云南苹果产区苹果茎沟病毒(ASGV)的发现及其分子变异

【目的】为了查明云南省苹果产区的苹果茎沟病毒病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的侵染情况和不同来源分离物间的分子变异情况,【方法】以云南昭通、丽江、昆明、曲靖等地采集的325份苹果病毒样品为试材,采用RT-PCR技术对其是否携带ASGV进行检测,运用DNAMAN6.0、MEGA5.0对实验获得的6个分离物和GenBank上已登录的34个分离物进行序列比对分析。【结果】ASGV在云南各大苹果产区的发病率高达48%。序列比对结果显示,这些分离物的核苷酸序列相似性为87.3%～93.8%,氨基酸序列相似性为90.7%～98.7%。系统发育树显示,云南的6个分离物聚为一簇,而陕西省苹果分离物YL06与云南省分离物ZT1、TJX1亲缘关系比较近,聚为一支;ASGV苹果分离物要明显区别于ASGV梨分离物和CTLV柑橘分离物。【结论】云南省苹果产区苹果树的ASGV带毒率高达48%,推测可能是一种发生率比较普遍的病毒病,这是云南省发现的首次报道。系统发育树显示:本研究获得的6个苹果分离物明显区别于其他寄主分离物,并且与其他地区的分离物具有一定差异,推测在我国,ASGV的分子变异与寄主/地域来源存在着一定的相关性。     

基于宏病毒组测序技术的苹果病毒病鉴定与分析

采用宏病毒组测序技术（Virome Sequencing Technology）对河南地区染病苹果树进行病毒检测与分析,从建库测序的苹果叶片中共检测出13种病毒,其中有5种苹果病毒：苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus,ASGV）、苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus,ASPV）、苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leafspotvirus,ACLSV）、苹果坏死花叶病毒（applenecroticmosaicvirus,Ap NMV）和苹果绿皱缩相关病毒（apple green crinkle associated virus,AGCa V）。对病毒检测结果中的5种苹果病毒进行RT-PCR验证,扩增后均获得目的条带,与宏病毒组测序检测结果一致,表明宏病毒组测序检测结果精准可靠。根据测序结果设计特异性引物对ASPV全长进行扩增,得到1条长度为9 246 nt的ASPV-HN分离物基因组,与NCBI数据库中已报道的19个ASPV分离物的基因组核苷酸序列一致性为75.48%～79.85%;宏病毒组测序拼接所得的两条长度均...     

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法,【方法】以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的成龄苹果树韧皮部为试材,根据基因库中苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)的外壳蛋白基因序列,设计合成了2对特异性引物,分别与合成的苹果茎沟病毒(ASGV)引物和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的引物组合配伍,筛选出最佳的引物对组合。对cDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化,对PCR过程中cDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明,反转录引物为Oligo(dT)18、总RNA 0.1～3.0μL时,可以得到较好的cDNA;ASPV-FR与ASGV-Pch、ACLSV-Pch引物组合优于ASPV-Pch,并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合;cDNA用量为2.0~4.0μL、退火温度为50.0~52.9℃、循环数为35时,扩增效果较好。采用优化的多重RT-PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测,并用3种病毒的单重RT-PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性,充分印证了该多重RT-PCR体系的准确性,适用于大量样品的快速检测。     

苹果茎沟病毒吉林沙果分离物全基因组序列分析

通过RT-PCR结合RACE技术扩增到苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）吉林沙果分离物（ASGV-JLSG）全长基因组（登录号：FM616381）,共含有6 496个核苷酸（nt）,编码两个彼此重叠的开放阅读框（Open reading frame,ORF）。ORF1（37 ~ 6 354 nt）编码1个241 kD的多聚蛋白,含有甲基转移酶（Methyltransferase）、木瓜蛋白酶（Papain-like-protease）、解旋酶（Nucleotide triphosphate-binding helicase）、RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）和C端的外壳蛋白（Coat protein,CP）等结构域。ORF2（4 788 ~ 5 750 nt）编码1个36 kD的运动蛋白（Movement protein,MP）。ASGV-JLSG分离物与GenBank公布的29个ASGV分离物全基因核苷酸序列一致性为79.20% ~ 86.60%。系统发育分析结果表明,30个ASGV分离物分成2个组,分离物间没有表现出寄主专一性和地理分布规律。重组分析发现,ASGV-JLSG分离物是苹果茎沟病毒黄花梨分离物（ASGV-HH,JN701424）和柑橘碎叶病毒满头红分离物（CTLV-MTHK,C588948）的重组体。本研究中获得的ASGV-JLSG分离物基因组是来源于中国东北地区的首个ASGV基因组序列。     

苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析

利用RT-PCR技术对采自6个苹果品种和7个梨品种的33个样本中的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 进行了检测, ASPV感染率为63% ( 19 /33) 。对6个ASPV中国分离物外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因进行了扩增、克隆和测序, 测序结果显示CP基因全长为1 191 nt, 编码397个氨基酸。中国分离物与GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为70.2% ～91.7%。系统进化分析显示不同ASPV分离物分为3个大的类群, 呈现一定的寄主相关性, 并未呈现明显的地理相关性。第一和第三大类群的寄主皆为苹果, 第二大类群包含6个梨分离物和2个苹果分离物。不同ASPV分离物的抗原指数差异较大, 推断可能由于序列变异引起抗原表位变异, 从而引起血清型差异。     

3种苹果潜隐病毒多重RT-PCR检测体系的建立

 研究建立了能同时检测苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV) 、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) 和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 的多重RT-PCR方法。以复合感染3种病毒的苹果‘望山红’组培苗为试材, 对影响多重PCR的反应条件进行了一系列的调整和优化。多重RT-PCR体系灵敏性测验显示, 最低能从RNA总量187.5 ng的样品中检测3种病毒的存在。多重RT-PCR产物的序列与报道的病毒序列有较高的同源性, 12个田间苹果样品的多重RT-PCR检测结果与单一PCR的结果一致, 初步证明了多重RT-PCR检测的准确性。     

3个苹果新品种病毒病的发生状况及ASSVd序列分析

【目的】近年来，苹果病毒病的发生日趋严重，对产业的健康发展造成了严重影响，但是其在苹果新品种瑞阳、瑞雪、瑞香红上的发病状况尚不明确。【方法】在2021—2022年采用RT-PCR方法对白水地区198份新品种样品进行病毒病检测，并对感染苹果锈果类病毒（apple scar skin viroid,ASSVd）植株的果实症状进行了调查和基因克隆、测序。【结果】检测结果显示白水地区新品种潜隐性病毒的感病率显著高于非潜隐性病毒，其中苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）的检出率最高，达到了91.72%，其次是苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus,ASGV）和苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus,ASPV），检出率分别达到了77.16%、37.13%，苹果坏死花叶病毒（apple necrotic mosaic virus,ApNMV）的检出率为30.31%，苹果锈果类病毒和苹果凹果类病毒（apple dimple fruit viroid, ADFVd）的检出率接近10%；通过对新品种...     

四个苹果砧木和品种苹果潜隐性病毒的变温热处理脱毒效果分析

以同时携带ASPV、ACLSV、ASGV 3种潜隐性病毒的"八棱海棠"、"小金海棠"、"华红"和"JAZZ"组培苗为试材,分别采用2种变温热处理方式结合茎尖培养的脱毒方法,运用RTPCR技术对组培苗内病毒进行跟踪检测,研究了不同苹果品种和砧木对变温热处理结合茎尖培养脱除苹果潜隐性病毒的反应以及脱毒苗的适宜检测时机。结果表明:变温热处理条件不同,病毒脱除效果不同。同一热处理条件下,不同苹果基因型其病毒脱除率也不同。"小金海棠"脱毒率最高,"JAZZ"和"八棱海棠"次之,"华红"最低。同时,不同病毒种类的被脱除率存在差异,ASPV最容易脱除,ACLSV居中,ASGV最难脱除。脱毒完成后180d,病毒总检出率最高;220d,3种病毒均有检出,检出顺序为ASGV最先,ACLSV次之,ASPV最晚。因此,对脱毒苗进行多次跟踪检测十分必要。     

东北冷寒产区苹果褪绿叶斑病毒检测及其分子多样性分析

采用RT-PCR对从东北地区和内蒙古自治区8个采样点采集的165份小苹果枝条样品进行了苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的检测,ACLSV的平均检出率为60.6%,说明ACLSV在中国东北和内蒙古自治区普遍发生。对其中25份样品中ACLSV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因进行了克隆和测序,结果表明25个ACLSV分离物CP基因核苷酸序列一致性为84.0%～99.7%,编码蛋白氨基酸序列一致性为90.7%～99.5%;与其他ACLSV分离物CP基因核苷酸一致性为67.7%～99.7%,氨基酸一致性为71.0%～99.5%。世界范围内已报道的ACLSV分离物分成B6、P205、SHZ和Ta Tao5等4个组,本研究中的25个ACLSV分离物分别属于B6、P205和SHZ组;在25个ACLSV分离物间无重组事件。     

苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ASPV外壳蛋白基因（coat protein,cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品构建标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线决定系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应;其最低检测限为1.31 × 102 copies ? μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,适用于田间样品中ASPV的快速定量检测。     

采用RT—PCR技术检测苹果病毒

研究建立了危害仁果类果树的苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的RT—PCR检测体系。其检测灵敏度高,专一性强,为仁果类果树的病毒检测提供了一种分子生物学检测方法。应用该体系对田间的苹果树携带上述三种病毒的情况进行了调查,发现单独感染率和复合率均很高,达84.2%～100%。     

苹果锈果类病毒实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立苹果锈果类病毒(ASSVd)检测灵敏的方法。【方法】根据Gen Bank中ASSVd的RNA序列设计特异性引物ASSVd-F和ASSVd-R,利用实时荧光PCR方法对其进行检测,并对体系的特异性、灵敏性及适用性进行验证。【结果】实时荧光PCR体系能检测至1×10-6的模板浓度,而常规RT-PCR只能检测至1×10-4,由此可知,实时荧光PCR体系灵敏度高于常规RT-PCR 100倍;引物特异性强,能特异检测ASSVd,对苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)均不能检出;适用性广,可检测出植物不同部位的ASSVd。【结论】所建立的方法能够灵敏检测ASSVd,特异性强,适用性广。     

苹果无融合生殖砧木病毒检测

利用RT-PCR方法检测无融合生殖砧木采种母树的带毒状况。结果表明,平邑甜茶、小金海棠、青砧一号、青砧二号等砧木的采种母树不同程度带有苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)等3种潜隐病毒,带毒株率0~13%。应当重视由此可能给苗木繁殖和研究利用带来的不良影响。     

4个苹果品种和2种砧木试管苗对热处理脱毒效应的研究

本试验采用变温热处理结合茎尖培养对4个苹果品种和2种砧木组培苗脱除潜隐性病毒的效应进行了研究.结果表明:不同的苹果品种和砧木耐热性不同.其中王林、珠美海棠的耐热性最强,L-6、金矮生的耐热性居中,首红、天汪1号耐热性最差.在相同处理条件下,不同的苹果基因型脱毒率存在差异.其中王林脱毒效率最高,3种病毒的同时脱除率达到100％;金矮生 ACLSV和ASPV两种病毒的同时脱除率达到100％;ASGV的脱除率也在80％以上;株美海棠、L-6、天汪1号、首红的脱除率较低.另外,不同病毒种类脱除的难易程度也存有差异,ACLSV最容易脱除,ASGV最难脱除,ASPV居中.     

苹果潜隐病毒脱除技术的改进研究

<正> 目前,已报道侵染苹果的病毒有30余种,其中大部分可在苹果的叶、果实和枝条上引起明显症状。另外,有些病毒在栽培品种上呈潜伏性感染,又称潜隐病毒。已经鉴定出我国苹果潜隐病毒有3种:苹果褪绿叶斑病毒(A-CLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果茎痘病毒(ASPV)。潜隐病毒由于其潜隐性,在栽培中不易被发现清除,我国苹果主要栽培区上述3种苹果潜隐病毒的感染株率达90％以上,每年使苹果减产约40％～73％。     

苹果砧木组培苗的脱毒与检测

苹果病毒病的发生严重影响了我国苹果产业的发展,培育脱毒苹果苗木非常重要。为了解苹果砧木组培苗的病毒病携带情况,以课题组保存的13个苹果砧木组培苗为材料,使用RT-PCR检测脱毒处理后样品中的苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)。结果显示,BP、W8N13、唐木田含有ASGV;HCT-2、BP、W8N13含有ACLSV;ME-2含有Apscaviroid;所检样品均未检出ASPV。试验获得5份无病毒苹果砧木组培苗。     

利用Y2H筛选西方烟中与苹果茎痘病毒CP互作的蛋白

苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus,ASPV）是苹果和梨树上普遍发生的潜隐病毒之一，西方烟（Nicotianaoccidentalis）是其重要的草本寄主之一。在本研究中，构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP(CP-BD)，并从西方烟cDNA文库中筛选与ASPV CP互作的蛋白。经通过酵母双杂交回转验证和NCBI BLAST比对，获得30种可能与ASPV CP互作的西方烟蛋白质，为研究ASPV侵染致病的分子机制及CP在侵染过程中的功能打下基础。     

山楂属植物中苹果褪绿叶斑病毒的RT-PCR检测及病毒脱除方法

【目的】建立优化的山楂属植物苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的RT-PCR检测体系,获得以山楂组培苗为试材的高效ACLSV脱除方法。【方法】基于转录组高通量测序解析的山楂属植物ACLSV基因组序列设计病毒检测引物,比较c DNA模板浓度、Taq DNA聚合酶种类及采样部位对病毒RT-PCR检测效果的影响。通过组培苗热处理和培养基中添加三氮唑核苷来脱除山楂植株中的ACLSV。【结果】基于转录组高通量测序获得的2个ACLSV山楂分离物的全基因组序列设计并筛选出适合于山楂属植物ACLSV的RT-PCR检测引物。建立了优化的山楂属植物ACLSV的RT-PCR检测体系。对80份山楂样品进行病毒检测,其中有18个样本检测出ACLSV,带毒率为22.5%。比较了热处理(37℃、30d)、化学处理(培养基中添加20 mg·L-1的三氮唑核苷,处理40 d)、热处理与化学处理结合方法(处理30 d)3种方法对山楂组培苗中ACLSV的脱除效率,表明热处理或热处理与化学处理结合的方法能够完全脱除山楂中的ACLSV,而单独化学处理的脱毒率不能达到100%。【结论】建立了优化的山楂属植物ACLSV的RT-PCR检测体系,表明组培苗热处理是脱除山楂植株中ACLSV的有效方法。     

苹果茎痘病毒内蒙古分离物基因组序列和生物学特征研究

利用RT-PCR结合RACE技术获得了苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)内蒙古‘金红’苹果分离物(ASPV-NM)全长基因组序列(登录号:MK239268)。该分离物基因组除去Poly A尾共有9 286个核苷酸,与17个已经报道的ASPV分离物全长基因组序列核酸一致性为70.6%～79.2%;基于全长基因组、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)基因和外壳蛋白(Coatprotein,CP)基因分别将分离物ASPV-NM划分到组Ⅲ、组Ⅲ和组Ⅰ;在ASPV-NM基因组中检测到1个显著的重组事件;将ASPV-NM摩擦接种到西方烟37B上,可引起显著的褪绿黄化症状,利用透射电子显微镜可以观察到典型的病毒粒子。     

利用3''''和5''''RACE克隆新疆梨树苹果茎痘病毒末端序列

采用RACE技术对库尔勒香梨苹果茎痘病毒进行研究,获得了梨树苹果茎痘病毒5'和3'末端序列.研究结果表明,本试验采用的3'和5'末端快速扩增技术(3'RACE和5'RACE技术)能很好地扩增苹果茎痘病毒的末端序列,分别获得了长度为329 bp和367 bp的片段,通过与NCBI核酸数据库中已经发表的序列NC_003462进行比对分析,发现梨树ASPV 3'末端含有131个核苷酸非编码序列,具有poly(A)尾,5'末端含有34个核苷酸非编码序列,其同源性与已发表的序列分别为78%和84%,为获得梨树ASPV病毒全长基因组和基因组功能结构分析奠定了基础.