化学激活对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

 探索了离子霉素结合细胞松驰素B（cytochalasin B, CB）、放线菌酮（cycloheximide, CHX）以及6-二甲基嘌呤（6-dimethylaminopurine, 6-DMAP）等化学物质，对猪卵母细胞激活后发育的影响。试验1，体外成熟卵母细胞分别用15、20、25、30 mol·L-1的离子霉素处理40 min或电激活（1.3 kV·cm-1，80 s,1次脉冲），结果表明，20 mol·L-1组的激活率（69.93±5.80）%显著高于15 mol·L-1组（P <0.05），但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验2，卵母细胞采用20 mol·L-1离子霉素分别激活10、20、30、40、50 min，再用2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，其中，40 min组的卵裂率、囊胚率[（72.40±13.02）%、（25.37±11.43）%]较高，但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验3，卵母细胞经离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，分别用7.5 g·ml-1 CB、10 g·ml-1 CHX、2 mmol·L-1 6-DMAP、7.5 g·ml-1 CB +10 g·ml-1 CHX和7.5 g·ml-1 CB +2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，2 mmol·L-16-DMAP组的激活率、卵裂率和囊胚率[（86.05±4.29）%、（61.77±8.10）%和（21.62±3.31）%] 显著高于7.5 g·ml-1 CB组（P <0.05）与另外几组差异不显著（P >0.05）。试验4，卵母细胞由离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，用2 mmol·L-1 6-DMAP分别处理3.5、5.5、7.5 h，5.5 h组的卵裂率和囊胚率[(66.59±14.36)%和(25.40±10.16)%]高于另外两组，但差异不显著（P >0.05）。结果表明，离子霉素（20 mol·L-1、40 min）+6-DMAP（2 mmol·L-1 、5.5 h）为最佳激活方案。离子霉素激活卵母细胞后，CB与CHX、6-DMAP的互作对卵子的发育有抑制作用。     

不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育的影响

[目的]系统比较了在成熟培养液中添加Leptin对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚的发育率和囊胚质量,同时比较了成熟培养液和胚胎培养液添加Leptin对孤雌激活胚发育的影响。[方法]成熟培养液中添加不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目,并且研究了成熟培养液和胚胎培养液单独或联合添加Leptin对猪早期孤雌胚胎发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目。[结果]成熟培养液中添加不同浓度Leptin(0,10,50,100和200 ng/ml),体外成熟44 h,卵母细胞核成熟率统计分析差异不显著(P>0.05);将核成熟卵母细胞进行化学激活,第2天胚胎卵裂率统计分析差异不显著(P>0.05),但100ng/ml组与其他组第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数差异显著(P<0.05);成熟液添加Leptin 100 ng/ml、胚胎培养液添加Leptin 10 ng/ml与其他组第7天的囊胚率及囊胚的内细胞团细胞数差异显著(P<0.05)。[结论]Leptin对卵母细胞成熟和孤雌胚胎发育能力上有相辅相成的作用。     

成熟液中不同添加物对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

试验研究了在成熟液中分别添加0.1% PVA、10% FBS和不同浓度的EGF(20、30、40、50 ng·mL-1)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳务件.结果表明,在成熟液中添加0.1%PVA和10% FBS后,对猪卵母细胞的成熟率影响无显著差异(P＞0.05),对猪卵母细胞孤雌激活后36 h的卵裂率和第6天的桑葚胚率无显著差异(P＞0.05);添加不同浓度的EGF对猪卵母细胞体外成熟率无显著差异(P＞0.05);但是添加30和40 ng·mL-1 EGF组在36 h的卵裂率要极显著地高于添加20和50ng·mL-l EGF的两组(P＜0.01);而分别添加30、40和50 ng·mL-1 EGF 3组处理在第6天的桑葚胚率无显著差异,且极显著地高于添加20 ng·mL-1 EGF组的(P＜0.01).所以,在成熟液中添加0.1% PVA可以替代10% FBS.尤以添加30 ng·mL-1 EGF组对猪卵母细胞的体外成熟效果较好.     

猪卵母细胞孤雌激活的研究

从卵母细胞孤雌激活的机制及影响因素,猪卵母细胞的激活,猪孤雌胚死亡主要原因,提高卵母细胞孤雌激活效果的技术途径,以及对孤雌激活的研究意义和发展前景等方面,对猪卵母细胞孤雌激活研究进行了综述.     

Forskolin和促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响

利用已建立的猪卵母细胞体外无血清培养模型,研究了猪卵丘-卵母细胞复合体(CEO)在模拟生理环境的培养条件下Forskolin和促性腺激素对猪卵母细胞成熟的作用.在观察卵母细胞减数分裂恢复(GVBD)后的实验结果表明(1)cAMP产生的激动剂凡Forkolin(3μmol@L-1)处理CEO 20h可以显著协同HX抑制卵母细胞成熟;处理40h后,Forskolin(3μmol@L-1)的抑制作用被卵丘细胞分泌的某种物质克服;(2)Forskolin(3μmol L.)短期(30,60,120,240min)处理后可以诱导卵丘细胞分泌某种促进卵母细胞成熟的物质.(3)FSH(50～200U/L)能够诱导卵丘细胞分泌某种物质促进卵母细胞成熟;(4)50U/L的FSH预处理CEO结果与Forskolin结果相同,提示FSH诱导的卵母细胞成熟是通过cAMP依赖性的通路进行的.     

不同电激活参数及CB处理对猪卵母细胞孤雌发育的影响

从猪卵巢上获取的卵母细胞经体外培养成熟42～44 h后去除颗粒细胞,选取成熟的卵母细胞进行孤雌激活培养.试验采用不同的场强、脉冲时程和脉冲次数进行对照试验,并比较了细胞松弛素B(CB)辅助激活对孤雌胚胎发育的影响.结果显示:1)当场强为0.8 kV.cm-1,选取4个脉冲时程(80、100、120、140μs)参数分别进行1次、2次脉冲激活时,100μs、1次脉冲囊胚率最高,为(42.22±5.38)%,但同其他组无显著差异(P>0.05).2)脉冲时程为100μs,选取4个场强(0.8、1.0、1.2、1.4 kV.cm-1)参数分别进行1次、2次脉冲激活时,1.4 kV.cm-1、1次脉冲囊胚率最高,为(44.04±0.68)%,但同其他组无显著差异(P>0.05).3)场强为0.8 kV.cm-1和1.4 kV.cm-1,选取4个脉冲时程(80、100、120、140μs)进行1次脉冲激活时,1.4 kV.cm-1+80μs组囊胚率(54.60±2.86)%均高于其他组,且极显著高于1.4 kV.cm-1+140μs、0.8 kV.cm-1+80μs和0.8 kV.cm-1+140μs组(P<0.01).4)用1.4 kV.cm-1、80μs、1次脉冲激活卵母细胞后,使用CB辅助激活4 h的囊胚率为(54.07±3.12)%,极显著(P<0.01)高于不使用CB组.以上结果说明,电激活中脉冲次数对猪孤雌胚胎发育无显著影响,且在本试验条件下,采用1.4 kV.cm-1的场强、80μs的脉冲时程,并使用CB辅助激活4 h,能够得到较高囊胚率的猪孤雌激活效率.     

乙二胺四乙酸钠对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响

探讨乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响.利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在不添加或添加不同浓度EDTA-Na的成熟培养液中体外成熟44～48 h,挑选核成熟卵母细胞进行孤雌激活,然后移到不添加或添加不同浓度EDTA-Na的胚胎培养液中进行体外培养168 h.结果表明:(1)胚胎培养液中添加适当浓度(25～100 μmol·L-1)EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用,在EDTA-Na浓度为100 μmol·L-1时,效果最佳;(2)成熟液和胚胎培养液中同时添加100 μmol·L-1EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用;(3)成熟液或/和胚胎培养液中添加不同浓度EDTANa对体外成熟培养后的猪核成熟卵母细胞及孤雌激活后的4-细胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱都无显著影响.     

猪卵泡液和促性腺激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

研究猪卵泡液(pFF)的浓度和促性腺激素(FSH和LH)处理时间对猪卵泡卵母细胞体外成熟的影响.结果表明,在猪卵丘细胞-卵母细胞复合体体外成熟培养46～48 h中的后23～24 h去除促性腺激素可有利于卵丘细胞的扩散,但对卵细胞的核成熟无显著影响(P>0.05);添加适量(10%)的pFF对猪卵母细胞体外成熟有一定的促进作用,但添加浓度太高则相对抑制卵子核成熟进程.     

猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率影响因素分析

 研究了月龄和卵巢采集后的保存条件对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活效率的影响 ,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。试验包括 :(1)卵巢保存的生理盐水温度 (2 2、30、37、38.5、4 0℃ )对猪卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响。 (2 )卵巢保存时间对猪卵母细胞体外成熟和后期发育的影响。 (3)初情期前后母猪卵母细胞对体外成熟和发育潜力的影响。结果表明 ,(1) 38.5℃保存的卵巢卵母细胞激活后的卵裂率 (79.6 4 % )和囊胚率(18.11% ) ,37℃的卵裂率 (76 .18% )和囊胚     

成熟培养时间对家猫卵母细胞孤雌激活胚发育的影响

为筛选出最佳体外成熟时间,以乙醇联合6-DMAP激活验证成熟时间对家猫卵母细胞成熟的影响.将家猫卵母细胞分别体外成熟28h,32h和36h后,采用10%无水乙醇激活3min,6-DMAP培养4h,再移入胚胎体外培养液中培养;第二天观察卵裂率,第六天结束培养并用H33342染色,观察不同成熟时间的激活胚胎发育情况.结果表明:成熟32h组的卵母细胞激活率最高,显著高于28h组(60.42%vs 43.16%,0.010.05);经孤雌激活的卵母细胞没有发育至囊胚的,32h组桑椹胚率最高达到15.63%,与其他两组差异不具有统计学意义(7.36%和10.78%,p>0.05).结论:家猫卵母细胞体外成熟培养32h,成熟效果最好.     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

猪无透明带卵不同孤雌激活方法研究

研究了离子霉素处理时间、处理浓度和不同胚胎基础培养基对猪无透明带卵孤雌激活的影响。结果表明：（1）10μM离子霉素处理5min、7min、10min的激活率64.81%、66.67%、68.75%差异不显著（P〉0.05）,但显著高于处理3min的激活率36.17%。（2）分别以10μM、15μM离子霉素处理10min的激活率68.18%、65.11%差异不显著（P〉0.05）,但显著高于5μM的激活率40.54%（P〈0.05）。（3）分别以NCSU-23＋4%BSA和TCM199＋4%BSA作为基础培养基进行培养,其激活率68.51%、62.50%无显著差异（P〉0.05）。试验结果表明：10μM离子霉素处理5min联合2mmol/L6-DMAP处理2h激活,以NCSU-23＋4%BSA为胚胎基础培养基能有效提高猪无透明带卵孤雌激活的激活率。     

Effects of Chemical Activation on the Parthenogenetic Development of Porcine in vitro Maturation Oocytes

The objective of this study was to determine the effects of ionomycin combined with cytochalasin B (CB), cycloheximide (CHX), or 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) on the activation of porcine oocytes. In Experiment 1, in vitro matured oocytes were activated with 15,20,25 or 30 mmol L-1 ionomycin separately. Activation rates of 20,25 mmol L-1 and 30 mmol L-1 treatments were higher (P<0.05) than that of 15 mmol L-1 treatment. In Experiment 2, in vitro matured oocytes were activated with 20 mmol L-1 ionomycin for 10,20,30,40 or 50 min and then incubated with 2 mmol L-1 6-DMAP for 6 h.Cleavage and blastocyst rates [(72.40±13.02)％, (25.37±11.43)％] after treatments for 40 min were higher (P>0.05) thanthose of the other treatments. In Experiment 3, matured oocytes were activated with ionomycin and then incubated with 7.5 mgmL-1 CB, 10 mg mL-1 CHX, 2 mmol L-16-DMAP, 7.5 mg mL-1 CB + 10 mg mL-1 CHX or 7.5 mg mL-1 CB + 2 mmol L-1 6-DMAP for6 h. The rates of activation, cleavage and blastocyst of 2 mmol L-1 6-DMAP treatment [(86.05±4.29)％, (61.77±8.10)％ and(21.62±3.31)％] were higher (P<0.05) than those of 7.5 mg mL-1 CB treatment. In Experiment 4, matured oocytes wereactivated with ionomycin and then incubated with 2 mmol L-1 6-DMAP for 3.5, 5.5 or 7.5 h. Cleavage rates and blastocyst rates of 5.5 h treatment [(66.59±14.36)％ and (25.40±10.16)％] were higher (P>0.05) than those of other treatments. In conclusion, activation of porcine oocytes appears to be most successful using the combination of ionomycin (20 mmol L-1,40 min) followed by 6-DMAP (2 mmol L-1, 5.5 h).     

微滴中胚胎数量对猪孤雌胚早期体外发育的影响

[目的]优化猪早期胚胎培养体系,为单精子显微受精及体细胞核移植等研究提供依据。[方法]以猪的早期孤雌胚胎为材料,分别将人工激活后的70、50、30、15和5枚卵母细胞放入100μlNCSU-23培养液的微滴中进行培养,探讨了胚胎培养数量对猪早期孤雌胚发育的影响。[结果]100μl的培养微滴中培养30、50和70胚胎组,其分裂率分别为64.0%、65.2%和67.1%,显著高于5胚胎组,而与15胚胎组的差异不显著 在囊胚率方面,70胚胎组的最高,为3.0%,与50胚胎组的（1.7%）无显著差异,与5、15和30胚胎组的差异显著 各组的囊胚细胞数之间没有显著差异。[结论]在该研究条件下,当微滴体积为100μl时,培养50~70枚猪孤雌胚胎的效果最好,即,胚胎数∶培养滴体积=（1∶1.43~2.00）。     

小鼠卵母细胞的孤雌激活及体外发育

分别用不同条件的电脉冲、酒精浓度刺激不同卵龄的小鼠卵母细胞，进行体外培养并观察卵母细胞的活化和体外发育情况。结果表明，①以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽１６０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１７ｈ的卵母细胞，活化卵形成二原核率为９０％；以场强５５Ｖ／ｍｍ，脉宽６４０μｓ的电脉冲刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞，激活卵的桑椹胚最高发育率为６９％．②用７％酒精刺激卵龄为１５ｈ的卵母细胞２ｍｉｎ，活化率最高为７２％，激活卵的桑椹胚发育率为２２．２％．     

LHRH-A3及EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

试验研究了在成熟培养液中添加促黄体素释放激素A3(Luteinizing hormone releasing hormoneA3,LHRH-A3)与表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)联合作用对猪卵母细胞体外成熟及孤雌发育的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。结果表明,在猪卵母细胞体外成熟培养中,LHRH-A3可以代替孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotrophin,hCG);在孤雌发育中,LHRH-A3作用的效果明显高于添加PMSG和hCG组合;在联合应用处理中,剂量为1.5μg/mL LHRH-A3和40ng/mL EGF的组合对猪卵母细胞体外培养和孤雌发育的效果比较好。     

山羊卵母细胞孤雌激活和孤雌胚体外发育的研究

用离子霉素、乙醇、电刺激和Ca-A23187对体外成熟山羊卵泡卵母细胞的孤雌激活和孤雌胚体外发育进行了较为系统的研究。结果表明:2.5,5.0,10.0μmol/L离子霉素对卵母细胞激活率分别为54.0%,58.2%,57.9%,孤雌胚发育率分别为1.5%,3.4%,0%,激活率和发育率均无显著差异(P>0.05)。5.0,10.0,15.0,20.0μmol/L Ca-A23187对卵母细胞激活率分别为31.0%,46.4%,41.8%,45.8%,其中5.0μmol/L Ca-A23187激活率显著低于其他处理组(P<0.05)。5.0μmol/L处理大于4-细胞发育率,极显著低于10.0μmol/L和20.0μmol/L处理(P<0.01),显著低于15.0μmol/L处理(P<0.05)。3%,7%,11%和15%乙醇对卵母细胞激活率分别为40.0%、61.4%、63.0%和67.9%,其中3%乙醇活化率极显著低于其他各组(P<0.01)。15%乙醇致卵母细胞死亡率为15.4%,显著高于其他各组(P<0.05)。7%和11%乙醇处理2~4-细胞和大于4-细胞的发育率,均显著高于3%和15%乙醇处理(P<0.05)。15%乙醇处理大于8-细胞的发育率,极显著低于7%乙醇(P<0.01),显著低于11%乙醇(P<0.05)。在含Ca2 电激液中,用1.00,1.25,1.50,1.80 kV/cm电压刺激卵母细胞,活化率分别为48.4%,54.3%,55.8%,45.1%,2~4细胞卵裂率分别为52.3%,57.9%,54.7%,53.1%,差异均不显著(P<0.05)。