抗氯霉素单克隆抗体的制备与鉴定

本文用人工合成的氯霉素 -牛血清白蛋白 (CAP- BSA)免疫 BAL B/ C小鼠 ,通过杂交瘤技术建立了 2株分泌抗氯霉素的单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 1D1 0 和 5 E6 。经间接酶联免疫吸附试验 (ci EL ISA)检测细胞培养上清效价为 1∶ 5 12 ,诱生腹水的效价可达 1× 10 8。两株单克隆抗体的亚型为 Ig G1 ,杂交瘤染色体数目为 84～ 96条。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定。ci EL ISA检测显示其与常见抗生素及结构类似物的交叉反应小 ,其灵敏度为 0 .1ng/ ml,IC50 为 2 .38ng/ m l,这表明该单抗具有较大的应用价值     

三聚氰胺IgG型单克隆抗体的制备及鉴定

采用改进的重氮法合成三聚氰胺免疫抗原(三聚氰胺-BSA)和三聚氰胺包被抗原(三聚氰胺-OVA),以三聚氰胺-BSA免疫BALB/c小鼠,选取间接ELISA测定效价达8000以上的BALB/C小鼠进行融合,用HAT和HA选择性培养基筛选后,得到一株稳定分泌抗三聚氰胺抗体的杂交瘤细胞株命名为3G4,经多次传代培养和反复冻存复苏后能够稳定分泌抗体,在BALB/C小鼠体内诱生腹水,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水。用间接ELISA方法测定杂交瘤培养上清效价为1:1600,腹水效价为1:2.048×10~6,抗体亚类为IgG2b。     

三聚氰胺IgG型单克隆抗体醛制备及鉴定

采用改进的重氮法合成三聚氰胺免疫抗原（三聚氰胺-BSA）和三聚氰胺包被抗原（三聚氰胺-OVA）,以三聚氰胺-BSA免疫BALB／c小鼠,选取间接ELISA测定效价达8000以上的BALB／C小鼠进行融合,用HAT和HA选择性培养基筛选后,得到一株稳定分泌抗三聚氰胺抗体的杂交瘤细胞株命名为3G4,经多次传代培养和反复冻存复苏后能够稳定分泌抗体,在BALB／C小鼠体内诱生腹水,用辛酸一硫酸铵沉淀法纯化腹水。用间接ELISA方法测定杂交瘤培养上清效价为1：1600,腹水效价为1：2．048×10^6,抗体亚类为IgG2b。     

己烯雌酚单克隆抗体细胞株的筛选及间接ELISA法的建立

以自行合成的己烯雌酚(DES)免疫原免疫BALB／c小鼠，采用细胞融合、显微克隆等单克隆抗体技术，制备了5株抗DES单克隆抗体分泌杂交瘤细胞株(7B6、4B10、1G10、4E4、2C7)；选择其中的7B6株抗体，建立了间接竞争ELISA法(indirect competitive inhibition ELISA)，通过初步优化，其检测限为10pg／孔，与同类二苯乙烯类雌激素的交叉反应高，而与天然雌激素雌二醇几乎无交叉反应性。这项研究为DES残留检测试剂盒的开发打下了基础。     

达氟沙星单克隆抗体的制备与鉴定

采用碳二亚胺法将达氟沙星与BSA和OVA偶联制成免疫抗原DFLX-BSA、检测抗原DFLX-OVA。采用FeCl3显色反应、紫外扫描分析法对合成的抗原进行了鉴定。用免疫抗原DFLX-BSA腹腔免疫BALB/c小鼠,有限稀释法筛选获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株1株4F9,单抗亚型鉴定为IgG1,并将此细胞株注射小鼠腹腔获得腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行了纯化。纯化后的抗体效价为2.48×10-6,紫外分析方法计算蛋白含量为1.348 mg/mL。     

奶牛孕酮单克隆抗体的制备及鉴定

奶牛妊娠的早期诊断,对奶牛生产具有重要意义,对于未妊娠母牛失误诊断,会错失下一个情期配种任务的安排,造成产犊间隔延长、繁殖率降低等问题。对早期妊娠的检测有多种方法,临床上通常把血、奶中孕酮的含量作为判断反刍动物怀孕与否的可靠依据。以甾体类激素孕酮为研究对象,利用琥珀酸酐法将11α-羟孕酮活化,运用碳二亚胺法选择BSA为免疫抗原载体,OVA为检测抗原载体与孕酮进行偶联反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳表明偶联成功。P-BSA乳化后皮下免疫小鼠,3次免疫后血液效价最大达到1∶(243#10~3)。通过淋巴细胞杂交瘤技术获得针对孕酮的3株单克隆抗体细胞株2H3、2C3、C3H11。3株单抗诱生的腹水经纯化柱纯化,均未与雌二醇发生反应,特异性较好,为尽早检测出未妊娠牛,以适时治疗不孕牛、尽早淘汰劣质牛提供简便迅速的方法。     

醋酸甲孕酮单克隆抗体的制备与鉴定

用人工合成的醋酸甲孕酮-牛血清白蛋白(MPA-BSA)作为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选得到1株稳定分泌醋酸甲孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C11A3B6,该细胞株经体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定。间接ELISA测定培养上清效价为1∶640,诱生腹水效价为1∶2.56×106。经鉴定:杂交瘤细胞分泌的抗体亚型为IgG2а。竞争抑制ELISA(ciELISA)检测显示其IC50为22 ng/mL,与常见抗生素及结构类似物的交叉反应小,表明该单抗具有较好的敏感性和特异性。     

三聚氰胺的FC数据拟合与ELISA试剂盒软件计算问题分析

通过对大量生鲜乳三聚氰胺试剂盒检测结果分析,明确了针对FC仪器需使用曲线跨度较小试剂盒。在曲线拟合中以试剂盒曲线、FC仪器中0点作为曲线值布点舍去非正常点后进行拟合较相似。0点作为曲线布点较试剂盒曲线CS拟合加标回收率、样品含量高;2种拟合方式三聚氰胺含量在0~5、5~10和10~20μg/kg范围时样本数量差异不大。0点布成空白点曲线线性较好,但99%检测样品含量值显示"非数据";除6、7、8曲线样品加标回收率偏低;0点赋微小值后进行曲线点板,除7、8曲线除外其余曲线R2符合试验要求,其加标回收率偏高。结论:试验中使用FC仪器,可选择曲线点位跨度较小试剂盒;若选用勤邦试剂盒、检测样品较多时则以0点布点舍去异常点后拟合计算。     

阿维菌素类药物单克隆抗体的制备和鉴定

将阿维菌素与牛血清白蛋白偶联,免疫Balb／c小鼠,用杂交瘤技术获得了1株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株。用间接ELISA测定腹水的效价为1：160000,抗体的50％抑制药物浓度（IC50）为2．5ng／ml,抗体与伊维菌素的交叉反应为12．5％,与多拉菌素、莫西菌素均无交叉反应。     

抗鸽IgG单克隆抗体的制备及鉴定

鸽卵黄经硫酸铵盐析、酒精沉淀及凝胶（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００）柱层析后,得到较纯的鸽ＩｇＧ,以其免疫ＢＡＬ Ｂ／Ｃ小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）进行细胞融合,经过酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）筛选,得到两株能稳定分泌抗鸽ＩｇＧ的单克隆抗体（以下称单抗）,分别命名为１Ｅ５和４Ｃ２。经亚类鉴定,该类抗均为ＩｇＧ１亚类。在鸽ＩｇＧ包被的９６孔板上用间接用ＥＬＩＳＡ方法测定单抗腹水的ＥＬＩ     

抗氨苄青霉素单克隆抗体的制备及初步鉴定

利用碳化二亚胺(EDC)法将氨苄青 霉素(Ampicillin,AMP)与匙孔嘁血蓝蛋白 (mcKLH)偶联制备免疫原免疫Balb/c小鼠, 应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓 瘤细胞(SP2/0)融合,建立分泌氨苄青霉素单 克隆抗体的杂交瘤细胞株。同上方法将氨苄 青霉素连接到阳离子化的牛血清白蛋白(cB SA)上制备检测抗原,对AMP KLH偶联物 免疫小鼠产生的抗体进行检测。通过对杂交 瘤细胞培养上清的检测、鉴定,筛选出8株高 亲和力的杂交瘤细胞株,用其制备的腹水 ELISA效价达到2×106,纯化后的单克隆抗 体(McAb)可以应用于氨苄青霉素残留的快 速检测。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及鉴定

将纯化的犬瘟热病毒(CDV)分别与弗氏完全佐荆(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)乳化制备的乳化抗原作为免疫原,以有限稀释法和间接ELISA法进行单克隆抗体的筛选,从而获得了3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7、3G2、5E3.亚型鉴定结果显示,2F7为IgG2a型,3G2为IgGl,5E3为IgGM.用2F7制...     

禽多杀性巴氏杆菌单克隆抗体的制备及其基本性状研究

将多杀性巴氏杆菌（Ｐ．ｍ．）Ｃ４８－１株（Ｈｅｄｄｌｅｓｔｏｎ１型；Ｃａｒｔｅｒ分型５：Ａ）灭活后全菌免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾细胞与ＳＰ／０骨髓瘤细胞在ＰＥＧ１０００作用下融合。用全菌包被的间接ＥＬＩＳＡ方法检测抗体，获得了２３株能稳定分泌抗Ｐ．ｍ．１型单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养２个月和冻存３个月后复苏培养，均能稳定分泌特异性单克隆抗体。２３株腹水ＥＬＩＳＡ效价分别从１０－３—１０－１１，无免疫沉淀性，也无凝集性。Ｉｇ类型鉴定表明，３株属于ＩｇＭ，２０株属于ＩｇＧ。间接ＥＬＩＳＡ检测结果表明：２３株单抗只与Ｐ．ｍ．１型起反应，而不与Ｐ．ｍ．３、４、１６型起反应，也不与禽类易感的鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、李氏杆菌起反应，具有型的特异性。用ＩＣ８Ｈ９腹水建立的夹心ＥＬＩＳＡ方法检定Ｐ．ｍ．１型菌株，其敏感性高，特异性强，也更为方便。     

角蛋白19片段单克隆抗体的制备及鉴定

为制备角蛋白19片段（CYFRA21-1）的单克隆抗体（mAb）,采用间接 ELISA 方法检测免疫小鼠的抗体效价,融合、筛选、克隆化单克隆抗体,将筛选得到的单克隆细胞株注入小鼠腹腔制备腹水,采用辛酸硫酸铵法、蛋白 A 柱纯化腹水抗体,以 SDS-PAGE 凝胶电泳、紫外分光光度法检测抗体纯度和浓度;利用鼠抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体进行亚型鉴定;采用阻断 ELISA 法测定 mAb 的敏感性（IC50）。结果表明,筛选获得4株分泌角蛋白19片段 mAb 的细胞株,将4株细胞株2F9、3H5、7C3、6F11注入小鼠腹腔,分别获得效价为2．56×105、5．12×105、5．12×105、2．56×105的单克隆抗体,经纯化,抗体蛋白浓度为12．43 mg／mL～16．00 mg／mL,为 IgG1型抗体,其 IC50在1．03 ng／mL～1．53 ng／mL 之间。说明获得了4株分泌高效价 CYFRA21-1单克隆抗体的细胞株,为建立 CYFRA21-1的检测试剂盒奠定了基础。     

苯乙醇胺A单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

为制备苯乙醇胺A(phenylethanolamine A,PA)单克隆抗体,建立一种针对苯乙醇胺A的快速、简便、灵敏度高的检测方法,本试验采用重氮化法将制备的苯乙醇胺A衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联作为免疫原和包被原。利用弗氏佐剂充分乳化免疫原(PA-BSA),按常规免疫程序免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,选择血清抗体效价较高的小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以PEG法进行细胞融合。结果显示,经3次细胞亚克隆筛选后,最终筛选出一株可稳定分泌抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为D6H8,利用此细胞以小鼠体内诱生法制备抗体。经鉴定,D6H8腹水抗体亚型为IgG1,轻链为κ链;纯化后的抗体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、盐酸异丙肾上腺素和盐酸去氧肾上腺素均无明显的交叉反应(CR<0.18%),表明该抗体特异性良好。利用此抗体建立针对苯乙醇胺A药物残留检测的间接竞争ELISA方法,结果表明,腹水抗体效价为1∶12 800,猪肉中苯乙醇胺A添加浓度在5～1 000 ng/mL时线性关系良好,标准工作曲线为y=0.3861x-0.1845 (R^2=0.990),其IC₅₀为58.88 ng/mL,LOD为3.83 ng/mL,回收率在85.96%～104.32%之间。综上所述,本试验成功建立了检测苯乙醇胺A药物残留的间接竞争ELISA方法,该方法灵敏度高、稳定性较好。     

氟罗沙星单克隆抗体的制备及鉴定

采用碳二亚胺(EDC)法将氟罗沙星(FLE)与载体蛋白BSA、OVA分别偶联合成人工抗原BSA-FLE、OVA-FLE,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外分析法对合成的人工抗原进行了鉴定。BSA-FLE用作免疫抗原免疫Balb/C小鼠,OVA-FLE用作检测抗原包被酶标板检测抗体效价。免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合获得了5株(4F11、2C3、8G2、3C1、2G8)稳定分泌抗FLE抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型鉴定均为IgG1。将3C1接种小鼠制备腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化,纯化后腹水效价1∶1 024 000。抗体分子量160.766 KD,亲和常数为8.57×108M-1。     

产蛋下降综合征病毒单克隆抗体的制备

以粗提的ＥＤＳ－７６病毒（ＮＥ－４株）作为抗原，按常规方法免疫ＢＡＬＢ／ｃ鼠，最后一次免疫后第３天取脾细胞与ＳＰ２／０细胞进行融合，采用间接ＥＬＩＳＡ和ＨＩ进行双重筛选，共检出２５个阳性孔，阳性率为１４．８８％。对其中的１１个阳性值较高的孔进行３次克隆，最后获得的１１株杂交瘤细胞，经长期体外培养和冻存后复苏仍能稳定地分泌抗体；ＥＬＩＳＡ阻断试验和与其他病毒的交叉试验证明，其分泌的抗体具有高度特异性。经鉴定，１１株ＭｃＡｂ均为ＩｇＧ，均无免疫沉淀特性，腹水和细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ效价分别为１：３２００～１：５１２００和１：１２８～１：２０４８。杂交瘤细胞的染色体数目为８０～１１２，平均９２。尤为重要的是，１１株杂交瘤细胞中有４株分泌抗ＥＤＳ－７６病毒血凝素决定簇的中和单抗，细胞培养上清和腹水的ＨＩ价分别为２１０～２￣（１２）和２￣（２２）～２￣（２４），腹水的中和效价为１：１２８０～１：５１２０。     

猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】纯化猪塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus, SVV)SVV-CH-HB2016毒株,并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。【方法】以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验(IFA)结合间接ELISA筛选阳性细胞株,制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性,并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响,最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。【结果】在蔗糖密度梯度为5%～45%(W/V)时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白,免疫小鼠血清抗体效价均达到了1∶12 800,成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western bl...     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行分析与鉴定。用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白作为免疫原免疫8周龄的Balb/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀后,收集腹水,纯化后进行单克隆抗体浓度、纯度、类及亚类、抗体效价、相对亲和常数、Western blot和间接免疫荧光测定。结果表明,筛选到2株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4和9D7A7。4G3D4和9D7A7这2株单抗纯化后的浓度分别为2.6 mg/mL、1.6 mg/mL;亲和常数分别为2.30E+10、1.88E+09;抗体亚类均为IgG1,轻链为kappa链;且均能与IBRV发生特异性反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;间接ELISA测定腹水效价分别为1∶204800、1∶12800。利用CHO细胞表达的IBRV-gD蛋白成功制备了2株单克隆抗体,为下一步建立特异性的IBRV检测方法奠定了基础。