不同株系菠萝蜜染色体倍性及基因组大小分析

【目的】为了解菠萝蜜基因组特点,研究测定了10份菠萝蜜株系的倍性和基因组大小。【方法】分别以番茄和‘妃子笑’荔枝细胞核DNA含量为内标,Otto为提取液,采用流式细胞术(FCM)测定经碘化丙啶(PI)染色的内标和菠萝蜜细胞核混合样品发出的PI荧光强度,通过比较内标和菠萝蜜DNA峰值的荧光均值比值关系,计算出不同株系菠萝蜜的倍性和基因组大小。【结果】所测的10份菠萝蜜株系都为二倍体,干苞菠萝蜜株系的基因组在(1 243.75±9.21)~(1 540.63±3.55)Mb,湿苞菠萝蜜株系的基因组约为(1 902.87±8.08)Mb。【结论】不同菠萝蜜株系之间基因组大小存在显著差异,且湿苞株系大于干苞株系。     

大白菜雄性不育系MS200712 的研究简报

以芸薹属异源六倍体AABBCC 为母本，以大白菜品种金春为父本进行杂交，获得F1（AABBCC×AA）；再以大白菜品种义和5 号为母本，与F1 进行杂交，在多亲本杂交后代中获得大白菜雄性不育系MS200712。该不育系花瓣为黄色，花药浅黄色、退化、败育彻底，柱头正常，蜜腺发达。同时，利用北京新3 号的父本832172 与雄性不育系MS200712 进行回交，获得了转育的MS20071208-916 不育系。     

荔枝CDPK基因家族鉴定及其在霜疫病胁迫下的表达分析

【目的】鉴定荔枝（Litchi chinensis Sonn.）钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因家族，并分析其在不同组织和荔枝霜疫病胁迫下的表达模式。【方法】基于荔枝基因组数据，利用生物信息学方法鉴定CDPK家族基因，并对其序列特征、基因结构、启动子顺式作用元件、染色体定位和进化关系等进行分析。依赖276份荔枝种质材料，筛选高抗霜疫病的优良荔枝品种。另外，通过RNA-Seq和qRT-PCR方法检测高抗病荔枝品种中LcCDPK基因家族成员在荔枝霜疫病胁迫处理下的表达模式。【结果】从276份荔枝自然群体材料中鉴定到荔枝高抗霜疫病品种裕荣1号（YR1）。从荔枝基因组中共鉴定出19个LcCDPK基因家族成员，分布于11条染色体上。根据保守结构域和系统发育分析将其分为4个亚家族。基因结构分析表明，LcCDPKs外显子数量为7～19。蛋白结构分析发现，所有LcCDPK蛋白均具有1～4个EF-hand结构域。顺式作用元件分析表明，LcCDPKs成员拥有大量的生物和非生物胁迫响应元件。组织表达分析发现，LcCDPK基因在荔枝不同组织存在组织特异性。另外，表达分析发现在高抗霜疫病荔枝裕荣1号（YR1）中，...     

‘嘎拉’苹果小孢子来源纯合基因型植株叶片再生体系研究

【目的】建立‘嘎拉’苹果小孢子来源纯合基因型植株高效再生体系,探索一个简单有效的苹果纯合基因型株系叶片外植体诱导再生不定芽的方法。【方法】以‘嘎拉’苹果花药离体培养获得的纯合基因型株系离体叶片为外植体,进行再生培养,检测‘嘎拉’各纯合基因型株系的不定芽再生能力;通过优化植物生长调节剂、叶片预处理和培养方式,建立苹果纯合基因型植株高效再生体系。【结果】苹果纯合基因型株系中双单倍体株系DH2-10的再生率最高,四倍体纯系DH2-15次之,单倍体株系DH2-3再生率较低,三倍体纯系DH2-40在培养中难以再生。不同基因型适宜的激素质量浓度不同,相较于双单倍体株系,四倍体纯系DH2-15在较高细胞分裂素水平再生率较好。再生培养过程中,整叶带伤口的外植体预处理方式优于叶片切块接种的方式,接种苗龄40 d左右的叶片有更好的再生率。【结论】建立了苹果纯合基因型高频高效离体再生体系:双单倍体株系DH2-10在最适再生培养基MS+0.5 mg·L~(-1)IBA+5 mg·L~(-1)6-BA上培养,再生周期为23~35 d,再生系数为7.27,再生率达100%。四倍体纯合基因型株系DH2-15适宜在MS+0.5 mg·L~(-1)IBA+6 mg·L~(-1)6-BA培养基上进行再生培养,再生率为93.33%。建立的再生体系可用于纯合基因型株系的快速增殖和遗传转化。     

板栗雄花败育资源及其利用研究

【目的】为了观察板栗雄花发育过程,探讨板栗雄花败育的细胞学基础及其利用价值,【方法】以板栗雄性不育2号(Cms-2)为试材,采用常规石蜡制片法和人工杂交法对雄花发育过程中的细胞学特征及有性杂交过程中的结实特性进行了观察。【结果】(1)Cms-2雄花序发育初期细胞发育正常,进入雄蕊分化期后雄花序上部组织结构逐渐停止发育,组织细胞开始破裂、解体、死亡;(2)在有性杂交中,无论是自然杂交、种内杂交还是远缘杂交,Cms-2均表现出较强的杂交结实能力。【结论】Cms-2为不完全雄花败育类型,败育发生于雄蕊分化期至花药形成初期,败育时未形成花粉囊,属于花药退化型雄性不育;Cms-2稳定的雄花败育性状及优良的结实特性使其在板栗育种及种质创新中具有重要价值。     

以雄性不育胞质杂种‘华柚2号’为母本创制柚有性群体

【目的】以具有胞质雄性不育特性的‘华柚2号’为母本与有核柚品种有性杂交,以期转移其不育胞质进而实现二倍体水平的无核柚改良。【方法】以‘华柚2号’为母本‘,沙田柚’和‘鸡尾’葡萄柚为父本分别配置杂交组合,并对其子代遗传来源和单/多胚性早期鉴定。【结果】分别从‘沙田柚’和‘鸡尾’葡萄柚为父本的杂交组合获得实生苗1 018和687株;用3对多态性SSR标记对实生苗的遗传鉴定表明均为父母本有性后代。以单/多胚性分子标记进行的早期胚性鉴定表明‘,沙田柚’为父本的有性后代均为单胚性;而‘鸡尾’葡萄柚为父本的后代,单胚与多胚性比例为2.86∶1。【结论】以‘华柚2号’为母本创制的有性后代为无核柚改良以及柑橘雄性不育恢复基因定位和克隆奠定了种质基础。     

无核葡萄抗寒抗病胚挽救育种应用研究

【目的】探究亲本基因型对胚挽救的影响,从中选出无核葡萄新单株,为今后无核葡萄新品系的选育提供新材料。【方法】以8个无核葡萄品种为母本,以抗寒抗病的中国野生葡萄等做父本,围绕无核抗性的育种目标设计9个杂交组合,对杂种进行胚珠培养,成苗后进行温室移栽炼苗,并对后代进行杂种鉴定和辅助选择,最后移栽至大田。【结果】通过胚挽救技术获得32个胚挽救株系,394株幼苗。利用无核基因探针GLSP1、分子标记SCF27和SCC8对杂种株系进行分子标记检测,杂种株系中检测出无核特异性条带的分别为11、18、21个株系。其中有17个株系在SCF27和SCC8标记扩增下都出现了无核性状的特异性条带。综合3种标记对杂交子代株系的检测结果,有28个株系被初步确认为携带标记的无核株系。【结论】以‘火焰无核’‘爱神玫瑰’和‘无核白鸡心’为母本的组合成苗率相对较高,以‘底莱特’和‘红无籽露’为母本的组合具有较高的胚萌发率,较适宜做母本。在杂交育种时母本的选择起关键作用,父本对胚挽救的效果也会有一定影响。     

荔枝DUS测试数量性状分级研究

【目的】荔枝特异性、一致性和稳定性(DUS)测试指南中的数量性状是极易受环境条件影响的性状。通过对荔枝测试指南中数量性状的分级研究,以期为荔枝品种数量性状客观准确的描述提供技术依据,以确保荔枝品种DUS测试工作顺利开展。【方法】以74个具有广泛代表性的荔枝品种为研究对象,对荔枝测试指南中9个数量性状进行观测,并依据各性状的特点选择最适的分级方法,对各数量性状的表达状态进行分级范围划分。【结果】9个数量性状变异范围为12.35%~33.09%,性状间相关系数分布在-0.14~0.75之间;正态性分析(K-S检验)结果表明,9个数量性状中有7个数量性状符合正态分布,采用最小显著差法分级,其他性状用极差法分级。【结论】对9个数量性状进行的分级范围研究结果可作为今后荔枝DUS测试数量性状描述分级的依据。     

西瓜雄性不育类型的遗传学鉴定与胚胎学观察

为了明确西瓜雄性不育材料的不育类型和花药败育时期,以西瓜雄性不育系GMS4为材料,对花蕾不育性状进行田间观察统计,利用石蜡切片法观察西瓜花药发育过程。结果表明,该材料不育性状由1对隐性基因控制,为细胞核雄性不育类型。可育株雄蕊发育正常,不育株雄蕊较小,花药干瘪无花粉,可育株和不育株雌蕊发育无明显差异,均可正常结瓜。从花药发育的整个过程来看,在花药发育早期,可育株和不育株花药结构形态差别不大,在小孢子母细胞减数分裂期,不育株异常绒毡层细胞过度增殖,体积小,排列不整齐,挤压药室,无二分体和四分体形成,在花药发育后期,无花粉粒形成,最终导致西瓜雄性不育发生。据此认为,花药败育发生时期在小孢子母细胞减数分裂期。     

影响我国荔枝分布的关键气候要素分析

【目的】明确荔枝分布与气候要素关系,识别影响分布的关键气候因子。【方法】基于国家气象信息中心气候数据,应用Arc GIS9.3软件分析荔枝分布与气候要素关系,以SPSS软件中主成分方法识别影响分布的关键气候因子。【结果】我国野生荔枝分布范围较栽培荔枝要窄;野生荔枝适宜年均温为22.32℃,年极端最低温为1.33℃,≥10℃年积温为8 120.57℃,年降水量为1 665.17 mm,湿润度为9.41;栽培荔枝适宜年均温为20.61℃,年极端最低温为-0.94℃,≥10℃年积温为7 429.71℃,年降水量为1 573.51 mm,湿润度为9.85;野生荔枝适应气候要素极差比栽培荔枝要小。【结论】影响荔枝分布的关键气候因子首先是低温指标,其次是高温指标,再其次是降水量。结果对准确认识气候变化影响及科学区划等有重要意义。     

流式细胞仪测定荔枝倍性和基因组大小的细胞核提取液筛选与应用

【目的】流式细胞术是目前测定植物倍性和基因组大小差异的最快、最有效的方法。建立适合荔枝的流式细胞术的方法,对荔枝倍性育种以及基因组大小的确定是必不可少的。【方法】笔者以荔枝的幼嫩叶片为材料,筛选适合荔枝的细胞核提取液配方,建立利用流式细胞仪测定荔枝倍性和基因组大小的方法。用改进的标准两步法,比较了6种常用细胞核提取液提取细胞核的效果。【结果】利用WPB(Woody Plant Buffer)提取的大部分荔枝品种(品系)叶片细胞核稳定、分辨率高、细胞碎片少且细胞G0/G1峰的变异系数(CV)较低,平均CV值为5.12%,说明该配方适用于酚类物质丰富的荔枝细胞核的提取。同时以已知染色体数量的‘无核荔’(2n=30)为外标,检测了18个品种(品系)的倍性,发现参测样品的G0/G1峰与‘无核荔’G0/G1峰的荧光均值的比值为0.78～1.24,说明所测荔枝品种(品系)均为二倍体。以已知基因组大小的‘Stupicképolnírané’番茄为内标测定了14个品种(品系)的基因组大小,结果表明荔枝基因大小约为550～620 Mb,平均602 Mb,不同荔枝品种(品系)间基因组大小存在一定差异。【结论】WPB细胞核提取液提取的荔枝幼嫩的叶片的细胞核质量好,可用于流式细胞术荔枝倍性和基因组大小的测定,测定的结果显示参测荔枝品种(品系)均为二倍体,无单倍或多倍的情况,不同荔枝品种基因组大小有一定的差异。     

梨花药愈伤组织诱导和悬浮培养体系的建立及应用

【目的】建立梨悬浮细胞体系，并利用悬浮细胞体系获得高质量悬浮细胞，进行遗传转化和原生质体的分离。【方法】以新梨7号花药为试材，诱导获得梨花药愈伤组织，研究了细胞悬浮系建立和影响悬浮细胞增殖的主要因子。【结果】花药在1/2 MS+1.0 mg·L^-12,4-D+0.4 mg·L^-1NAA+30 g·L^-1蔗糖+7 g·L^-1琼脂(pH值为5.8～6.0)培养基上诱导的愈伤组织，经4～5次继代得到了黄白色、颗粒状，状态相对较好的愈伤组织；将愈伤组织接种于液体培养基中，于28℃，200 r·min^-1的黑暗条件下悬浮振荡培养，经4～5次悬浮继代培养建立了悬浮细胞系，适宜的启动和增殖培养基为：MS+1.5 mg·L^-12,4-D+1.0 mg·L^-16-BA+30 g·L^-1蔗糖，细胞生长曲线呈“S”型，活细胞率达81.98%，近圆细胞率达83.66%，可作为遗传转化的受体，转化率为20.00%。也可直接用于原生质体的分...     

苹果花药培养不定胚形成的细胞学观察

【目的】通过对苹果花药离体培养过程中小孢子的发生及雄核发育的过程进行了系统的细胞学观察,明确花粉培养不定胚形成的关键时期和类型,为苹果花药培养小孢子不定胚形成的机理研究奠定基础。【方法】以‘嘎拉’苹果不同发育时期的花蕾为试材,采用石蜡切片技术对其小孢子发生和雄配子发育过程进行了解剖学观察,并对接种培养后的花药进行了切片制作,系统观察了小孢子不定胚的发育过程。【结果】单核期花粉经均等分裂后形成两个对称的两核细胞,然后持续多次均等分裂后形成多细胞(核)结构,进一步分化发育成不定胚。【结论】为苹果花药所获植物的单倍体来源提供了直接证明,有关苹果雄核发育的机理研究还需要通过小孢子培养进一步研究。     

‘奥迪亚’葡萄杂交后代胚挽救及无核性状分子鉴定

【目的】为了研究影响杂交后代胚挽救萌发率的主要因素,并对其无核性状进行早期鉴定,【方法】以无核、抗病葡萄品种‘奥迪亚’为母本,‘玫瑰香’、‘摩尔多瓦’和‘红地球’3个主栽品种为父本进行杂交,通过L9(33)正交试验,建立简单高效的胚挽救体系,并用分子标记对杂交苗无核性状进行鉴定。【结果】结果表明,影响胚挽救萌发率的最关键因素为接种时期,其次为培养基种类和NAA浓度;以‘奥迪亚’为母本的杂交胚其适宜接种程序为授粉后49～56 d剥取胚珠,接种在B5或NN69培养基上充分发育70 d,再转入1/2 B5培养基上萌芽,‘奥迪亚’ב摩尔多瓦’杂交胚通过此程序萌发率达到了50.48%;经分子标记鉴定,各组合后代的无核株系均超过50%。【结论】利用胚挽救方法以‘奥迪亚’为杂交母本可高效创新葡萄无核种质。     

华东葡萄泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的抗白粉病特性分析

【目的】分析华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’的Ring型泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的转基因植株对葡萄白粉病的抗性,研究这2个基因的抗白粉病特性,为改良欧洲葡萄抗病性提供可用基因。【方法】利用同源克隆的方法获得中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的编码区序列(CDS);通过实时荧光定量PCR方法检测其在白粉菌诱导和水杨酸处理后的葡萄叶片中的表达;使用聚乙二醇(PEG)介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位;通过农杆菌介导法获得转基因‘无核白’和‘红地球’植株;经过苯胺蓝染色,利用血球计数板计数分析白粉菌在转基因植株叶片上的生长情况,鉴定转基因株系的抗病性。【结果】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3响应白粉菌和水杨酸处理,表达模式明显区别于感病对照‘赤霞珠’。中国野生华东葡萄‘白河-35-1’VpUIRP2蛋白定位在细胞质,VpUIRP3蛋白定位无特异性。通过农杆菌介导的遗传转化获得4个VpUIRP2的转基因‘红地球’株系和1个‘无核白’株系,转基因株系对白粉病表现出抗性。【结论】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2能增强葡萄对白粉病的抗性,可以作为抗病基因用于改良欧洲葡萄的抗病性。     

小果甜柿组织培养快繁技术

【目的】建立小果甜柿组培快繁技术体系，实现小果甜柿组培苗的工厂化生产。【方法】以小果甜柿带芽嫩枝茎段为外植体，研究了外植体取材时间、灭菌方法、植物生长调节剂配比对其组织培养过程中外植体消毒、启动培养、继代培养、生根培养的影响。【结果】适宜小果甜柿外植体取材的时间为4月、6月；选择75%酒精10 s+0.1%氯化汞8 min的组合进行消毒，外植体成活率达76.67%；以(1/2N)MS+2.5 mg·L^-1ZT+0.1 mg·L^-1NAA为启动培养基，外植体萌芽率达78.33%；以(1/2N)MS+2.0 mg·L^-1ZT+0.1 mg·L^-1NAA为继代培养基，平均增殖系数在1.77以上；以1/2 MS+1.0 mg·L^-1IBA为生根培养基，生根率达74.73%，平均根数3.33条，平均根长2.60 cm。【结论】构建了小果甜柿组培快繁技术体系，为小果甜柿组培苗的工厂化生产提供参考依据。     

荔枝霜疫霉对烯酰吗啉的抗性风险评估

【目的】检测荔枝霜疫霉对烯酰吗啉的敏感性，建立敏感性基线；测定抗烯酰吗啉突变株的生物学适合度，为荔枝霜疫病的化学防治提供依据。【方法】采用菌丝生长速率法，对2019—2020年来自中国广东、广西、福建、四川和云南5个省份荔枝主产区的320株荔枝霜疫霉单孢子囊菌株进行烯酰吗啉敏感性测定，通过药剂驯化获得抗烯酰吗啉突变株，测定其生物学适合度。【结果】经过异常值分析并剔除，317株荔枝霜疫霉菌株对烯酰吗啉的敏感性频率分布呈正态分布，EC₅₀值介于0.086 3～0.173 3μg·mL^-1之间，平均(0.122 2±0.000 9)μg·mL^-1，以此建立荔枝霜疫霉对烯酰吗啉的敏感性基线。来自2020年的荔枝霜疫霉菌株对烯酰吗啉的EC₅₀均值较2019年显著增高。3株荔枝霜疫霉抗烯酰吗啉突变株的抗性指数介于77.17～360.11之间，为中到高抗水平，抗药性可稳定遗传，与亲本相比，抗性突变株的孢子囊萌发率及卵孢子产量均下降，但致病力相当。【结论】荔枝霜疫霉对烯酰吗啉敏感，烯酰吗啉可继续作为防治荔枝霜疫病的...     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

荔枝GA信号途径基因LcPIF4的克隆及其功能分析

【目的】克隆荔枝GA信号途径的LcPIF4基因,并对其序列特征、表达特点、基因功能、亚细胞定位及互作蛋白进行研究。【方法】利用花穗RNA-seq数据对LcPIF4基因进行生物信息预测及分析,通过qRT-PCR对LcPIF4基因在不同组织的表达进行研究,并在表达水平上分析其对烯效唑的响应。通过拟南芥转基因株系的构建对其基因功能及亚细胞定位进行分析,同时利用酵母双杂分析其与Lc DELLA-1蛋白的互作。【结果】克隆的荔枝LcPIF4基因ORF长1 617 bp,编码539个氨基酸,且具有经典的APB结构域和HLH结构域。qRT-PCR结果表明,LcPIF4基因在花穗、叶片、果皮等器官表达水平较高,且烯效唑处理后其表达水平显著下降。转基因试验表明,在拟南芥中过表达LcPIF4基因可促进下胚轴生长,且过表达LcPIF4-YFP的转基因材料可在细胞核位置检测到荧光信号。酵母双杂交结果表明,LcPIF4与赤霉素途径阻遏蛋白LcDELLA-1存在直接的蛋白互作。【结论】荔枝LcPIF4蛋白具有拟南芥PIF4蛋白相同的结构域;LcPIF4在花穗中高表达,且其表达被烯效唑所抑制。LcPIF4可促进拟南芥下胚轴生长,其编码蛋白定位于细胞核。LcPIF4蛋白与Lc DELLA-1在酵母中存在互作。     

新高系梨雄性不育的鉴定

在砂梨( Pyrus pyrifolia Nakai) 中首次发现新高系梨绝大多数品种为雄性不育品种(品系) ,运用5种方法对其进行了鉴定: 形态学观测花药、花粉情况; 花粉离体培养法; 整体染色透明法对花药显微观测; 石蜡切片解剖法对大蕾期花药、花粉囊、花粉显微观测; 田间授粉试验。结果表明: 新高系梨9个品种中除‘早生黄金’梨为雄性可育品种外, 其它8个品种即‘新高’、‘黄金’、‘水晶’、‘荣山’、‘天皇’、‘金秋’、‘晚大新高’、‘农家新高’均无正常花粉或正常花粉极少, 为花粉败育, 属孢子发生性雄性不育类型, 且其雄性不育程度存在一定差异。