SYBR Green I荧光定量PCR法检测朗德鹅填饲前后黑素皮质素受体-4基因(MC4R)的表达

黑素皮质素受体4基因(MC4R)在各组织中的不同表达对于鹅脂肪代谢具有重要作用.本研究应用强制填饲技术建立腹型肥胖朗德鹅(Casuarius casuarius)模型,提取填饲后及正常朗德鹅新鲜腹脂、肝脏等13种组织的总RNA,SYBR GreenI荧光定量PCR法检测各组织MC4R基因的表达,选择β-actin作为内参基因,使用半定量2-△△Ct法分析.PCR结果显示,MC4R基因及β-actin在填饲前后朗德鹅心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌胃、小肠、胰腺、脑、胸肌、腿肌、腹脂、皮下脂等13种组织中均存在不同程度表达.SYBR Green I荧光定量PCR结果表明,在肾、小肠和心这3个组织中,填饲后朗德鹅MC4R表达量均比对照组中朗德鹅该基因表达量低,填饲后分别为填饲前表达量的0.41±1.80、0.65±5.75和0.72±1.22倍.而在其他组织中,MC4R基因表达量均有不同程度的增加,填饲组/对照组相对表达量倍数由高到低顺序分别为:22.78±1.00倍(脑),9.08±2.80倍(肝),5.28±1.83倍(肺),3.78±3.01倍(胰),3.07±3.64倍(腿肌),2.90±0.97倍(胃),2.34±1.66倍(皮下脂肪),2.18±3.01倍(腹脂),2.07±0.37倍(胸肌),2.01±1.75倍(脾).结果符合MC4R作用机理,为畜牧生产及人类肥胖问题的研究提供间接依据.     

广西德保猪MC1R基因的克隆与分析

近年来含有天然黑色素的动植物黑色食品得到青睐,为探讨广西地方品种德保猪全黑毛色形成的分子机制,本文克隆了广西德保猪MC1R基因并进行了系统生物信息学分析。根据NCBI已公布的猪MC1R基因序列（GI：347618788）设计特异性引物,以从德保猪血液中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆获得长1 519 bp的MC1R基因序列片段。多重序列比较结果显示克隆片段与已公布的猪、牛、人、狗、绵羊、小鼠和鸡的相似性依次分别为99%、87%、86%、85%、84%、81%和77%,表明MC1R基因在不同哺乳动物间具有较高的保守型。德保猪MC1R蛋白结构预测结果显示,其理论分子质量为34.65 ku,等电点为8.70,为弱碱性蛋白,N-末端不存在信号肽,定位于细胞质膜,具有1个低复杂度结构域和7个跨膜结构域,具有典型的细胞膜受体蛋白结构。多项研究报道表明MC1R基因是动物毛皮颜色重要的决定基因,德保猪MC1R基因克隆为揭示其全黑色形成的分子机制奠定了较好的实验基础。     

黑素皮质素受体3基因(MC3R)多态性及其单倍型组合与京海黄鸡屠体性状的关联分析

本研究旨在探讨黑素皮质素受体3基因(melanocortin 3 receptor,MC3R)对鸡(Gallus gallus)屠体性状的影响。采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)检测及测序的方法,检测MC3R在京海黄鸡群体中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),并对这些多态位点进行连锁不平衡和单倍型分析。结果表明,在MC3R编码区序列(coding sequence,CDS)共检测到6个SNPs位点,各位点间均不存在强连锁不平衡;6个SNPs位点在379只京海黄鸡的群体中形成了5种单倍型和11种单倍型组合。最小二乘法分析结果表明,不同单倍型组合间京海黄鸡屠体性状(包括活体重、屠体重、胸肌重、腿肌重、全净膛重、半净膛重和腹脂重)存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01),其中单倍型组合H3H4和H3H3的各种屠体性状均极显著高于单倍型组合H4H5(P<0.01),也显著高于其他部分单倍型组合(P<0.05),为屠体性状优势组合;单倍型组合H4H5各屠体性状均为最低,均显著或极显著低于其他大部分单倍型组合(P<0.05或P<0.01),为屠体性状劣势组合。因此,MC3R可能是影响鸡屠体性状的主效基因或与主效基因连锁,本研究为京海黄鸡屠体性状分子标记辅助选择提供了参考依据。     

猪MC4R基因Asp298Asn位点的多态性及其与商品猪背膘厚的关系

黑素皮质素受体4 ( melanocortin 4 receptor, MC4R) 是G 蛋白耦联受体( G protein coupled receptors,GPCRs) 超家族的一个成员, 在人和小鼠的体重、能量稳态和采食量的调控中发挥重要作用。本研究采用PCR-RFLP技术对MC4R的298位点错义突变（Asp298Asn）在莱芜猪、大莱二元杂交猪和商品猪中的多态性进行了检测,对该突变与商品猪背膘厚的关系进行了关联分析。结果表明,在33头莱芜猪中只检测到11基因型,而在大莱二元杂交猪和商品猪中11、12和22基因型均有分布,且等位基因1的频率均高于等位基因2;在该突变位点三个群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。商品猪不同基因型个体背膘厚差异显著,22基因型个体的背膘厚显著高于12基因型（P <0.01）和11基因型（P <0.05）个体。因此,MC4R基因298位点的Asp298Asn错义突变与商品猪的背膘厚有关,可以作为以西方猪种为杂交亲本的商品猪背膘厚的分子标记。     

猪5-HT4b受体基因cDNA克隆和序列分析

利用RT—PCR技术克隆了猪5-HT4bR基因的核苷酸序列，并利用生物信息学手段进行了验证。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长1209bp且包含一个完整的开放阅读框，编码402个氨基酸。该序列已在GenBank登录（Accession No．AY566638）。序列分析结果表明，该基因与已报道的人、鼠等5种动物5-HT4bR基因具有较高的核酸序列和氨基酸序列同源性，分别为92．56％和93．63％。该基因编码的蛋白具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体超家族。     

桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列（GenBank登录号：HQ453972）和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列（GenBank登录号：HQ453974）,并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为：GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

猪FUT1基因启动子区的确定及活性分析

F18大肠杆菌(Escherichia coli F18,E.coli F18)是养猪(Susscrofa)业中发生最普遍、危害最大的病原菌之一,球系列鞘糖脂生物合成通路及通路中α-(1,2)岩藻糖转移酶1基因(alpha(1,2)fucose transferase 1,FUT1)对断奶仔猪F18抗性具有重要调控作用.本研究运用生物信息学技术挖掘课题组前期获得的断奶仔猪转录组测序结果,确定FUT1基因的转录起始位点和启动子区.同时对启动子区序列进行CpG岛分析;采用双荧光素酶报告基因以及AliBaba 2.0软件,分别分析启动子区活性和CpG岛序列潜在的转录结合位点.通过比对人类(Homo sapiens)和猪的基因序列信息数据库,结果表明,FUT1基因转录起始区域具有5种可变剪接(AS-1,AS-2,AS-3,AS-4和AS-5)和2个启动子区域(启动子1和启动子2);双荧光素酶报告基因检测结果进一步显示,FUT1基因启动子2的转录活性极显著高于启动子1的转录活性(P＜0.01),启动子2的活性是启动子1的2.75倍,根据结果可以推测启动子2在转录过程中起主导作用;CpG岛分析显示,猪FUT1基因启动子1和启动子2分别存在一个CpG岛.FUT1启动子1扩增片转录因子预测分析表明,FUT1基因启动子1存在20个潜在的转录因子结合位点,并且Sp1出现在多个转录结合位点处.本研究结果为猪FUT1基因的甲基化检测和调控机制分析提供一定的基础和依据.     

猪MYL4基因的克隆及其在猪胚胎骨骼肌中的表达分析

克隆了猪(Sus scrota)MYL4基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行验证.所得cDNA序列全长1105 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码197个氨基酸.序列分析表明,该基因与已报道的狗(Canis lupus familiaris)、人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)和恒河猴(Macaca mulatta)等物种的MYL4基因高度同源,氨基酸序列同源性分别为98.4%、95.9%、95.4%和95.4%.该基因编码的蛋白具有EFH和FRQ1保守功能域.荧光定量分析该基因在猪胚胎骨骼肌(妊娠33、65和90d)中的表达,发现MYL4基因在通城猪和长白猪中呈波浪式表达模式,在妊娠第33天时中外猪品种间无显著差异,但在第65和90天时长白猪中显著高于通城猪.     

五指山小型猪生长激素及其受体基因的克隆与序列分析

动物生长发育调控是一个高度复杂而精细的生理过程,受多种因素如神经、体液、遗传、营养及环境等的影响。其中,动物神经内分泌生长轴各因子(激素、受体、结合蛋白等)及其基因对动物的生长发育起着关键的作用。正常情况下,下丘脑接受体内外的信息,生长激素释放激素(grow thhorm one releasing horm one,GHRH)和生长抑素(som atostatin,SS),调节垂体生长激素(grow thhorm one,GH)的分泌,GH通过与生长激素结合蛋白(grow th horm one b ind ing protein,GHBP)结合而运输,与靶器官上的生长激素受体(grow th horm one receptor,GHR)结合,促使类胰岛素生长因子(insu lin-like grow th factors,IGFs)的产生并进入血液循环,IGFs再通过其结合蛋白(insu lin-likegrow th factor b ind ing protein,IGFBP)转运到全身组织细胞,促使组织细胞的生长与分化。五指山猪(Wuzhishan Pig,WZSP)是一种原产于中国海南省山区的小型猪。五指山猪成年体重仅为35 kg,是正常猪体重的15%~30%,是一种频临灭绝的珍稀物种。五指山猪具有以下特征:体型小,性成熟早,肉质好,耐近交和遗传稳定。为了开发和应用这一珍稀猪种的遗传资源,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所从1989年就已经开始对五指山猪进行近交系培育,现在已经获得五指山猪近交系18代(近交系数为0.974),但五指山猪的矮小机理至今不明。为了探讨五指山猪矮小的分子机理,对五指山猪生长激素及其受体基因进行了克隆和序列分析。从纯种近交16代五指山猪的垂体和肝组织提取总RNA,根据GenBank中猪生长激素及其受体基因的序列(登录号分别为X53325,NM214254)设计特异性引物,对五指山猪生长激素及其受体基因进行扩增,然后对PCR产物进行回收、克隆测序。测序结果表明,五指山猪生长激素基因开放阅读框长651 bp,编码216个氨基酸,其中包含26个氨基酸的信号肽;生长激素受体基因编码区编码639个氨基酸,其中包含18个氨基酸的信号肽。运用生物学软件DNAssist 2.2将五指山猪和普通猪的生长激素基因编码区进行比对发现,五指山猪生长激素基因的编码区有4个突变:26号位置发生C→T突变,该突变导致缬氨酸代替丙氨酸;65号位置发生G→A突变,该突变导致谷氨酰胺替换精氨酸;114号位置发生T→C突变,252号位置发生A→G突变,但是这两个突变都未引起所编码氨基酸的变化。五指山猪和普通猪生长激素受体基因比对发现,1143号位置的G→T突变引起天冬氨酸替换谷氨酸;1225号位置的G→T突变导致丝氨酸替换丙氨酸;1666号位置C→G突变导致缬氨酸替换亮氨酸;1739号位置C→G突变导致丙氨酸被甘氨酸所代替;1801号位置G→A突变导致缬氨酸被异亮氨酸代替;1248号位置G→A突变,1287号位置G→A突变和1827号位置G→C突变均为同义突变,未引起相应编码氨基酸的变化。五指山猪生长激素基因有两处氨基酸替换,这两处替换发生在信号肽区,对成熟蛋白的结构和功能没有影响,但是有可能会影响蛋白的运输。五指山猪生长激素受体基因突变都发生在生长激素受体的胞内结构域,这些突变可能改变生长激素受体的空间构像,从而对生长激素受体的胞内信号转导产生一定的影响,影响生长激素-生长激素受体-胰岛素样生长因子轴的信号级联,削弱生长激素的促生长作用。     

猪MYL4基因的克隆及其在猪胚胎骨骼肌中的差异表达分析

克隆了猪MYL4基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行验证。所得cDNA序列全长1105bp,包含一个完整的开放阅读框,编码197个氨基酸。序列分析表明,该基因与已报道的狗、人、黑猩猩和恒河猴等物种的MYL4基因高度同源,氨基酸序列同源性分别为98.4%、95.9%、95.4%和95.4%。该基因编码的蛋白具有EFH和FRQ1保守功能域。荧光定量分析该基因在猪胚胎骨骼肌（妊娠33 、65 和90 天）中的表达规律,发现MYL4基因在通城猪和长白猪中呈波浪式表达模式,在妊娠第33 天时中外猪品种间无显著差异,但在65 和90 天时长白猪中显著高于通城猪。     

奶牛硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子的克隆及活性分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶,为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制,本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760bp),采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点,将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后,瞬时转染到HepG2细胞,对细胞施加胰岛素(10IU/mL)和亚油酸(120μm)处理,通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性,结果发现,在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点,随着SCD启动子片段长度的延长,启动子活性也显著提高,pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比,pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05),其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高,达到了46.93。在亚油酸刺激下,pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化,而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05),研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.     

水稻rbcs基因启动子的克隆及结构功能分析

利用PCR法克隆了水稻日本晴来源的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亚基基因（rbcS）5’上游调控区，命名为Posrbcs。将Posrbcs与gus基因融合，并通过农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性进行定性与定量分析，结果表明，Posrbcs启动子可驱动gus基因在转基因水稻植株的叶片、叶鞘、茎杆及颖壳中特异性表达，在胚乳中不表达。然后构建不同长度片断的Posrbcs的5’端缺失体，分别与gus构建融合基因，转入水稻中。对转基因植株GUS活性定量分析结果显示， Posrbcs片段愈短，GUS活性愈低；进一步的光诱导试验结果显示，光能明显提高gus基因表达活性，并且随着Posrbcs片段缩短，Posrbcs中的I box、GT1结合位点、GATA box、T box 等光诱导相关元件的缺失会造成在不同时间段的光诱导活性降低以及光诱导表达时间后移。凝胶阻滞试验证实Posrbcs序列中的这些光诱导相关元件有相应的核蛋白的结合。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因（ZEN-jjm）的克隆、表达及活性分析

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是世界上污染范围最广泛的一种镰刀霉毒素,能导致人或动物不孕、流产等症状,损害内脏器官并促进癌细胞的生长.本文通过设计1对特异性引物,从粉红螺旋聚孢霉(Gliocladium roseum)中克隆获得大小为795 bp的DNA片段(ZEN-jjm),通过构建E. coil原核表达载体进行表达.经HPLC检测证实,IPTG诱导后的细胞裂解上清能在3 h内完全降解液体中1μg/mL的ZEN.序列分析结果表明ZEN-jjm与zhd101存在9个碱基的差异,ZEN-jjm编码的ZEN降解酶与文献报道的乳糖水解酶存在3个氨基酸的差异,但ZEN毒素降解实验证实二者活性相似.     

猪三十九肽胆囊收缩素(CCK39)基因的克隆和表达

以猪十二指肠中提取的总RNA为模板，根据GenBank已发表的猪三十九肽胆囊收缩素（CCK39）基因序列设计1对特异性引物。用RT-PCR扩增CCK39基因的cDNA，纯化后克隆人pUC18载体，BamHⅠ／EcoRⅠ双酶切后插入pGEX-6P-1质粒获得原核表达载体。0．5mmol／L IPTG诱导表达并纯化产物，以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备单因子血清；用抗GST抗体和自制的抗CCK39的单因子血清Westen blot检测融合蛋白。结果表明：成功地克隆出CCK39基因的cDNA，构建的原核表达载体pGEX-CCK39成功地表达约32kD的融合蛋白，抗GST抗体和抗CCK39单因子血清能识别融合蛋白，证明获得的融合蛋白具有较好的抗原性，为制备抗CCK抗体及研究CCK的各种生理功能提供大量、低廉和抗原性较强的胆囊收缩素。     

桃PpNAC19的克隆及其对PpCCD4启动子活性的调节分析

为探究桃NAC基因对类胡萝卜素积累的调控作用,本研究从桃中克隆得到PpNAC19基因.序列分析表明,PpNAC19(XP_007223324.1)开放阅读框为867 bp,编码288个氨基酸,预测蛋白质分子量为33.2 kDa,平均疏水系数为-0.719,属于亲水性蛋白,含有一个典型的NAM结构域.亚细胞定位预测PpN...