胚胎干细胞在动物克隆中的应用

自Ｅｖａｎｓ和Ｋａｕｆｍａｎ(1981)从延迟着床的胚胎中分离出小鼠胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＥＳ细胞 )以来 ,ＥＳ细胞一直备受人们的关注〔1〕。 1998年 ,由基隆公司资助的汤姆森研究小组在《科学》杂志上发表了关于人的ＥＳ细胞建立等一系列工作之后 ,基隆公司的股票更是狂升了 6倍 ;1999年、2 0 0 0年 ,干细胞研究两度被美国《科学》杂志推举为2 1世纪最重要的研究领域 ;1999年 ,美国《科学》杂志还将干细胞研究评为当年世界十大科学成就之首。由此足以显示干细胞的魅力 ,而干细胞之所以如此吸引人们的注意 ,…     

动物体细胞克隆研究进展

克隆 (Cloning)就是无性系或无性繁殖系 ,也就是由一个细胞或个体以无性方式重复分裂或繁殖所形成的一群细胞或一群个体。在不发生突变的情况下 ,一个克隆内的所有成员具有完全相同的遗传结构。随着现代科学技术的进步 ,克隆的概念有了很大的扩展 ,包括基因克隆、细胞克隆和个体(主要是动物 )克隆。动物克隆即动物的无性繁殖 ,指借助于核移植技术 ,将供体细胞核移入去核的卵母细胞中 ,使后者不经过精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育为个体 ,使得核供体的基因得到完全复制。根据核供体的来源不同 ,动物克隆可分为胚胎细胞克隆与体细…     

外在行为导致克隆动物不正常

俄科学院的科研人员在分析了老鼠单细胞胚胎细胞核移植前后钾离子浓度变化后发现，针对卵细胞进行的任何外在行为，必将破坏它的生物化学平衡，导致胚胎细胞正常发育进程的改变。因此，对卵细胞的任何行为不可能不留下痕迹。     

山羊PGCs用于分离与克隆类ES细胞

选择健康成年本地白山羊，自然发情，配种后44d取胎儿，以传统的原始生殖细胞（PGCs)分离与克隆的方法和PGCs与其胎儿生殖嵴周围组织细胞共同培养的方法获得类胚胎干细胞（类ES细胞），并对山羊类ES细胞在不同饲养层上进行培养。结果表明，采用传统方法与共培养的方法并添加细胞因子均能分离获得类ES细胞。分离获得的类ES细胞在同源（山羊）胎儿细胞饲养层上生长效果较好，可传4代或5代，而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上类ES细胞仅传3代。另外，共培养不添加细胞因子组仅获1个ES细胞集落，传代后丢失。     

动物克隆胚胎安全生产

<正>动物克隆胚胎安全生产是指在动物克隆胚胎生产过程中,为了避免人员人身伤害、财产损失以及胚胎无效生产等生产事故的发生,采取一系列事故预防和控制措施,保障人员安全与健康、设施设备免受损失、克隆胚胎高效生产的相关活动。克隆胚胎安全生产主要涉及前期准备、细胞培养、卵母细胞收集、卵母细胞体外成熟、核移植、胚胎体外培养六大环节,每个环节均是保障克隆胚胎顺利生产必不可少的条件,而每个环节都会涉及一些具体的安全问题。     

影响核移植克隆胚胎效率的因素分析

影响核移植克隆胚胎效率的因素分析刘林，安民（北京农业大学动物科技学院１０００９４）一、前言＊采用核移植技术扩增遗传上优秀的哺乳动物胚＊胎，对于提高动物生产力具有巨大潜力。近年来哺乳动＊物核移植技术取得了很大进展。已经获得了包括大家＊畜在内的多种动物的...     

动物克隆与克隆技术

自从克隆羊“多莉”诞生之后，克隆一词便成为了传媒追逐的热点，那么究竟什么是克隆呢?克隆一词源于英“Clone”的中译音，意为无性繁殖，即通过非有性的过程复制个体，不通过性细胞结合而繁殖的过程。植物的克隆现象很常见，植物块茎的自然繁殖、扦插、压条和嫁接都属于无性繁殖，均属于植物的克隆行为。动物克隆则不同，     

山羊类ES细胞的分离与克隆

采集山羊交配后6～8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞(PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后,将各自一半胚胎切割,把含ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养,另一半整胚在各自饲养层上继续培养,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当ICM增殖一定程度时进行传代,以比较其类ES细胞分离与克隆的效果。结果表明,在2种不同饲养层上,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚,囊胚的脱带率均高于桑椹胚,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在PMEF还是在PGEF饲养层上,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚,而贴壁率高于脱带整胚,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在PMEF饲养层上所获类ES细胞只能维持3代,而在PGEF饲养层上,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类ES细胞传至5代。由此认为,对脱带后的胚胎进行切割处理,有利于ICM的贴壁和增殖;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统,有利于类ES细胞的分离与克隆。     

兔核移植胚胎的克隆研究

本研究改进了兔受体卵母细胞的去核程序及供体卵裂球的处理方法，并对核移植胚的体外克隆、继代克隆及克隆胚的体内发育进行了试验。结果表明：卵龄对受体卵母细胞的去核具有显著的影响，卵龄为１５～１８ｈ的去核率为１００％（４５／４５），显著高于１３～１４ｈ的４６．６％（７／１５），Ｐ＜０．０１。ＤＮＡ合成抑制剂Ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ处理１６－细胞期卵裂球后，重组胚的囊胚发育率５４％（２０／３７）高于未处理组的４５％（１４／３１），Ｐ＜０．０５。从２枚１６－细胞供体胚分别获得来自一个供体胚的９枚和７枚核移植克隆囊胚，囊胚发育率为５１．６（１６／３１）。然而第一次继代核移植胚的囊胚发育率仅为１１．５％（６／５２）。１６－及３２－细胞期卵裂球的重组胚可发育至产仔，共获２窝８只仔兔。其中１只、２只、２只和３只仔兔分别来自４个供体胚。     

异种动物核移植研究进展

异种核移植作为新型发展起来的动物繁殖技术 ,在畜牧生产、医学、生物学领域愈来愈表现出其巨大的价值。人们以前已经进行了一系列的探索 ,如在供体细胞方面 ,人们尝试使用了包括肝脏细胞、乳腺细胞在内的各种类型的细胞 ,并采取各种措施处理供体细胞 ;而对于受体细胞多采用卵泡 -卵丘复合体进行体外培养或通过超排获得 ;比较各种融合方法 ,目前多采用电融合方法 ,也较化学融合、病毒介导融合等方法简单 ;至于重构胚的培养则多采用培养液体外培养的方法 ,此方法操作简单 ,也比较容易观察记录实验过程。同时也指出异种核移植仍存在如克隆的效率很低等一系列急待解决的问题     

小鼠胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代研究

对影响小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES细胞）培养、克隆、分离、传代效果的因素进行了探索研究。应用223枚昆明白小鼠胚胎和20枚129品系小鼠胚胎的研究结果表明，129品系小鼠胚胎比昆明白小鼠胚胎更适合作为ES细胞建系的材料，两者FS出现率差异显著（P＜0．05）；以DMEM＋10％NBS＋10％FCS为基础培养液，分别加入LIF、胰岛素、LIF＋SCF，极显著提高昆明白小鼠胚胎贴壁率，ICM生长率及F1、F2出现率（P＜0．01），而在DMEM＋10％NBS＋10％FCS＋LIF＋SCF为培养液，得到昆明白小鼠胚胎最高贴壁率、ICM生长率及传代率；4dpc胚胎传代情况显著好于3．5dpc胚胎（P＜0．05）。     

体细胞克隆太湖猪出生

以中国太湖猪胎儿成纤维细胞为核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,以杜洛克猪为代孕母猪,进行了太湖猪体细胞克隆技术的研究,成功地获得了首例体细胞克隆太湖猪仔猪.经微卫星DNA多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系.本研究将为体细胞克隆技术在我国太湖猪育种、建立人类疾病模型等研究方面提供可行的技术方法.     

核移植技术在建立乳腺生物反应器中的应用

乳腺生物反应器的开发为制药业带来了生机,但目前采用的动物基因转移的方法,由于其各自固有的局限性,未能使得乳腺生物反应器的研究取得长足的进步。而核移植技术的发展为乳腺生物反应器的开发注入了活力。因此,笔者综合近年来国内外的文献,提出了核移植中供体细胞的选择以及处理方法,同时也从分子水平阐述了乳腺的一些调控机制,为核移植技术在乳腺生物反应器中的应用奠定了基础。     

猪体细胞核移植胚体外发育初步研究

采用胞质内注射法进行猪体细胞核移植，对去核、激活和培养等关键技术过程进行研究。结果表明：（1）点压法、挤压法对卵母细胞的去核率明显高于盲吸法（三者分别为62．5％、64．6％、50．7％，P〈0．05）。对早成熟的卵母细胞（36-44h）进行去核可明显提高去核效率（P〈0．05），在36-38h、39-41h、42-44h去核率分别为60．9％、67．8％、64．3％，而45-48h为48．4％。（2）体细胞预激活有助于提高核移胚卵裂率（28．0％、20．1％，P〈0．05）。钙离子载体A23187单独或与6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）联合作用能使猪体细胞核移胚激活继续发育。（3）核移胚以胚胎培养液NCSU23及卵丘单层共培养体系进行分别培养，核移胚卵裂率无明显差异（30．06％、31．5％，P〉0．05）。但NCSU23培养4细胞后发育能力更高（13．5％、3．9％，P〈0.05）。     

Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos

Background： Production of chimeric mice is a useful tool for the elucidation of gene function. After successful isolation of embryonic stem （ES） cell lines, there are many methods for producing chimeras, including co-culture with the embryos, microinjection of the ES ceils into pre-implantation embryos, and use of tetraploid embryos to generate the full ES-derived transgenic mice. Here, we aimed to generate the transgenic ES cell line, compare the production efficiency of chimeric mice and its proportion to yield the male chimeric mice by microinjected ES cells into 4- to 8-cell and blastocysts embryos with the application of Piezo-Micromanipulator （PMM）, and trace the fate of the injected ES cells. Results： We successfully generated a transgenic ES cell line and proved that this cell line still maintained pluripotency. Although we achieved a satisfactory chimeric mice rate, there was no significant difference in the production of chimeric mice using the two different methods, but the proportion of the male chimeric mice in the 4- to 8-cell group was higher than in the blastocyst group. We also found that there was no tendency for ES cells to aggregate into the inner cell mass using in vitro culture of the chimeric embryos, indicating that they aggregated randomly. Conclusions： These results showed that the PMM method is a convenient way to generate chimeric mice and microinjection of ES cells into 4- to 8-cell embryos can increase the chance of yielding male chimeras compared to the blastocyst injection. These results provide useful data in transgenic research mediated by ES cells.     

Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos

Background

Production of chimeric mice is a useful tool for the elucidation of gene function. After successful isolation of embryonic stem (ES) cell lines, there are many methods for producing chimeras, including co-culture with the embryos, microinjection of the ES cells into pre-implantation embryos, and use of tetraploid embryos to generate the full ES-derived transgenic mice. Here, we aimed to generate the transgenic ES cell line, compare the production efficiency of chimeric mice and its proportion to yield the male chimeric mice by microinjected ES cells into 4- to 8-cell and blastocysts embryos with the application of Piezo-Micromanipulator (PMM), and trace the fate of the injected ES cells.

Results

We successfully generated a transgenic ES cell line and proved that this cell line still maintained pluripotency. Although we achieved a satisfactory chimeric mice rate, there was no significant difference in the production of chimeric mice using the two different methods, but the proportion of the male chimeric mice in the 4- to 8-cell group was higher than in the blastocyst group. We also found that there was no tendency for ES cells to aggregate into the inner cell mass using in vitro culture of the chimeric embryos, indicating that they aggregated randomly.

Conclusions

These results showed that the PMM method is a convenient way to generate chimeric mice and microinjection of ES cells into 4- to 8-cell embryos can increase the chance of yielding male chimeras compared to the blastocyst injection. These results provide useful data in transgenic research mediated by ES cells.     

克隆种公猪生长状况和繁殖性能评价

体细胞核移植技术可以成功用于克隆性能优良的种用家畜,理论上克隆个体与供体在遗传上是完全相同的。为验证该理论,本试验检测了克隆种公猪自身在出生后的生长发育指标以及克隆种公猪与供核种公猪精液品质各项指标、情期受孕率、窝产仔数、产活仔数、断奶活仔数、仔猪初生重、仔猪断奶重和平均日增重等指标,探讨了克隆种公猪与供核种公猪在繁殖性能以及遗传性能之间的关系。结果显示,克隆种公猪与供核种公猪在各检测指标之间均不存在显著差异(P>0.05),提示克隆种公猪与供核种公猪在繁殖性能和遗传性能上无显著差异,可以作为种公猪用于扩繁。     

应用体细胞克隆技术和胚胎移植技术生产克隆水牛

为了解决克隆水牛技术在供核细胞、受体细胞中的选用问题,探索不同条件对移植受孕的影响,完善克隆技术的理论体系。试验以摩拉奶水牛的耳成纤维细胞作为供核细胞,本地水牛卵母细胞为受体胞质进行细胞克隆构建重组胚胎;将发育5～10 d的重组胚胎移植于本地水牛、杂交水牛的子宫内,观察不同发情方式、胚胎类型、胚龄及季节对移植受孕的影响。结果表明:水牛的克隆胚胎妊娠率较低,分别为12.05%、12.04%、13.95%。自然发情和同期发情对克隆胚胎移植受胎率的影响差异不显著;鲜胚胎移植186头,受胎22头,受胎率为11.83%(22/186);冻胚胎移植174头,受胎23头,受胎率为13.22%(23/174)。克隆水牛从出生至12月龄体尺增长明显高于本地水牛;水牛克隆胚胎移植受胎在秋季最好,秋季受胎数占全年的53.33%,显著高于其他季节。     

Production of stem cell factor in canine mast cell tumors

Mast cell tumor (MCT) is the most common cutaneous tumor in dogs. We recently revealed that production of stem cell factor (SCF) contributes to the proliferation of neoplastic mast cells in an autocrine/paracrine manner. The aim of the present study was to determine the contribution of the mechanism in clinical MCTs. In consequence, high SCF expression (>10 times compared to HRMC cells) was observed in 5 of 7 MCT samples used in the study regardless of KIT mutation, which was confirmed in immunohistochemical analysis. In addition, production of SCF was observed in Ki-67-positive cells in the MCT xenograft. These results indicate the broad contribution of SCF autocrine/paracrine mechanism on clinical MCTs, providing the rationale for the clinical use of KIT inhibitors regardless of KIT mutation.     

猪孤雌胚胎干细胞建系的研究

以猪孤雌激活囊胚为材料,囊胚透明带消化后采用全胚培养,培养液中添加不同培养成分或因子（如FGF2,LIF,2i等）,以及选择不同的初始培养液体积来筛选猪胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）建系的优化培养体系。囊胚内细胞团形成的细胞集落采用胰酶消化传代。结果显示：透明带消化后,囊胚贴壁率显著升高（19．4％VS．8．8％）（P〈0．05）;初始培养液体积比平常培养液体积（0．30mL／孔,24孔培养板）减半条件下,能显著提高其贴壁率（91．7％VS 20．0％）（P〈0．01）,而且获得了可传至7代的类ES细胞系2株,碱性磷酸酶染色成阳性;当用2i因子（CHIR99021和PD03025901）去替代培养液中的FGF2,囊胚贴壁率（29．400VS53．3％）和原代集落形成率（20．0％VS 87．5％）反而显著下降（P〈0．01）。这表明培养液添加了FGF2和LIF（不舍2i因子）,用24孔板培养,最初培养体积为0．15mL,透明带消化的培养体系比较适合猪孤雌激活胚的ES细胞建系。