西瓜噬酸菌吡哆醛磷酸(VB6)营养缺陷型与致病性相关

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起的一种病害,严重为害西瓜、甜瓜的叶片和果实,造成大量减产.迄今,对该病害的研究主要集中在病原菌鉴定、病原菌检测技术、病害防治方法、品种抗病性鉴定等方面,而对病原菌的致病机理仍然知之甚少.本实验以西瓜噬酸菌xjl12菌株为背景构建转座子(mini-Tn5)插入的突变体文库,以哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)为实验材料,通过对哈密瓜种子浸种处理和子叶注射接种的方法筛选突变体,而后利用同源重组的方法获得插入突变体,并对所得的突变株及野生型、互补等各个菌株进行致病性、游动性等相关表型进行测定.研究结果表明,通过文库筛选得到的1株致病力明显下降的突变体,亚克隆鉴定可知该突变体△xj-25的Mini-Tn5插入位点为吡哆醛磷酸生物合成蛋白基因(pdxJ基因),其功能主要与吡哆醛磷酸(俗称VB6)生物合成蛋白相关.突变菌株△Pdx.J致病性显著下降,生长能力、游动性明显降低,无法正常形成鞭毛和产生生物膜.通过外源添加VB6可恢复其致病性和生长能力等主要表型.本研究证明VB6生物合成在致病性、生长能力以及鞭毛的合成等方面发挥着重要作用,为降低病原菌侵害提供了一个新的思路.     

西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛相关基因pilO及pilQ的功能分析

瓜类细菌性果斑病是发生在葫芦科植物上的一种病害,其病原为噬酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli),自报道以来已给美国、澳大利亚、巴西、中国等众多国家的瓜类作物种植业造成了严重的损失。要从根本上防治瓜类细菌性果斑病,我们应弄清其致病机制。本实验对西瓜噬酸菌(A.citrulli)中部分Ⅳ型菌毛(pili)相关基因构建插入突变体,用浸种测定法筛选出两株致病力和发病率明显减弱的突变体,鉴定为pilO及pilQ基因突变体,并对这两株突变体的相关表型进行测定。在透射电子显微镜下观测发现,野生型及pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛,而pilQ基因突变体丧失形成Ⅳ型菌毛的能力;光学显微镜下观测野生型、突变体及互补菌株的颤动能力发现,pilO及pilQ基因突变体与野生型相比,完全丧失颤动能力;同时pilO及pilQ基因突变体游动能力、生物膜形成能力也明显减弱。互补菌株中,颤动能力得到恢复,致病力、游动能力以及生物膜形成能力部分恢复。在MMX基本培养基中测定野生型与突变体的生长曲线发现,突变体菌株生长能力无明显改变;同时突变体也能激发非寄主植物烟草(Nicotiana tabacum)的过敏性反应。pilO基因突变体仍然能够形成Ⅳ型菌毛但丧失部分Ⅳ型菌毛介导的功能,由此表明,pilO基因并不直接参与西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛的合成,而是Ⅳ型菌毛的功能基因;pilQ基因突变体不能形成Ⅳ型菌毛且丧失其介导的部分功能表明,pilQ基因在西瓜噬酸菌中直接参与Ⅳ型菌毛的合成,是Ⅳ型菌毛的合成及功能基因。同时也进一步证明西瓜噬酸菌Ⅳ型菌毛与其颤动性、致病性、游动性及生物膜形成能力相关。     

西瓜嗜酸菌双精氨酸转运系统基因(tatB)功能分析

细菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat)可严重影响动植物病原细菌的致病性,为了研究Tat与西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)致病性的关系,本研究通过同源重组的方法构建了西瓜嗜酸菌的tatB基因缺失菌株(ΔtatB)以及互补菌株(CtatB),并从西瓜嗜酸菌致病能力、游动能力、生长能力、胞外多糖与胞外纤维素酶产生能力以及生物膜形成等方面阐明Tat系统对西瓜嗜酸菌的影响。实时荧光定量PCR探究tatB基因与Ⅲ型分泌系统相关基因(hrcN)和(hrpE)、Tat转运系统相关基因(Aave_1810)和(Aave_0034)以及细胞毒性相关基因(TrbC)的关系。结果表明,ΔtatB能够引起非寄主植物烟草(Nicotiana tabacum)的过敏性反应;tatB基因的缺失导致了嗜酸菌的致病力、游动能力和对数生长初期的生长能力下降;不影响西瓜嗜酸菌胞外多糖、胞外纤维素酶的产生以及生物膜的形成;导致了TrbC和hrcN基因表达量显著升高,Aave_1810、Aave_0034和hrpE基因的表达量显著降低。研究结果表明,Tat系统相关基因tatB的缺失会影响西瓜嗜酸菌一些生物学特性,并导致病菌致病能力降低。本研究为西瓜嗜酸菌Ⅲ型分泌系统外的其他分泌系统与致病性的关系研究提供了基础资料。     

瓜类细菌性果斑病菌luxR基因的功能分析

luxR基因作为信号分子受体蛋白的编码基因,在革兰氏阴性菌群体感应(quorum sensing,QS)LuxI/LuxR环路中起重要作用.本研究采用PCR技术从瓜类细菌性果斑病菌(Acidovgorax avenae subsp.citrulli)xjL12中扩增出luxR同源基因,应用同源重组的方法构建了突变株(△luxR),并对其功能进行初步研究.实验结果表明,△luxR与野生型菌株相比产生的群体感应信号分子浓度降低,抗生素耐受水平有所提高,对哈密瓜(Cucuumis melo var.cantalupensis))幼苗的致病能力下降;RT-PCR实验表明,luxR基因的缺失对luxI基因的表达有抑制作用.本研究为今后对以luxR基因为靶标,利用信号干扰技术综合防治瓜类细菌性果斑病提供基础资料.     

应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因

植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化菌株 Po82 兼具 2 号小种和 NPB(非香蕉致病)菌株的致病特征。为了研究该菌株致病力分化机理,本实验以 Po82 为待测菌株,构建了抑制性差减杂交文库。建库质量分析结果表明,具有较高的接头连接以及文库构建效率,插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序,共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明,所得差异基因主要涉及新陈代谢、转座酶、膜结构、分泌蛋白、毒力、转录因子以及未知功能等。利用基因敲除技术对其中的 c00283 基因功能进行了研究,结果表明,该基因在 Po82 菌株致病过程中起重要作用。半定量 RT-PCR 结果表明,c00283 基因在 hrp 诱导培养基中的表达情况与 hrpB 基因一致,初步确定其为Ⅲ型分泌系统效应子。基础生物学实验结果表明,该基因对 Po82 菌株的生长、生物膜形成及运动性没有影响。青枯菌 Po82 菌株抑制性差减杂交文库的构建及致病相关基因的功能分析,为后续致病力分化的分子机理研究提供基础材料。     

青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株构建及其生物学特性

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌,为研制植物疫苗菌剂提供遗传稳定且突变位点明确的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,本研究利用EZ-Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库,通过电击转化,筛选获得13株具有无致病力菌株形态的突变株。研究了其中5株突变株的插入位点和生物学特性,结果表明,其插入位点分别位于phcA和pchS基因,其生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91,而最适pH值和温度未改变。其发酵液经分光光度计扫描,结果显示,突变株在同一波长下的光吸收值均大于Rs91,经聚类分析,显示它们与Rs91可聚为不同的3类,即Rs91为第Ⅰ类,phcA基因突变株为第Ⅱ类,phcS基因突变株为第Ⅲ类。经番茄(Lycopersicon esculentum)盆栽苗致病力检测,15d后均未发病,确定为无致病力青枯雷尔氏菌。本研究为研制防治青枯病的植物疫苗菌剂提供了基础资料。     

福建省青枯雷尔氏菌无毒基因组成及与致病力关系分析

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化严重.为了解福建省青枯雷尔雷氏菌的致病力类型及与无毒基因组成关系,本研究以弱化指数为指标,对福建省内不同地区和寄主的63个青枯雷尔氏菌进行致病力测定,结果表明,供试的青枯雷尔氏菌可分为3种致病力类型:强致病力、过渡型和无致病力;进一步对供试菌株进行无毒基因avrA、popP1和popP2的检测,3个无毒基因分布频率不同,avrA基因分布频率最高,达79.37％,popP1基因的分布频率最低为46.03％;不同寄主的菌株无毒基因组成不同,番茄(Lycopersicum esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)寄主以分布3种和2种无毒基因为主,茄子(Solanum melongena)寄主主要分布2种无毒基因,花生(Arachis hypogaea)寄主的菌株无毒基因分布较少,只分布1种avrA基因或没有检测到无毒基因;不同地域的菌株无毒基因组成不同,以番茄寄主为例,建瓯玉山镇的菌株分布3种和2种无毒基因为主,分别占45.45％和31.82％,宁德屏南菌株中3个无毒基因均等分布,福州北峰菌株中只分布avrA和popP2基因,二者均等分布,福州营口菌株中popP2基因分布频率最高,达60.00％;不同致病力的菌株无毒基因组成不同,无致病力菌株分布3种和2种无毒基因为主,过渡型菌株分布2种无毒基因为主,而强致病力菌株分布1种无毒基因为主;青枯雷尔氏菌的无毒基因组成与致病力相关性分析表明,3个无毒基因分布均与致病力呈正相关,其中popP1基因与菌株致病力相关性最高,达显著水平,其皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient,PCC)值为0.31.本研究为植物青枯病预警和防控提供重要信息.     

六种重要瓜类种传细菌可视基因芯片筛查方法研究

种传细菌是瓜类作物及健康种子生产中关注的重要对象。针对细菌性白枯病菌(Pseudomonas viridiflava)、细菌性角斑病菌(P.syringae pv.lachrymans)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)、瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli)、细菌性叶斑病菌(Xanthomonas cucurbitae)、甜瓜黄单胞菌(X.melonis)6种重要瓜类种传细菌,利用多重PCR扩增及后续可视芯片检测技术,建立了可视基因芯片筛查方法。实验结果表明,以细菌纯培养液为模板,6种目标菌检测灵敏度平均可达N×103～N×104CFU/mL,并能从人工模拟带菌的西瓜(Citrullus vulgaris)、甜瓜(Euphorbia meloformis)、黄瓜(Cucumis sativus)的种子样品及自然感染瓜类果斑病菌的西瓜种子中检测到目标细菌。该研究为瓜类种传细菌的快速初筛及健康种子质量控制提供了新手段。     

瓜类细菌性果斑病菌过敏性反应和致病性(hrp)基因簇部分基因的克隆及功能分析

过敏性反应和致病性(hrp)基因存在于革兰氏阴性植物病原细菌中,决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应(hypersensitive response,HR)。本研究从果斑菌(Acidovorax avenaesub sp.citrulli)的hrp基因簇中克隆了hpaA、hrcT、hrcC和hrpG基因,通过同源重组的方法,分别构建了其突变体。电镜观察发现,hpaA和hrpG基因突变体的鞭毛缺失且细胞形态发生显著变化,而hrcT和hrcC基因突变体的鞭毛和细胞形态未发生明显变化。在烟草(Nicotiana tabacam)和哈密瓜(Hami cantaloupe)叶片上的测定结果显示,hpaA、hrcT和hrcC的突变体均失去在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜叶片上的致病性;hrpG在烟草上的HR激发能力和在哈密瓜上的致病性则显著减弱;进一步的生长曲线测定结果表明,hpaA、hrcT、hrcC和hrpG的突变体的定殖能力均显著下降。相应地,功能互补后突变体基本恢复至野生表型。证明瓜类细菌性果斑病菌hrp基因作为Ⅲ型分泌系统关键组份影响病原细菌对寄主植物的致病性和对非寄主及抗病植物的过敏性...     

野油菜黄单胞菌8004菌株hrp基因簇侧翼序列大片段缺失突变体的构建及表型分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestrispv．campestris，简称Xcc），是一类能在全球范围引起十字花科植物黑腐病的γ变形菌纲细菌。该菌有一个长41．7kb的Hrp致病岛，包含41个开放阅读框（0RF）。Hrp致病岛5’端边界为ISl479插入元件，3’端边界为ISl595插入元件。G＋C含量为62．3％，明显低于全基因组64．9％的G＋C含量。根据基因类型，将该致病岛分为三个区段：位于致病岛中心区的hrp基因簇、及其左侧翼的假定基因区段（HGR）和右侧翼的降解酶类基因区段（EGR）。HGR长7．4kb，注释蛋白编码基因6个，全部为功能未知的假定基因。EGR长9．3kh，注释蛋白编码基因8个，其中6个为降解酶类基因。为了鉴定hrp基因簇侧翼序列的功能，采用标记置换的突变方法，将Xcc 8004的hrp基因簇右侧翼EGR片段缺失。该突变体8004△R对寄主植物的致病力比野生型菌株显著降低，而在非寄主植物辣椒ECW-10R上仍能引起过敏反应。该突变体其它的致病相关生化因子，如胞外多糖产量和胞外酶的活力均未受明显影响。实验结果表明EGR区段的缺失不影响三型分泌系统的正常功能，也不影响该菌在基本培养基上的生长，但使Xcc的致病力明显降低，提示Xcc8004菌株hrp基因簇右侧翼序列中存在与致病相关的基因。