16S rRNA/rDNA序列分析技术在瘤胃细菌微生态系统研究中的应用

作者指出了反刍动物瘤胃细菌微生态系统研究的难点，介绍了细菌分类学中新兴的分子生物学指标（16S rRNA/rDNA序列同源性），综述了16S rRNA/rDNA序列分析中所采用的分子生物学方法和技术，并阐述了瘤胃分子微生物学研究的流程。     

16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用

细菌的16S核糖体RNA（ribosome RNA,rRNA）以其在进化上的特征性序列,现已被广泛用于细菌分类和鉴定的分子指标。其具体操作是,以聚合酶链式反应（PCR）分离细菌样本中的16SrRNA的基因片段,通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得其序列信息,再与16SrRNA数据库中的序列数据进行比较,确定其在进化中的位置,从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。文章综述了16SrRNA作为微生物系统分子分类鉴定的理论基础和方法,以及在细菌分类鉴定中的应用。     

18S rRNA／rDNA序列分析技术在瘤胃原虫分类学研究中的应用

作者指出了反刍动物瘤胃原虫分类学研究中的难点，介绍了原虫分类学中新兴的分子生物学指标(18S rRNA／rDNA序列同源性)，综述了18S rRNA／rDNA序列分析技术在瘤胃原虫分类研究中的应用。     

瘤胃微生物生态研究方法评述

瘤胃微生物生态研究方法主要经历了微生物纯培养、混合培养、微生物分子生物学技术[(从瘤胃中提取DNA,进行PCR-16S rDNA(rRNA)技术]、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术),在不同程度上揭示了瘤胃微生物群落丰富的多样性和生态功能.但由于各种方法本身的局限性,限制了人类对瘤胃微生物的全面了解,现代生物技术和传统微生物研究方法的配合将为瘤胃微生物生态研究提供较好的前景.     

两种山羊瘤胃纤维分解菌16S rDNA序列的体外扩增和鉴定

从山羊瘤胃内容物中提取瘤胃细菌总DNA,以瘤胃中两种主要纤维分解菌为目的菌种,分别依据其16S rDNA序列设计引物,利用PCR技术对其16S rDNA 进行体外扩增,对扩增产物测序后进行同源性分析.结果表明:以提取的瘤胃细菌总DNA为模板,采用PCR技术可成功地从山羊瘤胃内容物中扩增出黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌16S rDNA的特异性片段;测序后与GenBank中的序列进行比对,表明黄色瘤胃球菌与原序列(AF104841)的同源性达到99.4%,产琥珀酸丝状杆菌与原序列(AJ505937)的同源性达到94.6%.     

16SrRNA/rDNA序列分析在瘤胃微生物区系研究中的应用

随着rRNA为主的分子生物学技术在瘤胃微生态研究中的不断应用与发展,动物瘤胃内环境微生物区系研究进入了一个新阶段,为动物营养学研究技术的发展提供了新的可靠的方法和手段。笔者综述了rRNA／rDNA序列分析技术应用于瘤胃微生物区系研究中的理论依据,以及该项技术在瘤胃微生物区系分析中的应用现状和前景。     

16S rRNA、23S rRNA及16S～23S rRNA基因在细菌分离与鉴定中的应用

在细菌的进化过程中,rRNA结构既具保守性又具高变性.保守性反映生物物种的亲缘关系,高变性则揭示生物物种的特征核酸序列,rRNA是属种鉴定的分子基础.因此,可以利用保守区设计通用引物扩增细菌的相应靶序列,再利用可变区的差异鉴别菌种,文章就16S rRNA、 23s rRNA和16S～23S rRNA基因在细菌分离与鉴定中的应用做以下综述.     

牛泰勒虫18S rRNA基因序列比较研究

作者对中国兽医微生物菌种保藏中心原虫资源库内收藏的3种牛源泰勒虫10个地方分离株(包括4株环.形泰勒虫、3株瑟氏泰勒虫和3株中华泰勒虫)的18S rRNA基因序列进行了测定,并用所测得的牛的泰勒虫中国株基因序列和自GenBank下载的各种泰勒虫18S rRNA基因序列构建了系统发生树.结果显示;牛的3种泰勒虫18S rRNA基因大小在1 740～1890 bp,并有规律地分布于3个不同的进化枝上,且种内地方分离株之间的同源性明显大于种间同源性,说明采用18S rRNA基因序列测定方法对牛的泰勒虫进行分类与传统分类方法具有较好的符合性.该研究也可为建立针对18S rRNA基因为靶标的牛的泰勒虫病PCR检测方法奠定基础.     

山羊瘤胃嗜淀粉瘤胃杆菌16S rDNA序列体外扩增鉴定

以嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus) 目的菌种,依其16S rDNA序列(Y15992)设计特异引物,进行PCR扩增,并测序后进行同源性分析.结果表明,特异性引物成功扩增出的嗜淀粉瘤胃杆菌DNA的特异性片段.与基因库中原序列具有较高的同源民性(96.9%).说明利用这种方法可以对山羊瘤胃微生物进行鉴定和分析.     

四种主要肉源动物肌肉组织16S rRNA基因的扩增及序列分析

为了研究牛、羊、鸡、猪四种主要肉类物种16S rRNA基因序列之间的差异及进化关系,进而为餐饮市场肉类的鉴定建立方法基础,试验合成了1对16S rRNA基因通用引物,通过PCR方法扩增了牛、羊、鸡、猪四种动物肌肉组织的16S rRNA基因并进行了序列和进化树分析。结果表明:所采用的PCR扩增体系和条件均能很好地扩增出四种动物的16S rRNA基因;与Gen Bank中各自对应物种的标准序列均具有99%以上的同源性,同源性较高;序列间富含174个位点的差异或插入缺失,同源性较低。在物种进化关系上牛、羊最近,其次是猪,最后是鸡。表明16S rRNA基因种属特异性显著,可以作为基因条形码的候选基因,可利用该基因建立相应的分子诊断方法,用于对肌肉组织进行物种的鉴定。     

基于16S rRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃细菌多样性

本试验旨在对以柞树叶为主要粗饲料来源的梅花鹿瘤胃细菌多样性进行分析。提取瘤胃微生物基因组DNA,扩增细菌16S rRNA基因,构建16S rRNA基因克隆文库,分析梅花鹿瘤胃细菌区系组成。结果表明:1)试验共得到107个非嵌合体16S rRNA基因序列。按照97%序列相似性,划分为22个分类操作单元(OTUs)。其中91个序列(10个OTUs,85%总克隆序列)与已培养菌序列相似性≥97%,13个序列(10个OTUs,12.2%总克隆序列)与已培养菌序列相似性为90%~97%,其余序列相似性<90%。87.9%序列与普雷沃氏菌属(Prevotella spp.)相似。2)系统发育分析表明,梅花鹿瘤胃细菌由厚壁菌门和拟杆菌门组成。由结果可知,以富含单宁的柞树叶为主要粗饲料来源的梅花鹿的瘤胃中,普雷沃氏菌属是优势细菌,而牛、羊瘤胃中常见的纤维素降解菌未检测到,这可能与饲料中单宁含量高有关。     

基于16S rRNA基因克隆文库技术分析广西富钟水牛瘤胃产甲烷菌组成及多样性

本研究旨在利用16S rRNA基因克隆库技术分析广西富钟水牛瘤胃产甲烷菌组成及多样性。选取3头体况基本一致的健康雌性富钟水牛作为试验动物,采用机械破壁法提取瘤胃内容物总DNA,采用产甲烷菌引物Met86F/Met1340R扩增16S rRNA基因,构建16S rRNA基因克隆文库。结果表明,本试验共获得93个非嵌合体16S rRNA序列,按照97%的相似性划分为39个分类操作单元（OTU）。其中,60个序列（15个OTU）与已培养细菌16S rRNA序列相似性≥97%,占总序列的64.5%;32个序列（23个OTU）与已培养菌16S rRNA序列相似性处于90%^<97%;仅有1个序列与Methanomassiliicoccus luminyensis相似性<90%。系统发育树分析表明,98.9%的序列均属于甲烷杆菌目（Methanobacteriales）,部分序列与Methanobacteriales中任何已知相似序列都相隔较远,它们可能代表Methanobacteriales中新的属或种。由上述结果可见,富钟水牛瘤胃产甲烷菌以Methanobacteriales为优势菌群,其中有许多未知的产甲烷菌需进一步分离培养并对其功能进行分析。     

16S-23S rRNA基因间隔序列PCR及RFLP对奇异变形杆菌分离株的鉴别与系统发育分析

根据临床常见致病菌16S-23S rRNA基因间隔序列(ISR)两端的16S及23S rRNA保守序列设计PCR扩增的通用引物,对9株奇异变形杆菌和6株相近菌株应用通用引物PCR扩增16S-23S rRNA ISR序列.通过PCR长度多态性比较、RFLP分析以及部分序列测序比较,分析鉴别奇异变形杆菌.结果显示,PCR长度多态性可以将奇异变形杆菌同其余菌种进行区分;RFLP分析可以将所有试验菌种进行区分;部分序列测序可以对奇异变形杆菌进行分型.由此表明,16S 23S rRNA ISR序列PCR及RFLP分析可以简单、快速、准确的鉴定奇异变形杆菌.     

16S rRNA基因测序法鉴定猪多杀性巴氏杆菌的研究

对66株猪多杀性巴氏杆菌的鉴定结果表明,PCR是一种快速、特异、灵敏的病原检测方法。应用能够扩增大多数原核生物16S rRNA基因的通用引物,对猪多杀性巴氏杆菌疫苗株(EO630)和野外分离株的16S基因rRNA进行PCR扩增,以期为分子水平上准确地鉴别猪巴氏杆菌提供依据。     

鸭疫里默氏杆菌巢式PCR检测方法的建立

为建立一种更加准确、敏感的鸭疫里默氏杆菌检测方法,根据鸭疫里默氏杆菌16S rRNA基因序列设计2对巢式PCR引物,在完成最佳反应条件筛选、特异性、敏感性、重复性试验的基础上,建立巢式PCR检测方法.结果表明,建立的巢式PCR对1、2、10、X型鸭疫里默氏杆菌的16S rRNA都能扩增出特异性片段,而对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门菌、鸭源金黄色葡萄球菌的基因组不能扩增出特异性片段,DNA最小检测量为0.392 fg/μL,是常规PCR的1 000倍.该巢式PCR方法具有快速、敏感、特异、通用的优点,可用于鸭疫里默氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定.     

兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立

为建立一种快速准确检测兔多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的PCR方法,本研究以P.multocida的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的P.multocida的16S rRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了P.multocida PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60 cfu/mL,采用该PCR方法扩增P.multocida标准株和分离株均能扩增出643 bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本实验所建立的P.multocida PCR检测方法快速、敏感、特异、可靠,可用于P.multocida的快速鉴定与诊断。同时用建立的PCR方法对临床疑似病兔的脏器分离菌进行扩增,可扩增出目的条带,与细菌的分离结果相一致。     

仔猪常见12种致病菌的23S rRNA基因序列分析

以107条从NCBI下载和测序的12种仔猪常见致病菌的23S rRNA基因序列为研究对象,运用DNASTAR软件进行系统发育分析.结果显示:以各种细菌的23S rRNA基因代表序列所进行的种间序列分析结果与伯杰氏细菌分类手册和http://www.wiki.cn/wiki/细菌分类表的分类结果一致,也与这12种菌的16S rRNA基因序列分类结果一致. 因此,在23S rRNA基因序列保守区设计通用引物,在其变异区设计各种细菌特异性探针,用PCR捕捉被检样品中未知细菌的23S rDNA片段并与种特异性23S rRNA基因探针进行杂交,有可能将未知细菌鉴定到种.     

利用16S rRNA测序、PCR-DGGE和qRT-PCR方法分析肉牛瘤胃上皮细菌群落特征

目前对于附着于瘤胃上皮的细菌群落及其功能了解较少,本研究目的是利用16S rRNA测序、PCR-DGGE和qRT-PCR方法比较分析肉牛瘤胃上皮与瘤胃内容物细菌群落的多样性差异.从6个16S rDNA(～1.4 kb)文库中随机选取2785条序列,结果表明3个瘤胃内容物文库与3个瘤胃上皮文库的细菌群落存在差异.以97％的序列相似度进行计算,结果发现瘤胃内容物菌群文库的多样性指数(4.12/4.42/4.88)比瘤胃上皮组织菌群文库的多样性指数(2.90/2.73/3.23)高.厚壁菌门和拟杆菌门分别是瘤胃上皮组织和内容物的优势菌群,纤维杆菌门、浮霉菌门和疣唯菌门仅在瘤胃内容物中存在.通过PCR-DGGE对22头阉牛瘤胃内容物和瘤胃上皮的细菌群落分析,进一步证实瘤胃上皮栖息着一类以厚壁菌为主的独特菌群,这类菌不仅具有消化饲料的作用,还有其他未知功能.     

家蚕核糖体18S RNA基因的序列分析及分子系统学研究

为研究家蚕18S DNA基因的特点及分子进化,以家蚕丝腺为材料提取家蚕基因组DNA,通过PCR扩增、测序鳞翅目家蚕(Bombyx mori)核糖体小亚基18S RNA基因(18S rDNA)的全序列,将该序列与等翅目、直翅目、衤责翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目、捻翅目、弹尾目、蜉蝣目各一种昆虫的18S rDNA进行了比较。用DNAstav软件分析并进行序列比对,结果表明,昆虫18S rDNA有4段序列较为保守,以18S rDNA比对的第2保守区段构建的分子系统发育树表明鳞翅目和双翅目、膜翅目、鞘翅目进化关系最近,等翅目、直翅目、衤责翅目进化上较为接近,捻翅目昆虫与弹尾目昆虫的亲缘关系较为接近,捻翅目在分类上应是一种古老的昆虫。     

仔猪12种致病菌的16 S rRNA分析

研究仔猪12种致病菌的16 S rRNA基因序列,分析其亲缘关系,为设计其16 S rRNA基因的诊断探针提供理论依据.从美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库中下载332条仔猪12种致病菌的16S rRNA基因序列,应用双序列比对和构建系统进化树的方法对这些序列进行种内分析,选出每种细菌的代表序列,再对代表序列用同法进行种间分析,并将种间分类结果与伯杰氏细菌分类手册(第8版)的分类结果进行比较.从每种细菌的数据库中选出一条接近16 S rRNA基因序列全长,与同种其他序列的核苷酸替代率差异较小的序列为该种细菌的代表序列,进行种间16 S rRNA基因序列系统进化分析,结果与伯杰氏细菌分类手册(第8版)的分类基本一致.该16 S rRNA基因的系统进化分析所提供的信息将用于下一步针对这12种致病菌的16 S rRNA基因诊断探针的设计.