禽H9N2亚型重组流感病毒疫苗候选株的构建及其免疫效果评价

以G57基因型分离株A/Chicken/Jilin/DH104/2012(H9N2)为HA和NA基因的供体,以A/Swan/Jilin/SN8/2009(H11N6)的6个内部基因作为疫苗候选株的骨架,利用反向遗传技术拯救了1株重组H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株rDH104。将该重组病毒灭活后免疫7日龄SPF鸡,28日龄加强免疫1次,血清HI抗体保护水平至少可以维持58d,表明该重组病毒具有良好的免疫原性。本试验为研制与当前H9N2亚型禽流感病毒流行株抗原性相匹配的候选疫苗株提供了依据。     

利用反向遗传技术构建细胞高适应性的H9N2流感病毒

H9N2亚型禽流感病毒通常在鸡胚上增值性能高,但在细胞上增值能力差。为了获得在细胞上高效表达H9N2亚型禽流感HA和NA抗原的疫苗株,通过反向遗传操作技术将A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2,SH441)的HA和NA基因与A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)的6个内部基因进行人工重组,拯救并获得了1株禽流感重组病毒441-PR8,并对它的生物学特性进行了研究。结果表明,重组病毒441-PR8株在细胞上的增殖能力明显高于野生毒株SH441,该重组病毒有望成为H9N2亚型禽流感疫苗研制的候选毒株。     

利用反向遗传技术拯救H9N2重组病毒

为研制高效特异的H9N2亚型AI疫苗,选取我国具有代表性的毒株A/chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(简称SH10),以12质粒系统为基础,利用反向遗传操作技术构建了1株表面基因由SH10提供、内部基因由12质粒系统提供的重组病毒SH/PR8,为新型疫苗的研制提供了新的毒株。     

H9N2亚型禽流感病毒不同流行株抗原性和免疫原性的比较研究

为研究H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,采用交叉HI试验、细胞中和试验和攻毒保护试验对1998-2008年间分离到的25株H9N2 AIV的抗原性和免疫原性进行了研究.结果显示,依据不同毒株与Hp株免疫产生HI抗体的结果可将25个毒株分为3类,第1类HI效价4.0log2～5.0log2的为12#、17#、18#;第2类毒株HI效价6.0log2～7.0log2的为2#、21#、5#、22#、11#、25#、15#、16#;其余毒株的HI效价为7.0log2～8.0log2.这证实不同H9N2 AIV流行毒株间的抗原性有差异.选取代表性的8株H9N2 AIV毒株进行中和试验,结果显示其抗原相关性在0.42～0.84.除了3#与14#、11#与17#的抗原性有明显差异外(相关性R值分别为0.46、0.42),其余毒株间的抗原性无明显差异或仅有较小的差异.抗原性不同的H9N2 AIV株对Hp株免疫鸡的攻毒保护试验显示Hp株能够对抗原性有差异的攻毒株(10#、12#、17#)产生有效保护(9/10),联合攻毒试验结果显示Hp毒株免疫鸡可抗其他毒株(9#+15#和16#+17#)的联合攻击,保护率9/10以上.以上结果显示,H9N2 AIV Hp株与多数流行毒株间在免疫原性上无明显差异,H9N2 AIV多数流行毒株间的免疫原性没有发生根本改变.     

H9N2亚型禽流感病毒HA-M2融合基因的真核表达及免疫原性研究

选择H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的两个保守T细胞表位基因和M2基因胞外保守序列(M2e),经人工合成并通过PCR扩增获得HA-M2融合表位基因,与载体p Fast Bac HTA连接,构建重组真核表达质粒p Fast HTA-HA-M2。阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,转染Sf9昆虫细胞获得含HA-M2基因的重组杆状病毒,重组杆状病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE、间接免疫荧光试验和Western blot鉴定。利用目的蛋白免疫3周龄SPF鸡,采用ELISA测定抗体滴度,MTT试验检测T淋巴细胞增殖。结果显示,目的蛋白HA-M2在昆虫细胞中有特异性表达,能被H9亚型AIV免疫阳性血清所识别,可诱导高滴度的AIV特异性抗体。试验结果为新型禽流感通用疫苗的研制奠定了基础。     

1株H9N2亚型重组禽流感病毒的生物学特性

为研制高效特异的H9N2亚型AI疫苗,试验对利用反向基因操作技术构建的1株表面基因由A/chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(简称SH10)提供、内部基因由12质粒系统提供的重组病毒SH/PR8的生物学特性进行了研究.结果表明,与亲本毒相比重组病毒的毒力有所下降,重组病毒在鸡胚上生长的适应性能更好,更适于作为新型疫苗株使用.     

H9N2亚型禽流感病毒细胞高产株的拯救

为构建能够在MDCK细胞中高水平复制的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗株,本研究在对病毒生长特性及HA基因遗传进化分析的基础上,筛选出一株细胞高度适应的国内流行株A/chicken/Shanghai/11/2011(H9N2) (SH11),并通过反向遗传操作技术拯救出全部基因均来自亲本株的AIV rSH11株.生物学试验结果表明rSH11在鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TCID50)、遗传稳定性等方面均与亲本株保持一致,rSH11经MDCK细胞连续传5代后血凝价稳定在1∶1024,表明该病毒株具有细胞高度增殖的特性.采用rSH11株制备油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡,免疫一周即可以检测出HI抗体,免疫3周后HI抗体平均效价高于1∶700,表明其具有良好的免疫原性.rSH11疫苗对不同的H9N2病毒株能够产生良好的免疫保护作用,显著抑制免疫鸡排毒.H9N2亚型AIV细胞高产株的拯救为该亚型AIV细胞苗的研制奠定了基础.     

H9N2亚型禽流感病毒疫苗研究进展

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在,给养禽业造成巨大的经济损失,并危害人类健康。流感病毒抗原易发生漂移和转换,使流感病毒的防控变得困难。疫苗接种是防控禽流感最有效的手段之一,全病毒灭活疫苗保护效果好,制备简单,是流感病毒常用的疫苗,但该疫苗局部副反应大,并伴随生物安全问题。随着分子生物学技术的发展,活载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的开发,给H9N2亚型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全和普遍防控方面具有广泛的优势,是流感病毒疫苗发展的新方向。     

禽流感病毒H9N2亚型HL株与H9亚型流行株抗原相关性及交互免疫的研究

禽流感病毒的基因结构的特殊性决定了该病毒的多变性。为了实时掌握H9N2亚型禽流感病毒的流行变异情况,本文研究了2001年从河南洛阳分离到的HL株H9N2亚型禽流感病毒与2005年以后从我国部分省份分离到的6株H9N2亚型禽流感毒株,就毒力、免疫原性和HA基因的变异等方面进行了比较,旨在为生产用毒种的选择提供理论依据。结果表明,HL株和2005年以后从其他几个省份分离的毒株有很好的免疫交叉保护性,能够对当前的流行毒株提供足够的抵抗力。     

H9N2亚型禽流感病毒的研究现状

H9N2亚型禽流感病毒已在世界范围内的禽类中分离确认,并被证实可以传播到人类和低等哺乳类动物。对于它存在的潜在危害已经越来越多地受到关注,相关的研究也相继开展。许多遗传进化的分析为禽或猪流感可以直接感染人提供了证据,通过在人体的适应或与人流感病毒基因重组,可以形成新的病毒株,引起人类流感疫情暴发。文章提示应当密切监控H9N2亚型禽流感病毒,防止人类流感大流行。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-THA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因，将扩增到的HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移栽体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞，经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒，用其感染Sf9昆虫细胞，并优化表达条件。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表达产物的分子质量约为27ku。Dot-ELISA分析表明，表达的HA2融合蛋白可与鸡抗HgN2亚型血清发生特异性反应，而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

H9N2 AIV HA蛋白S145N变异毒株的抗原性和免疫原性

在研究1998-2008年中国H9N2亚型禽流感病毒（AIV）分离株HA基因的进化时,发现在25个毒株中有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生1个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H9亚型AIV的抗原性和免疫原性的影响,本试验对12株HA蛋白S145N变异的H9N2AIV进行了交叉中和试验和交叉攻毒试验。结果显示,不同H9N2S145N变异株与疫苗株间在抗原性上变化不大,或无显著差异（0.5≤R≤0.67）。但参照现有的H9灭活疫苗效力检验方法对HP疫苗免疫鸡进行攻毒,用HP株攻毒对照组0/5保护,免疫组保护≥9/10,达到了H9灭活疫苗质量标准要求;但用S145N变异株N3攻毒,仅保护2/10～6/10,且随免疫量剂量的增加,抗体水平的提高,攻毒保护也依次升高。对H9变异株疫苗（N1、N2、N3、N8）免疫鸡用N3攻毒,仅保护2/5～4/5,N3同源抗体也不能有效地阻止其攻毒后的排毒。用N3、N6 2个变异株交叉攻毒,采用与疫苗株攻毒相同的剂量作攻毒试验也得到类似结果。表明高于6log2的抗体能抵抗疫苗株和大多数流行毒株攻毒后的排毒,但不能抵抗S145N变异株攻毒后的排毒。这类毒株免疫原性上的变化与病毒HA基因的变异密切相关。因HA基因145～147aa位增加了1个NGT,导致三维空间构象的变化,并影响其邻近的受体结合位点,从而使这类毒株致病性提高,免原性发生改变。虽然这一类变异株或免疫逃逸毒株仅占当前流行毒株总数的5%～7%,但在强大的免疫压力和自然选择下有可能逐步成为优势毒株,造成更大的危害,这为该病的防控提出了新的挑战。     

H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）,命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量（EID₅₀）为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间（MDT）为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特征;HA基因的遗传进化分析结果表明,该分离株属于h9.4.2.5谱系,符合当前毒株流行趋势。将HF株与2006-2018年分离自全国各地的10株H9N2亚型AIV分离株同时制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,制备阳性血清,通过交叉血凝抑制试验分析病毒抗原性,结果显示HF株与2014年之前毒株抗原相关性介于0.50~0.56之间,与2014年及之后毒株抗原相关性介于0.89~1.00之间,表明该分离株与2014年之后的流行毒株具有良好的抗原相关性。用0.2%甲醛灭活HF株病毒液,其HA效价在灭活前后未发生变化;用灭活抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d HI抗体效价几何平均值达到9.0log2以上,可使免疫鸡完全抵抗H9亚型AIV的感染,提供100%的攻毒保护。研究结果表明,HF株具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选株用于H9N2亚型禽流感疫苗的研制。     

H9N2亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果评价

为充分了解10多年来在生产中普遍使用的H9N2亚型禽流感(AI)灭活疫苗(F株)对鸡群的免疫保护效果,本研究以F株灭活疫苗分别接种SPF鸡和罗曼鸡,通过检测其抗体水平,分析比较抗体消长规律;同时以2009～2010年间从免疫鸡群中分离到的9株H9N2亚型AIV为素材,通过F株灭活苗免疫攻击试验,来评价该疫苗对上述9株分离株体内感染的免疫保护效果。结果显示:F株灭活疫苗免疫SPF鸡和罗曼鸡3周后,产生的HI抗体效价均在7log2以上,且持续时间长,SPF鸡达15周,罗曼鸡在11周以上。SPF鸡免疫群用F9株、L9株、S9株和D9株和F株攻击7d后,对鸡的咽喉和泄殖腔排毒有100%的抑制作用,用其它5株(F119、W9、YD、M和D119)攻击后的抑制作用为90%;罗曼鸡免疫群用L9株、F9株、S9株、D9株、W9株和F株攻击7d后,对鸡咽喉和泄殖腔排毒有100%的抑制作用,用其它4株(F119株、YD株、M株和D119株)攻击后的抑制作用为90%;未接种疫苗的对照组鸡攻击7d后排毒率均为10/10。     

H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选

为了筛选免疫原性更好的H9N2亚型禽流感病毒疫苗株。本研究在分析H9N2病毒HA基因遗传进化规律基础上,对预选的毒株进行血凝效价(HA)、鸡胚半数感染量(EID50)测定及交叉血凝抑制试验,筛选出疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,CK/AH/AJ3/15株HA效价达11 log2、EID50值为9.17 log10/0.1 mL,有很好的繁殖能力;对当前流行株的HI反应效价比疫苗株F/98高2-3个滴度;以CK/AH/AJ3/15株制作灭活疫苗,整体保护率达到97.5%,比F/98疫苗株的85%明显提高。表明CK/AH/AJ3/15株可以作为H9N2亚型禽流感新型疫苗株的候选株。     

H9N2亚型禽流感病毒复制特性的基因分析

利用反向遗传技术,通过基因重排方法,以A/chicken/shanghai/F/98（H9N2）禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的6个内部基因为骨架,与A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV的HA和NA基因组合,产生3株H9N2亚型重排AIVs。动物试验发现A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）和A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV主要在呼吸系统复制,A/chicken/shanghai/F/98（H9N2）株在气管和肺组织的复制能力明显强于A/Chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）AIV株。3株H9N2亚型重排AIVs的动物试验发现HA和NA基因对H9N2亚型AIV在呼吸道的复制特性起主要作用。内部基因对H9N2亚型AIV在呼吸道的复制也有一定的作用。结果表明1994年中国首次分离到的H9N2亚型AIV经过4年的宿主适应和基因进化,加强了其在呼吸系统的复制能力,奠定了气溶胶传播的基础。     

H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/LY1/2017株反向遗传操作系统的建立

为了构建H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/LY1/2017的反向遗传操作平台,通过RT-PCR技术分别扩增该毒株的8个基因片段,并分别克隆至双向转录表达载体PHW2000中.8个质粒共转染293T/MDCK混合细胞,96 h后将细胞板反复冻融3次收获细胞悬液,将其接种10日龄SPF鸡胚,96 h后收集尿囊液并将拯救毒株命名为rH9N2,测定其HA效价为1:256.rH9N2在HA、MDT、EID50、TCID50以及病毒生长曲线、空斑等方面保持了与亲本毒株一致的生物学特性.本研究成功构建了A/Chicken/Shandong/LY1/2017的感染性克隆,为今后通过基因替换、定点突变技术研究H9N2亚型禽流感病毒致病性的分子机制奠定了基础.     

H9N2亚型A型流感

A型流感病毒能引起各种鸟类、低等哺乳动物和人类的疾病。禽流感(AI)自1878年在意大利首次发现至今，由于候鸟的迁徙和国际间贸易的日益频繁，使得该病呈全球性分布，给养禽业造成巨大的经济损失。1997年“香港禽流感”表明，AI已对人类的健康造成了潜在的威胁。流感病毒(IV)血清亚型繁多，自从1966年Homme等人首次报道从火鸡中分离出H9N2亚型A型IV以来、陆续从鸡、野鸡、鸭、鸽子和鹌鹑中分离到该亚型AIV。除禽和人以外，还从其它动物中分离到。     

H9N2亚型流感病毒血凝素受体结合区定点突变株拯救及其受体亲和性鉴定

利用重叠PCR技术对H9N2亚型流感病毒Y280亚系毒株A/Chicken/Jilin/DH102/2012(H9N2)的血凝素受体结合区220-loop中相对保守的226位和227位进行了氨基酸置换,并通过反向遗传技术拯救了定点突变病毒。固相酶联试验结果显示:226位为L时,病毒偏嗜结合人型受体;226位为Q时,病毒偏嗜结合禽型受体;226位为M时,病毒同时具有与2种类型受体结合的能力,但偏嗜结合人型受体;227位为Q或M时,病毒均偏嗜结合人型受体。因此,相比于227位,Q226L突变足以改变病毒的受体偏嗜性。由于近年来90%以上的H9N2病毒分离株HA226位氨基酸都是L,推测226L是H9N2病毒感染哺乳动物的重要位点。     

三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析

采用RT-PCR对3株H9N2亚型禽流感病毒基因组进行扩增,测序后再利用DNAStar和MEGA 4对所得到的序列和部分具有代表性的参考序列进行遗传演化及分子特点分析,旨在从分子水平探讨华南地区H9N2亚型禽流感病毒的流行特点,为该病的综合防控提供依据。结果表明,3个分离株CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05与CK/GD/A8/10分别属于B34、B47和B54基因型;3个分离株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9N2亚型AIV HA基因的遗传进化特点,但内部基因出现不同程度重组且部分基因与人源高致病性H5N1亚型AIV同源性很高;CK/GD/162/03、Francolin/GD/298/05两株分离株具有宿主多样性。因此,对华南地区H9N2亚型AIV进行监控及分子流行病学调查具有重要意义。