦种公牛精液品质及血液理化指标的影响

【研究目的】本文旨在研究不同锌水平日粮对荷斯坦种公牛精液品质和血液理化指标的影响。【方法】选取30头荷斯坦种公牛,随机分为5组,A为对照组,饲喂基础日粮,B、C、D、E组锌的添加水平分别为50、80、110、200mg/kg,试验期8个月。【结果】结果表明,（1）不同锌水平对荷斯坦种公牛精子活力、射精量、精子密度影响极显著（P<0.01）;对精子顶体完整率无显著影响(P>0.05),能显著降低精子畸形率（P<0.05）。（2）不同锌水平对荷斯坦种公牛血清中睾酮含量影响极显著（P<0.01）,对血清锌、精清锌和精清睾酮含量无显著影响(P>0.05)。（3）不同锌水平对荷斯坦种公牛精清中谷草转氨酶（GOT）活性影响极显著（P<0.01）,对碱性磷酸酶（AKP）和谷丙转氨酶（GPT）活性有显著影响（P<0.05）,对乳酸脱氢酶（LDH）活性无显著影响(P>0.05);对血清中GOT和GPT活性影响极显著（P<0.01）,对AKP和LDH活性无显著影响(P>0.05)。【结论】综合分析不同锌水平试验牛生理生化指标的变化,本次试验研究表明：锌的适宜添加量为110mg/kg日粮干物质。     

基于数字图像的玉米叶面积测量方法研究

【研究目的】以数字图像处理技术为基础,采用数码相机获取数字图像,建立使用Visual C++6.0开发的图像处理软件进行玉米叶面积测量的方法。【方法】首先,用数码相机拍摄挂在墙上粘贴着玉米叶片的参照白板来获得数字图像。然后提取图像的蓝色分量,利用中值滤波、膨胀、腐蚀等方法去除图像噪声,最大类间方差法自动阈值分割目标。接着进行区域标记与区域像素数统计,区域像素数结合图像分辨率就可以获得玉米叶片的实际面积。【结果】与直尺法所测结果具有很好的相关性,且比直尺法更精确,【结论】此种拍摄方法避免了几何畸变的产生。蓝色分量图像中目标和背景的灰度差异最大,便于分割。     

不同培养代数鹿茸生长中心细胞对IGF1刺激 的反应

【研究目的】探讨胰岛素样生长因子（IGF1）对生长60 d的梅花鹿鹿茸体外培养不同代数鹿茸生长中心细胞的影响。【方法】分离、培养生长60d的梅花鹿鹿茸生长中心细胞,将培养第2 代、5 代、8 代细胞经含有不同浓度的IGF1（0,1,3 和10 nM）作用,在培养24 h后用3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定法检测每分钟衰变数（DPM）值。【结果】全部IGF1处理组都显著高于对照组（p<0.01）。不同浓度IGFⅠ处理组的平均值和最高值都是离体培养2 代的细胞的DPM最高（分别为31918和39818 DPM/mg蛋白）,培养5 代的细胞（分别为5455和6815 DPM/mg蛋白）已大大地下降;到了第 8代的（分别为4030和4838 DPM/mg蛋白）又有进一步的下降。【结论】IGF1能够促进鹿茸生长中心细胞分裂增殖,生长60 d鹿茸的生长中心细胞在离体培养,不同培养时期的鹿茸生长中心细胞对IGFⅠ刺激的敏感度不同。     

微生态饲料添加剂研制和对肉牛血清中生理生化指标的影响

【目的】为研究和推广绿色肉牛规模化饲养技术,研制了绿色促生长微生态饲料添加剂,研究了其对肉牛血清中生理生化指标的影响。【方法】分离和筛选三株有益菌研制微生态制剂,选用条件一致的架子牛,对其血清中生理生化指标的影响进行研究。【结果】实验结果表明,分离的菌株和研制的微生态制剂符合安全标准,肉牛血清中甲状腺功能亢进或低下的三个关键指标（FT3、FT4、TSH）,在肉牛实验前后的变化属正常范围,肉牛血清中生长激素和胰岛素样生长因子含量高于对照组,但差异不显著（P﹥0.05）。【结论】结果提示,微生态饲料添加剂对肉牛血清中生理生化指标无不利影响,是安全绿色的饲料添加剂。