鸡新城疫V4克隆株疫苗研究与应用Ⅰ·V4克隆株/HB92选育及生物学特性测定

从澳大利亚引进NDV4自然无毒株,经耐热选育,利用蚀斑技术克隆病毒,选育出NDV HB92株,56℃ 6h对该毒株病毒活性没有影响;室温(10～25℃)条件下保存6个月,37℃保存2周,病毒仍有活力;37℃下保存8周,HA滴度不变.鸡胚平均致死时间(MDT)>168h;1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)为0.00;鸡静脉致病指数(IVPI)为0.00.将含毒尿液接种18日龄雏鸡,接种量为105EID50,接种后14d测定NDHI抗体效价≥24,强毒攻击保护为100%.     

新城疫GM2分离株蚀斑克隆纯化及毒力测定

新城疫（newcastle disease,ND）是世界公认的最重要的家禽疫病之一,伴随着NDV活疫苗的广泛使用,野外分离的新城疫病毒往往由多种强弱病毒混合而成。为了避免不同分离株干扰,必须通过蚀斑纯化将混杂在一起的不同NDV毒株区分开来。文章采用蚀斑纯化技术对野外分离毒新城疫GM2进行蚀斑纯化,并对蚀斑纯化前后病毒的生物学特性进行测定,结果显示,该分离毒蚀斑纯化前MDT,ICPI,IVPI分别为50.5,1.78,2.41,蚀斑纯化后MDT,ICPI,IVPI分别为47.5,1.89,2.65。     

华南地区新城疫病毒WS99株HN基因片断的克隆和序列分析

用RT－PCR一步法扩增了华南地区野毒NDV WS99株的HN基因890bp片断，并对其进行克隆、核苷酸测序及同源性分析。结果表明：WS99株的HN基因与其他29株NDV的核苷酸同源性在88．0％－99．8％之间，氨基酸同源性在90％－97％之间。鸡源NDV WS99株与鹅源副粘病毒GPMV株有极高的同源性，高达99．8％。该毒株与TEX／48和B1／47一样，在HN基因1301bp处由G突变为A，对应氨基酸由V突变为I，但其半胱氨酸位点和个数没有改变，且所克隆的目的片段中含有HN基因上5个凝血抗原位点其中的4个。     

鹅细小病毒LH株的纯化及其生物学特性

取鹅细小病毒(GPV) LH株毒液,通过氯仿去除杂蛋白,用氯化钠与聚乙二醇-6000相结合方法粗提后,经蔗糖密度梯度离心纯化.通过PCR方法对不同浓度蔗糖溶液进行检测,取纯化毒液进行蛋白电泳及电镜观察,并无菌接种12日龄鹅胚,对死亡胚尿囊液进行PCR鉴定.试验结果显示:浓缩纯化后的GPV主要分布在50％～65％蔗糖浓度区间,病毒的蛋白含量为216 μg/L;电镜观察结果表明,病毒粒子分为实心和空心2种,直径大小在20～22nm;经SDS-PAGE电泳可看到多个条带,主要蛋白大小与病毒蛋白VP1、VP2和VP3相对应.纯化后的病毒接种敏感鹅胚仍可致其100％死亡,死亡胚具有特征性的病变,尿囊液经PCR鉴定,呈GPV核酸阳性.本试验所用方法获得的纯化GPV病毒液的纯度高且保持了该病毒的毒力特性,是一种方便可行的纯化该病毒的方法.     

新城疫病毒Ulster株血凝素—神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

析城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株经ＳＰＦ鸡胚增殖和超速离心纯化后，以酚－ＳＯＳ法提取其基因ＲＮＡ，作为反转录－聚合酶链反应的模板。根据其已发表的Ｆ和ＨＮ基因核苷酸序列，合成一个长为３０ｍｅｒ的寡核苷酸和一对分别长为２８、３０ｍｅｒ的寡核苷酸分别作为反转录引物和ＰＣＲ引物。     

SfaMNPV-D克隆株感染小菜蛾的生物测定

芹菜夜蛾核型多角体病毒-D克隆株感染2龄和3龄小菜蛾幼虫,测得LC50分别为2.01×105和2.82×107PIBs/lml,相同浓度的病毒感染小菜蛾,致死率与幼虫虫龄呈负相关。     

猪伪狂犬病病毒豫A株、豫B株PK基因的克隆和序列比较分析

对来自河南省的两份疑似伪狂犬的病料进行了PrvPK基因的PCR扩增,将两份扩增产物分别克隆于pMD18-T载体,对重组质粒作PCR、酶切分析和序列测定,证实了克隆片段的特异性。借助生物学分析软件,将YuA株和YuB株PK基因的核苷酸序列与已被Genebank收录的PryMinA株、PryEr株、NIA-3株及Ka株的PK基因核苷酸序列进行同源性和差异性比较,六个Prv毒株PK基因核苷酸序列间具有很高的同源性,最低者为YuA株和Ka株,其同源性为97．1％;YuA株在282位比其它毒株少一个G,导致缺失突变,93位以后氨基酸序列的同源性大大降低,该毒株与MinA株、YuB株、Er株、Nia-3和Ka株同源性分别降为30．7％、30．7％、30．2％、29．5％和19．5％,明显低于其它组间的最低值86．1％,分离毒对家兔的不致病性可能与该位点的缺失突变有一定关系。以NiA-3株为标准,在其238至249位有一个高变区,在1081至1098位有一个高变区,这两个高变区没有打乱读码框,也没有破坏PK激酶的保守氨基酸位点,推测这两个区域对于PK激酶结构的稳定性和功能的发挥是非必需的。     

鸡新城疫病毒山东分离株F蛋白基因的克隆与鉴定

鸡新城疫病毒 (NDV)山东分离株在鸡胚增殖后纯化 ,利用特异性引物 ,经RT -PCR技术扩增出了F基因重要功能片段 ,将该基因克隆入pGEM -T载体后 ,对其进行酶切分析和序列测定 ,结果表明 ,山东分离株为强毒株。与多株已报道的NDV参考株相应片段进行序列比较 ,经遗传基因进化树分析 ,证实NDV山东分离株属于基因型Ⅶ型     

新城疫病毒Ulster株血凝素-神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

新城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株经ＳＰＦ鸡胚增殖和超速离心纯化后，以酚－ＳＤＳ法提取其基因组ＲＮＡ，作为反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的模板。根据其已发表的Ｆ和ＨＮ基因核苷酸序列，合成一个长为３０ｍｅｒ的寡核苷酸（位于Ｆ基因内）和一对分别长为２８、３０ｍｅｒ的寡核苷酸（位于ＨＮ基因两侧）分别作为反转录引物和ＰＣＲ引物。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，出现一条长为１．９３ｋｂ的特异性条带，与预期相符。并将此特异性条带克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，并经限制性核酸内切酶分析（ＲＥＡ）。ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＥＡ结果证实其为新城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株的血凝素－神经氨酸酶基因。     

复合RT-PCR快速鉴别鹅副粘病毒与鸡新城疫病毒

对新近分离的鹅副粘病毒SF02株通过自行设计的3条引物建立了复合RT-PCR方法。该方法对鹅源副粘病毒SF02株和GPV2株均可检测到215bp和401bp2条带，对12株(其中7株参考株，5株野毒)鸡源新城疫、2株鸽源新城疫、1株鸭源新城疫病毒的检测只出现1条401bp带，与预期的大小一致，对H5、H9亚型禽流感病毒、鸭病毒性肝炎病毒、传染性支气管炎病毒、SPF鸡胚尿囊液均未检测到特异性条带。     

一株新城疫病毒分离株全基因组序列的克隆与分析

根据GenBank上所公布的新城疫病毒(NDV)的全基因组序列,设计了10对引物,运用RT-PCR方法获取了三黄鸡新城疫病毒(SHJ00株)全基因组序列,并对其进行了比较分析。结果表明:此株三黄鸡新城疫病毒(SHJ00)的全基因组序列由15 192个碱基组成,在NP基因和P基因之间的非翻译区多了6个核苷酸ACACTC;与NDV一致,SHJ00基因由6个ORF组成,即3′-NP-P-M-F-HN-L-5′;测序后拼接的F基因长1 672 bp,包含完整的开放阅读框(1 662 bp),编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特性;根据NDV基因分型标准,三黄鸡新城疫病毒SHJ00株归属基因Ⅶ型新城疫病毒;F基因与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.9%~97.7%,其中与F48E9同源性为84.3%,与Lasota的同源性为82.0%;测序后拼接的HN基因长为1 716 bp,编码571个氨基酸,与国内外NDV代表株的核苷酸同源性为80.0%~98.1%,其中与F48E9同源性为84.5%,与Lasota的同源性为81.4%。     

鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）母源抗体的消长规律

【目的】评价鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体的效力,制定疫苗的最小免疫日龄。【方法】随机采集鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）二免后135日樱桃谷种鸭的种蛋孵化,随机取5、7、10和15日龄免疫种鸭后裔雏鸭10只和相对应日龄非免疫种鸭后裔雏鸭5只,采血,分离血清,测定母源抗体,并以0.1mL/羽（含100DID₅₀）的剂量经腿部肌肉攻毒。观察雏鸭攻毒后的临床表现（采食量、粪便、精神和死亡情况）,观察至攻毒后10d。攻毒后2d经颈静脉采血,分离血清进行病毒分离。每份血清接种5枚6日龄SPF鸡胚,0.1mL/枚,37℃孵化,24h以内死亡鸡胚视为非特异死亡,孵化至168h。只要有1枚及以上鸡胚死亡则判该鸭感染。计算母源抗体雏鸭组的攻毒保护率和无母源抗体组的发病率。攻毒后5d,分别称量雏鸭的体重,计算平均日增重。对成对样本进行T检验,分析母源抗体对雏鸭增重的影响。通过试验鸭中和抗体、增重变化和病毒分离的方法评价母源抗体的效力。【结果】（1）1日龄雏鸭的母源抗体阳性率最高,1、5、7、10和15日龄雏鸭的母源抗体阳性率分别为56.1%（37/66）、40%（4/10）、50%（5/10）、30%（3/10）和0%（0/10）,5-7日龄抗体阳性率处于平台期,15日龄时母源抗体降低至全阴性;（2）攻毒后对照鸭表现精神沉郁（20/20）、仰翻和侧翻等神经症状（6/20）及死亡（2/20）,有母源抗体的雏鸭临床症状明显轻于对照组。（3）5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重115.5、142.8、177.8和162.2g。5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭攻毒后5d平均增重54.5、91.0、165.0和118.8g。（4）5、7、10和15日龄免疫种蛋孵化雏鸭的攻毒保护率分别为50%（5/10）、60%（6/10）、20%（2/10）和0%（0/10）; 5、7、10和15日龄非免疫种蛋孵化雏鸭的发病率均为100%。（5）5和7日龄雏鸭平均增重和攻毒保护率最高,分别为50%（5/10）和60%（6/10）,10和15日龄雏鸭的母源抗体尽管低（20%和0%）或阴性,仍然有明显的保护作用。【结论】（1）鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体能够保护10日龄内雏鸭;（2）疫苗首次免疫的时间以7-10日龄为最佳。     

新城疫病毒(NDV)F基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建

应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和一对自行设计的引物,从新城疫病毒(NDV)F48E9株扩增出长度为1664bp的DNA片段。与已报道的NDV-融合蛋白(F)基因比较,两者大小一致。经限制性内切酶反应,获得两个预期大小的片段。将克隆的F基因定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,证明构建的重组质粒含有NDV-F基因。     

新城疫热稳定性天然弱毒株B95生物学与免疫学特性初步研究

新城疫病毒Ｂ９５（ＮＤＶＢ９５）是从国外引进的一株稳定性的天弱毒株。本项研究证明：本毒株对鸡 鸡无毒副作用,ＩＣＰＩ和ＩＶＰＩ值分别为０;该病毒可凝集鸡、鸭、牛、绵羊、鹅、猪、小白鼠和人的红血球,血凝价与Ｉ系、ＨＢ１和Ｌａｓｏｔａ相似将病毒置５６℃２ｈ,置３７℃保存１０ｄ,仍见有血凝性和对鸡胚感染性;经点眼、饮水、非免疫鸡与免疫鸡同居,均能获得好的免疫效果,并能耐受新城疫强毒株的攻击。     

兔病毒性出血症病毒敏感细胞株的初步选择

将兔出血症病毒分别接种于Vero E_6、Vero、RK_(13)、LLC—MK_2、A_(549)、ZBS细胞进行盲传培养。在细胞传代时制备抗原片。根据间接免疫荧光检查结果,初步认为Vero E_6和LLC—MK_2是本病毒敏感细胞株。     

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

 【目的】重组新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒（very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV）及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21 d分别以vvIBDV Gx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV－VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120 h,脑内致病指数（ICPI）分别为0.4和0.36,静脉内致病指数（IVPI）均为0;接种后72～96 h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0 EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100％保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90％以上。 【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病－新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。     

鹅副黏病毒与鸡新城疫病毒抗原变异关系的研究

试验对鹅副黏病毒NA-1株和鸡新城疫F48E9强毒株的抗原变异性进行了研究.经交叉血凝抑制试验、鸡胚交叉中和试验,采用R值分析方法,用抗原比值定量确定2种抗原的相似程度.结果表明:R值分别为0.446和0.500,二者确实存在抗原差异.     

新城疫病毒F48E9株F1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性研究

收集福建某渔场的患病石斑鱼苗制备组织切片,同时将患病石斑鱼苗组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系(striped snakehead, SSN-1),对发生细胞病变(cytopathic effects, CPE)的SSN-1细胞进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、纯化负染,并制备细胞超薄切片,借助SSN-1细胞系从患病石斑鱼苗中分离病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV).试验结果表明:在病鱼脑和视网膜中可见大量的空泡,接种SSN-1后2～3d出现CPE,PCR检测可扩增出VNNV特异性带,提示这是VNNV病毒.负染及SSN-1细胞超薄切片的电镜观察显示,该病毒为直径25～30nm的二十面体病毒粒子,在胞质中呈不完全晶体状排列,同时细胞质中有大量空泡,进一步说明分离株为VNNV.对该分离株进行细胞敏感性试验、脂溶剂敏感试验(氯仿处理)、热敏感试验(55℃ 30min)、酸碱敏感试验(pH值为3和pH值为11各1h),试验结果表明:石斑鱼吻端细胞、鲤上皮瘤细胞、肥头鲤细胞在28℃、25℃、20℃时对该病毒都不敏感;该病毒对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感.研究结果表明,用SSN-1细胞系可以从患病鱼中分离VNNV.