小鼠Foxc2质粒载体的构建及功能鉴定

构建pcDNA3.1-Foxc2真核表达载体,并以脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,探究Foxc2对脂代谢的影响。取孕后15d小鼠腹部脂肪组织提取总RNA,用PCR扩增Foxc2全长序列并连接至pMD18-T载体,测序正确后克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,成功构建pcDNA3.1-Foxc2重组质粒载体。重组质粒转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,通过RT-PCR和Western blotting法检测Foxc2核酸及蛋白表达,同时检测3T3-L1前体脂肪细胞中脂代谢相关基因FAS、ATGL、HSL及PPARγ的表达。结果显示,重组质粒转染组细胞中Foxc2的核酸和蛋白水平均显著高于对照组。同时发现超表达Foxc2显著降低FAS表达,显著升高HSL及PPARγ的表达,但是对ATGL的表达无显著影响,表明Foxc2具有抑制脂肪沉积的功能。     

microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响

【目的】构建靶向梅花鹿胰岛素样生长因子1基因(IGF1)的microRNA真核表达载体,研究microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响。【方法】根据IGF1mRNA序列设计并合成4对premicroRNA前体片段,定向克隆于pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-1、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-3和pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-4;测序分析插入序列的完整性,将重组质粒转染鹿茸软骨细胞,利用相对荧光定量PCR技术检测IGF1mRNA的表达量;在此基础上选择表达量最低的pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒转染鹿茸软骨细胞,Western blotting分析IGF1蛋白的表达水平,MTT法和流式细胞仪检测重组质粒对鹿茸软骨细胞体外增殖和细胞周期的影响。【结果】测序结果显示,构建的4组重组质粒插入片段的碱基序列完全正确。转染pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒后,鹿茸软骨细胞中IGF1mRNA的表达水平均有所下降,其中转染重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2组的表达水平最低,因而筛选重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2为最佳干扰质粒。与对照组相比,IGF1蛋白的表达水平降低;重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2转染组鹿茸软骨细胞的增殖受到抑制,细胞周期S期细胞百分比减少,表明鹿茸软骨细胞停滞在G0/G1期。【结论】梅花鹿IGF1的表达水平受miRNA的调控,表明在鹿茸快速生长过程中,miRNA具有重要的调控作用。     

下调DKK2表达对小鼠子宫内膜基质细胞增殖和凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究RNA干扰Dickkopf-2基因(DKK2)表达对小鼠子宫内膜基质细胞增殖和凋亡的影响。[方法]设计并合成3条针对DKK2基因的siRNA,在转染试剂LipofectamineTM2000介导下转染小鼠子宫内膜基质细胞,用RT-q PCR法检测转染前、后DKK2基因的表达量,筛选干扰效率最高的1条siRNA。用该siRNA转染小鼠子宫内膜基质细胞24 h,利用Caspase3活性和Annexin-V FITC/PI双染法检测干扰DKK2基因对细胞凋亡的影响;用CCK8细胞计数法检测该siRNA干扰DKK2基因不同时间对小鼠子宫内膜基质细胞增殖的影响。[结果]3条siRNA均能有效抑制DKK2基因的表达,RT-q PCR结果显示DKK2基因表达水平显著降低(siRNA2,P0.05;siRNA1、siRNA3,P0.01);CCK8法结果显示siRNA干扰DKK2后对小鼠子宫内膜基质细胞有明显的抑制作用(24 h、48 h,P0.05);Caspase3活性检测和Annexin-V FITC/PI双染法结果显示,siRNA1转染小鼠子宫内膜基质细胞24 h后,Caspase3活性明显增加(P0.01),细胞凋亡率明显增加(P0.01),凋亡率为18.48%。[结论]利用RNA干扰技术沉默DKK2基因的表达可以明显抑制小鼠子宫内膜基质细胞的增殖并促进凋亡。     

moFcγRⅢ、γ链真核表达载体的构建及其共转染稳定细胞系的建立

将moFeγRⅢ、γ链编码区eDNA分别亚克隆到真核表达栽体pcDNA3的巨细胞病毒启动子下游,构建了重组表达质粒pe3moRⅢ、pe3moγ;用PvuⅠ线性化重组质粒,以线性化重组质粒其转染COS -7细胞,用玫瑰花环试验检测moFeγRⅢ在转染细胞表面的表达,通过G418抗性筛选和单细胞克隆,在转染细胞表面稳定表达...     

PC12细胞诱导的神经缺血细胞Smad7-siRNA及沉默效果的检测

目的探讨诱导PC12细胞分化的神经细胞靶向沉默Smad7基因特性,同时进行沉默效果检测．方法以Smad7基因为靶目标,设计合成3条siRNA序列,进行细胞转染,利用Rea1time—PCR和Westernblot技术检测沉默效果,筛选出最有效的干扰序列,同时检测出最佳的转染浓度和转染时间．结果针对Smad7基因设计合成及筛选出靶向沉默Smad7基因的干扰序列（siRNA1）;siRNA1的最佳转染浓度是4μg／mL;siRNA1的最佳转染时间是24h;siRNA1对Smad7的抑制效果优于其他干扰序列．结论siRNA1能有效沉默Smad7基因;lipofecta—mineTM2000可成功将siRNA1转染至神经细胞,转染效率较高;利用siRNA技术能有效抑制神经细胞．     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

广西巴马小型猪GHRH成熟肽真核表达质粒对小鼠生长效应的影响

【目的】探讨广西巴马小型猪促生长激素释放激素（GHRH）成熟肽真核表达质粒对小鼠生长效应的影响,为进一步研究广西巴马小型猪GHRH成熟肽的促生长作用及GHRH基因疫苗的高效制备与安全使用提供参考依据。【方法】利用基因重组技术将广西巴马小型猪GHRH成熟肽序列与p EGFP-N1质粒连接构建重组真核表达质粒,然后按0.5μg/g的剂量肌肉注射经25%蔗糖溶液预处理的小鼠,观察记录小鼠体重变化情况,并分别提取重组质粒注射组小鼠的心脏、肝脏、肾脏及注射部位肌肉DNA,再以PCR检测是否存在基因质粒残留。【结果】以构建的p EGFP-GHRH重组质粒注射小鼠后,其外源GHRH成熟肽DNA可在肌肉中获得表达,但并未整合入小鼠基因组中。虽然重组质粒注射组小鼠的末重与空质粒注射组小鼠的差异不显著（P〉0.05）,但在注射后的10-25 d,重组质粒注射组小鼠体重均显著高于空质粒注射组（P〈0.05）。在相对日增重率方面,注射后的前15 d内,重组质粒注射组小鼠的相对日增重率均高于空质粒注射组。【结论】构建的广西巴马小型猪p EGFP-GHRH重组质粒能在一定时间内促进小鼠生长,即GHRH种属差异性小,在动物中有较高的保守性。     

猪C3d分子佐剂PRRSV GP5基因核酸疫苗的构建及免疫效果的研究

 【目的】构建猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因C3d-P28分子佐剂重组质粒,探明C3d-P28分子佐剂的免疫增强效果。【方法】用大肠杆菌疫苗对健康猪进行免疫激活,提取猪肝脏总RNA,RT-PCR克隆C3d-P28并连接至pUC19载体,构建pUC19-P28.n（2、4、6）串联体,然后分别将P28.n（2、4、6）连接至真核表达载体pcDNA3.1构建成 pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）。RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,分别定向克隆至pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建pcDNA3.1-GP5-P28.n（2、4、6）重组质粒;提取重组质粒进行双酶切、电泳,同时用重组质粒转染Marc 145细胞,经间接免疫荧光进行蛋白表达检测,并用重组质粒免疫小鼠,通过ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体、IL-4和IFN-γ的水平,检验重组质粒的免疫效果。【结果】从猪肝脏中克隆了C3d cDNA,构建了pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）串联体,并将PRRSV GP5基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建了PRRSV GP5重组质粒（pcDNA3.1-GP5-P28.2、pcDNA3.1-GP5-P28.4、pcDNA3.1-GP5-P28.6）;通过检测小鼠血清中抗体、IL-4和IFN-γ的结果显示,抗体效价、IL-4和IFN-γ含量均比对照组高,且以pcDNA3.1-GP5-P28.6组的效果最好,与空白对照及PCDNA3.1-GP5组比较差异均显著（P<0.05）。【结论】构建了猪补体C3d-P28分子佐剂PRRSV GP5重组质粒,该质粒可刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,补体 C3d-P28分子佐剂能显著增强PRRSV GP5基因的免疫效果。     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

绵羊生长激素基因的克隆、序列分析及真核表达

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从新疆阿勒泰×中国美利奴杂交F1代绵羊脑垂体总RNA扩增出编码绵羊生长激素(oGH)基因序列,T-A克隆入载体质粒pT-Adv.测序结果表明所克隆的oGH cDNA在重组质粒的阅读框架是正确的,共含有654个碱基,其核苷酸序列与已知的3条绵羊序列相比共有7个碱基的差异,除第472位和529位的碱基差异能够引起氨基酸序列的变化外,其余均为无义突变,说明从新疆阿勒泰×中国美利奴杂交绵羊中获得的羊生长激素存在有不同品系间的基因多态性变化.将重组质粒pT-Adv/oGH cDNA定向克隆入真核表达载体质粒pcDNA3.1/myc-HisA,构建成重组oGH基因的真核表达载体pcDNA3.1A/oGH.利用脂质体转染法,将重组质粒导入到小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞中,经间接ELISA检测,证明在转染细胞的上清中存在有目的基因产物的外泌表达.     

牛分枝杆菌ag85b-esat-6融合基因的克隆表达

利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6基因和ag85b-esat-6融合基因,克隆到真核载体pcDNA3.1( )上,构建重组质粒pCAE,将该重组质粒体外转染小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞),间接免疫荧光试验检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功构建了真核表达质粒pCAE,转染后的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b-esat-6融合基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制牛结核病DNA疫苗奠定了基础.     

小鼠RNA结合蛋白QKI-5的生物信息学和组织表达分析及其过表达对癌症相关基因表达的影响

【目的】旨在构建小鼠Quaking基因的主要转录本Quaking-5(Qki-5)的真核表达载体，利用生物信息学软件预测分析其结构与功能特征，检测该基因的组织表达谱，并在小鼠AML12肝细胞系中探究Qki-5过表达对癌症相关基因表达的影响。【方法】提取小鼠肝脏组织的总RNA，反转录为cDNA，通过PCR扩增Qki-5转录本的蛋白编码区（Coding Sequence,CDS）全长，将获得的目的片段与线性化载体pcDNA3.1-Puro-N-3HA进行同源重组连接以获得pcDNA3.1-m Qki-5。通过在线软件对Qki-5基因序列及其编码蛋白进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Qki-5基因在小鼠不同组织中的表达谱，同时使用免疫组织化学技术检测QKI-5蛋白在小鼠肝脏组织的表达分布。之后，将pcDNA3.1-m Qki-5重组质粒和pcDNA3.1-Puro-N-3HA空质粒分别转染至AML12细胞，通过qPCR和Western Blotting(WB)检测Qki-5基因在mRNA和蛋白水平的表达，并进一步检测Qki-5基因在AML12细胞中过表达后对癌...     

牛Nanog基因真核表达载体构建及有效干扰序列筛选

 【目的】构建牛Nanog基因的真核表达载体pVenus-Nanog,筛选对其有效的干扰序列。【方法】以含有牛Nanog基因的PMD-18T-Nanog重组质粒为模板,经PCR扩增目的片段,将其克隆到真核表达载体pVenus上,酶切及测序鉴定正确后命名为pVenus-Nanog。将pVenus-Nanog用脂质体瞬时转染牛皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting分别检测Nanog的表达情况。针对牛Nanog基因的CDS区设计并合成3对干扰序列,分别命名为S1、S2、S3及阴性对照N.C.,用脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA于成纤维细胞,用半定量RT-PCR分析干扰效率。【结果】酶切分析与测序结果表明重组载体pVenus-Nanog构建成功,荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting结果显示其能够在牛成纤维细胞中高效表达。脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA后,半定量RT- PCR结果显示S1效果最好,干扰效率达75%,S2和S3分别为20%和70%。【结论】成功构建了牛Nanog真核表达载体pVenus-Nanog,且获高效表达。通过脂质体共转染法筛选出了牛Nanog基因的有效干扰序列,为研究该基因在胚胎干细胞及早期胚胎中维持多能性调控网络中的作用机制奠定了基础。     

ChREBP基因siRNA表达质粒构建及对原代 培养猪脂肪细胞生脂的影响

【目的】构建ChREBP基因siRNA表达质粒,干扰ChREBP在原代培养猪脂肪细胞的表达,研究其在葡萄糖诱导脂肪细胞生脂中的作用。【方法】合成4对靶向ChREBP基因的siRNA寡核苷酸,分别连接于pcDNA™6.2-GW/EmGFP载体构建siRNA表达质粒,测序验证后,采用脂质体介导法转染从3日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,荧光定量RT-PCR检测ChREBP基因沉默效率;以葡萄糖浓度为0—20 mmol·L-1的培养液培养转染细胞48 h,测定生脂及生脂基因表达变化。【结果】筛选出了1个转染效果好、ChREBP基因沉默效率达85%的siRNA表达质粒,转染原代培养猪脂肪细胞后,细胞生脂水平及生脂基因ACC1和FAS mRNA表达比阴性对照表达质粒转染细胞和未转染细胞显著降低（P＜0.05）,且生脂水平不受葡萄糖水平的影响（P＞0.05）。【结论】构建的siRNA表达质粒能有效干扰猪脂肪细胞ChREBP表达,葡萄糖通过转录因子ChREBP调控猪脂肪细胞生脂及生脂基因表达。     

牛环形泰勒虫新疆株Tams1基因真核表达载体的构建及免疫反应性研究

研究采用PCR 方法从焦虫病患牛的全血基因组中扩增得到846 bp 的Tams1 基因片段,将其克隆至真核表达载pcDNA3.1(+),构建Tams1基因的真核表达质粒.经测序验证后, 将Tams1基因的真核表达质粒尾静脉注射小白鼠进行Tams1 基因的瞬时表达.取接种小鼠的肝脏提取总RNA,采用RT-PCR 扩增目的条带;用重组质粒pcDNA3.1(+)-Tams1 皮下注射免疫小白鼠4 次后,进行免疫抗体检测.试验结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1含有完整的Tmas1基因片段.用该重组质粒免疫小鼠56 d后,小鼠血清中抗重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1的抗体效价可达1∶12 000以上,说明该重组质粒具有很强的抗原性.经Western-blot检验可得到抗原-抗体复合物产生的特异性条带,说明该重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1具有免疫原性.     

犬SLAM基因真核表达载体的构建及在MDCK细胞中的稳定表达

为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK.     

鹅SCD1基因真核表达载体构建及在肝细胞中的表达

构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。     

SOCS2真核表达载体的构建及在3T3 L1前体脂肪细胞中的表达

细胞因子信号抑制蛋白(SOCS)是细胞因子信号通路的重要负调控因子.构建SOCS2真核表达载体并转染3T3-L1前体脂肪细胞,为研究SOCS2对不同细胞因子调控脂代谢奠定基础.取小鼠皮下脂肪提总RNA进行RT-PCR,克隆获得pMDl8-SOCS2质粒载体,双酶切目的基因,并克隆至质粒载体pcDNA3.1,成功构建了重组质粒载体pcDNA3.1-SOCS2;重组质粒瞬时转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,RT-PCR和Westem blotting检测重组质粒转染组SOCS2核酸和蛋白表达,表达水平均显著高于对照组,为进一步研究SOCS2基因对不同细胞因子调控脂肪代谢提供基础.     

小鼠CHD5基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠染色质区解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒载体并在NIH3T3细胞中验证其干扰作用.方法:人工合成靶向CHD5的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法插入到穿梭载体pSES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-CHD5siRNA重组质粒,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Adr-simCHD5,然后感染NIH3T3细胞,用RT-PCR和Western Blot方法检测其对CHD5mRNA和蛋白表达的干扰效果.结果:得到高滴度Adr-CHD5siRNA重组腺病毒,RT-PCR和Western Blot结果表明该重组腺病毒能有效地降低CHD5基因的表达.结论:成功构建Adr-CHD5siRNA重组腺病毒载体,并在NIH3T3细胞上实现CHD5基因表达抑制,为进一步研究CHD5基因功能奠定了基础.     

新城疫病毒F基因真核表达载体的构建及瞬时表达

应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。