蒺藜苜蓿全基因组中U-box基因家族的筛选与特征分析

植物基因组中广泛存在U-box基因,其编码蛋白大部分作为泛素系统中决定底物特异性识别的E₃泛素连接酶,广泛地调控植物生长生殖发育以及响应逆境胁迫等过程。本文利用蒺藜苜蓿基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定蒺藜苜蓿U-box家族基因;采用MEGA6软件进行系统进化树分析;通过GSDS在线工具和Mapinspect软件进行基因结构及染色体定位分析;利用已有的蒺藜苜蓿芯片数据进行组织表达和胁迫响应表达分析。结果表明,蒺藜苜蓿基因组中含有41个U-box基因,不均匀地分布于蒺藜苜蓿的8条染色体上。根据结构域组成和系统进化分析将这些U-box蛋白分成6类。基因表达模式分析发现,该家族成员的表达具有一定的组织特异性,并能响应盐、干旱和氮素胁迫。这些研究结果为蒺藜苜蓿U-box基因家族的功能分析奠定了基础。     

蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因组分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一类在种子胚胎发育后期特异表达并受发育阶段及脱水信号调节的脱水保护蛋白,在响应植物干旱、低温、高盐等逆境胁迫中具有重要功能。本研究利用生物信息学手段,在全基因组水平对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)LEA基因家族进行分析,并对其进化、基因结构、进化压力、染色体定位及基因表达模式进行了系统分析。本研究共筛选出23个蒺藜苜蓿LEA家族基因,可分为8个亚家族。基因定位结果表明,23个蒺藜苜蓿LEA基因分布于除6号染色体外的其他7条染色体上,但分布不均匀;家族成员外显子数目都不超过两个,结构简单。不同组织表达谱分析结果显示,LEA家族基因具有不同的组织表达模式,并受干旱逆境胁迫调控。本研究结果可为蒺藜苜蓿LEA基因家族的功能分析奠定基础。     

蒺藜苜蓿cation/H+ exchanger基因家族鉴定及表达特征分析

CPA（cation proton antiporter）超家族通过转运质子和一价金属离子调节细胞内离子和pH稳定。阳离子质子转运体（cation/H⁺ exchanger,CHX）基因家族属于CPA2（cation proton antiporter 2）超家族,其N端有一个Na⁺/H⁺ exchanger结构域,对植物维持细胞离子平衡、花器官发育起着至关重要的作用。通过生物信息学手段,系统地分析了蒺藜苜蓿CHX家族基因,通过全基因组筛选共鉴定出47个MtCHXs;染色体定位分析表明蒺藜苜蓿CHX基因分布在8条不同的染色体上;同源性分析显示蒺藜苜蓿和拟南芥亲缘关系近,而与水稻亲缘关系远;进一步进化关系分析将47个MtCHXs基因分为5组,并且各组内成员在基因结构和基序上比较保守;顺式作用元件分析发现MtCHXs基因启动子包含大量光响应元件、激素响应元件以及干旱、低温、创伤响应元件;表达特性分析发现MtCHXs在生殖器官中高表达,并且响应干旱、低温等非生物胁迫。     

蒺藜苜蓿MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析

植物中MYB转录因子数量众多,功能多样,在植物生长发育、逆境响应等多方面发挥着重要作用。为研究MYB转录因子在蒺藜苜蓿中的功能,本研究采用PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtMYB16基因,该基因开放阅读框1074 bp,共编码357个氨基酸。进化树分析结果显示,MtMYB16蛋白与白花草木樨中MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,MtMYB16蛋白定位在细胞核中。酵母自激活检测结果显示,MtMYB16蛋白具有自激活活性,自激活结构域位于C端。表达分析结果显示,MtMYB16在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花、果实中均有表达,在根中表达水平最高;IAA、MeJA能够降低MtMYB16表达水平;盐胁迫和干旱胁迫下,MtMYB16表达量在1.0 h时迅速增加,说明MtMYB16可能具有响应盐及干旱胁迫的功能。     

全基因组水平蒺藜苜蓿CPP基因家族的鉴定及表达模式分析

CPP （cysteine-rich polycomb-like protein）基因家族是一类小转录因子，广泛存在于除酵母与原核生物外的各种生物体中，在植物生长发育及响应胁迫过程中具有重要作用。截至目前，CPP基因家族已在多个物种中被鉴定和研究，但在豆科模式植物蒺藜苜蓿中还未见报道。本研究采用生物信息学的方法，在蒺藜苜蓿中共鉴定出9个CPP基因。通过与3个物种CPP基因的蛋白序列构建系统发育树，将CPP基因分为3类，MtCPP成员与大豆的亲缘关系更接近。保守结构域分析表明MtCPP转录因子都具有1~2个CXC保守结构域。染色体定位分析得出，9个CPP基因分布在6条染色体上，并鉴定出2对旁系同源基因，均来源于片段重复事件。通过基因芯片技术检测MtCPP基因的表达模式结果显示，MtCPP基因的表达具有一定的时空特异性。MtCPP基因启动子中含有大量与激素以及胁迫相关的顺式作用元件，并且MtCPP2、MtCPP5、MtCPP6和MtCPP7基因具有响应干旱的表达特征，MtCPP2和MtCPP8基因具有响应盐胁迫的功能。该研究可为后期深入解析MtCPP基因家族功能和筛选参与苜蓿抗逆的MtCPP基因奠定基础。     

干旱胁迫下赖草抑制性消减文库的构建与分析

用根际水分胁迫对赖草（Leymus secalinus）植株进行干旱胁迫,利用抑制消减技术,以干旱胁迫处理为tester,正常生长对照组为driver,构建了包含576个克隆的赖草消减cDNA文库。通过斑点杂交筛选,得到16个EST序列,大小居于100~310 bp。Blast比较发现,这些序列与大麦（Hordeum vulgare）和小麦（Triticum aestivum）干旱诱导下表达的序列、甜菜碱醛脱氢酶核酸序列、植物热激蛋白hsp70核酸序列、1,5 二磷酸核酮糖羧化酶氨基酸序列、植物遍在蛋白缀合酶氨基酸序列、植物50S核糖体蛋白L20基因序列等相关抗旱基因具有较高的同源性。以上结果说明,本研究得到了部分赖草抗旱相关基因片段,可为赖草抗旱机理的研究以及抗逆基因的克隆奠定一定的基础。     

16个苜蓿品种幼苗期抗旱性综合评价

为了给抗旱苜蓿(Medicago sativa L.)品种培育和筛选提供理论依据,同时筛选抗旱品种,试验采用室内盆栽法对16个苜蓿品种幼苗在3个水分梯度下进行干旱胁迫处理,通过形态与生理指标变化分析和隶属函数标准差系数赋予权重法对抗旱性进行综合评价。结果表明:植株高度、叶片面积、根系活力与干旱胁迫强度呈显著负相关,而游离脯氨酸和丙二醛含量、可溶性糖质量分数与干旱胁迫强度呈显著正相关,但叶绿素含量对干旱胁迫程度响应不一致;16个苜蓿品种幼苗抗旱性强弱依次为MT4015北极熊金皇后先行者旱地英斯特公农1号巨能7WL343HQ巨能2惊喜公农5号3010驯鹿阿尔冈金斯贝德。说明MT4015、北极熊、金皇后的抗旱性较强。     

CO_2浓度倍增及干旱胁迫对紫花苜蓿光合生理特性的协同影响

为探讨CO_2浓度倍增和干旱胁迫对紫花苜蓿(Medicago sativa)生理作用的协同效应,采用人工气候室和控水试验模拟CO_2浓度倍增和干旱胁迫,分析了植物光合和抗逆生理特征的变化规律。结果表明:干旱胁迫与CO_2浓度倍增对苜蓿光响应参数影响显著,二者之间具有一定的交互作用,在干旱胁迫下,CO_2浓度倍增减缓了苜蓿叶片气孔导度(G_s)、蒸滕速率(T_r)和光饱和点(LSP)的降低幅度,而对最大净光合速率(P_(max))、胞间CO_2浓度(C_i)和表观量子效率(AQE)没有减缓作用。CO_2浓度倍增下的水分利用效率(WUE)高于正常CO_2浓度,而与水分含量关系不大。干旱胁迫与CO_2浓度倍增对苜蓿光合色素、丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量影响显著,干旱胁迫在一定程度上降低了叶绿素a(chl a)、叶绿素b(chl b)的含量和叶绿素总量,显著增加了叶片MDA和Pro含量,CO_2浓度倍增有增加这些光合色素含量、降低MDA和Pro的趋势;但2个因素之间没有显著交互作用。干旱胁迫和CO_2浓度倍增对苜蓿叶绿素荧光参数影响不一,干旱胁迫和CO_2浓度倍增对叶绿素荧光参数具有较强的交互作用,CO_2浓度倍增对植物体光合电子传递过程中的保护作用在植物受到干旱胁迫时更加明显。因此,在干旱、半干旱地区,干旱胁迫对苜蓿光合生理功能产生不利的影响,而CO_2浓度倍增对苜蓿的生长具有一定的施肥效应,当2个因素共同发生时,CO_2浓度倍增可以减缓水分胁迫对苜蓿的伤害,增强其抗旱能力,提高水分利用效率,缓解干旱胁迫的负面效应。     

4种苜蓿属植物幼苗的抗旱性研究

本文研究了4种苜蓿属(Medicago)植物:2个俄罗斯的黄花苜蓿品种(M. falcata L. cv. Daviluya;M. falcata L. cv. Culuskaya)和采自我国内蒙古锡林郭勒盟的野生黄花苜蓿(M. falcata L.),公农I号紫花苜蓿(M. sativa L. cv. GongNongⅠ)的幼苗在3个土壤水分梯度下(对照(CK)、中度干旱(M)、重度干旱(S))对干旱胁迫的响应,比较其抗旱性,为我国优良苜蓿品种的选育奠定基础。结果表明:随着胁迫强度的增加,幼苗的株高、根长、分枝、根颈直径、叶面积和生物量显著下降,相对叶面积、茎叶比显著升高;叶片脯氨酸含量和电解质外渗率显著升高,光合作用显著下降。将胁迫指数用SPSS进行聚类分析显示:GongNongⅠ和Daviluya各自为一类,Culuskaya和野生黄花苜蓿聚为一类。对抗旱指标进行综合评价可知:Culuskaya抗旱能力较强,适宜在干旱、半干旱地区种植。     

沟叶结缕草高温胁迫的基因差异表达及其作用机制

为了从基因表达水平研究沟叶结缕草(Zoysia matrella)高温耐热性的分子机制,利用SSH方法构建了沟叶结缕草对高温(40℃)处理响应的正向差减文库.通过reverse northern杂交方法筛选文库,挑选出高温胁迫处理下35个差异表达基因,对这些基因进行测序,并将测序所得结果与基因组数据库(NCBI)进行比对,从而获得了26个基因功能已知的差异表达基因.这些已知基因分别参与信号转导、植物代谢、植物抗逆性反应、基因表达调控和蛋白质合成等过程.     

蒺藜苜蓿耐酸铝性状的全基因组关联分析

铝毒害是酸性土壤耕种的主要限制因素,每年造成大量作物减产。蒺藜苜蓿是紫花苜蓿的一年生近缘种,广泛分布于世界各地,是紫花苜蓿遗传改良的重要基因资源。本研究利用蒺藜苜蓿群体的耐酸铝性状差异,进行全基因组关联分析,筛选蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的遗传位点,共得到58个与蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的SNP标记。对其周围基因进行功能注释分析,发现这些SNP位点主要参与苜蓿的细胞壁、脂质代谢、环境胁迫响应过程、氧化还原反应过程以及小分子转运等过程。最后,通过基因组选择方法将发掘SNP标记应用到蒺藜苜蓿耐酸铝性状的预测,预测准确性达到0.80,这说明本研究发掘的SNP标记可以用于蒺藜苜蓿及其近缘物种紫花苜蓿耐酸铝性状的遗传改良。     

蒺藜苜蓿lncRNA167及其剪切产物miR167c的鉴定和功能分析

长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的功能性RNA分子,lncRNA在植物生长发育以及生物和非生物胁迫响应过程中发挥着重要作用。lncRNA常与microRNA（miRNA）关联发挥作用。本研究从蒺藜苜蓿中克隆一个预测的新lncRNA,该lncRNA与蒺藜苜蓿miR167c在染色体上位置重合,命名为Mt-lncRNA167,并推测Mt-lncRNA167作为Mt-miR167c的剪切前体发挥作用。靶基因预测分析结果表明,生长素响应因子6/8（auxin response factor 6/8）是miR167c的两个靶基因。表达模式分析表明,Mt-lncRNA167主要在叶中表达,Mt-lncRNA167和Mt-miR167c对100 mmol·L^-1 NaCl、5% PEG 6000和4 ℃低温胁迫处理均有响应,与Mt-lncRNA167启动子顺式作用元件功能预测结果一致。在盐、干旱、低温胁迫条件下,Mt-lncRNA167与Mt-miR167c表达模式基本相同,与靶基因ARF6/8表达模式相反。Mt-lncRNA167与Mt-miR167c超表达转化拟南芥植株表现出生育缺陷的表型,即果荚和花丝显著缩短,花药不能正常释放花粉,花粉活力降低。盐和干旱胁迫下发芽率结果表明Mt-lncRNA167和Mt-miR167c超表达植株抗性优于野生型。此外,Mt-lncRNA167和Mt-miR167c超表达植株下胚轴显著长于野生型。综合以上,推测Mt-lncRNA167作为Mt-miR167c的前体发挥作用,Mt-miR167c抑制ARF6/8基因的表达,Mt-lncRNA167-Mt-miR167c-ARF6/8作用网络在蒺藜苜蓿抗逆和发育调控方面发挥重要作用。     

GsCRCK基因转化农菁1号苜蓿及其耐盐性分析

GsCRCK基因是参与胁迫早期应答的钙/钙调素调控的受体类蛋白激酶基因,研究发现GsCRCK正向调控拟南芥对NaCl和ABA胁迫的耐性,将耐盐蛋白激酶基因GsCRCK转化苜蓿,对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现实意义。本研究采用农杆菌介导法将其转入农菁1号苜蓿,获得大量抗性植株。经 PCR和RT-PCR检测证明GsCRCK基因已整合到农菁1号苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。对获得的2个转基因株系进行耐盐性分析,在300 mmol/L NaCl条件下进行胁迫处理,测定处理0,3,6,9,12,15 d后的质膜透性、丙二醛(MDA)和叶绿素(Chl)含量,以及胁迫15 d时的SOD活性;并统计400 mmol/L NaCl处理15 d时各株系的死亡率。结果显示,300 mmol/L 高盐胁迫15 d后转基因苜蓿仍能正常生长,而野生型苜蓿则遭受盐害严重;转基因苜蓿的相对电导率极显著低于野生型,MDA含量也显著低于野生型,而Chl含量和SOD活性都显著高于野生型;在400 mmol/L NaCl处理下,2个转基因株系的死亡率分别为13.33%和10.00%,明显低于野生型植株(63.33%)。表明GsCRCK基因的导入提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆、亚细胞定位及表达特征分析

Delta24-甾醇还原酶(Delta24-sterol reductase, DWF1)是油菜素内酯(Brassinosteroide, BR)合成途径中的关键酶，在植物生长发育中起着关键性的作用。为了研究DWF1基因在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的功能，本试验从蒺藜苜蓿R108中克隆MtDWF1基因全长序列，该基因开放阅读框(ORF)1 704 bp,编码567个氨基酸，分子量65.911 kD,理论等电点为8.53。亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞质内。进化分析表明，蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)、红三叶(Trifolium pratense)及豌豆(Pisum sativum)亲缘关系较为接近。MtDWF1基因在蒺藜苜蓿根、茎、叶中均有表达，在茎和叶中的表达水平较高。外源激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)能够明显提高MtDWF1表达，水杨酸(Salicylic acid, SA)能够显著降低MtDWF1表达水平。同时，经油菜素内酯诱导后，MtDWF1表达水平整体呈现增加趋势。本研究为进一步探索MtDWF...     

紫花苜蓿配子体发育遗传调控的研究进展

紫花苜蓿种子的实际产量远低于潜在产量,胚珠败育是导致这一现象的主要因素,而胚珠败育从本质上讲就是雌、雄配子体发育不正常。所以,紫花苜蓿的配子体发育与其产量具有极为重要的关系。紫花苜蓿的雄蕊和心皮分别属于第三、四轮花器官。这2个组织生成的雄、雌配子体是紫花苜蓿完成有性生殖所必需的。本研究在总结拟南芥、水稻和玉米等模式植物配子体遗传调控的基础上,紧密结合豆科模式植物蒺藜苜蓿等配子体的发育,从遗传学、分子生物学和细胞学等角度详细地总结了紫花苜蓿有性生殖中雌配子体、雄配子体发生和发育的研究进展。     

一种新的蒺藜苜蓿遗传杂交方法

遗传杂交技术是开展遗传研究的基本工具,也是研究基因功能的必要手段之一。虽然对豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的研究愈来愈多,但其遗传杂交技术因难度较高而只被研究蒺藜苜蓿比较悠久的科研团体掌握。为了便于更多实验室能够掌握该项技术,本文在已报道的蒺藜苜蓿杂交方法的基础上提出了一种新的杂交技术。研究内容包括蒺藜苜蓿的花果发育周期、花解剖结构、不同发育时期花的花药发育、遗传杂交程序、母本花的选择标准以及杂交鉴定等。本研究所提出的蒺藜苜蓿杂交方法与已有其它杂交方法相比,具有操作难度低、杂交后无需特殊护理措施、杂交成功率高等特点。     

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)叶片衰老的转录组分析

为探究蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）叶片衰老过程中相关基因的分子机制及代谢通路,本研究以其成熟叶片和衰老初期、中期、末期叶片为研究对象。通过转录组测序,比较4个发育阶段样品之间的转录组差异。结果表明,与成熟叶片相比,共筛选出2 990个差异表达基因（DEGs）,在所有衰老样本中表达水平均发生显著变化,其中有2 684条（89.77%）可进行基因功能注释;同时利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果证实了转录组测序的可靠性。进一步分析发现,DEGs涉及高等植物转录因子33个家族,包括ERF、WRKY、bHLH、MYB、NAC和bZIP。此外,还发现了837个与叶片衰老相关的基因。本研究发现了蒺藜苜蓿叶片衰老过程中大量差异表达的基因,为进一步分析蒺藜苜蓿叶片发育和衰老的调控机制提供参考。     

紫花苜蓿atpA基因的克隆及表达模式分析

叶绿体atpA基因位于ATP合酶的CF₁上,编码α亚基,是光合作用不可缺少的关键基因。本研究利用RT-PCR技术,从‘新疆大叶’苜蓿(Medicago sativa L.‘Xinjiang Daye’)中克隆出atpA基因,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术进行基因表达模式检测。结果显示,MsatpA基因编码510个氨基酸,相对分子质量为55.71 KD,等电点为5.22。MsAtpA蛋白含有多个磷酸化位点且无跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋占比最高;亚细胞定位预测该基因编码的蛋白位于叶绿体中,与同为豆科苜蓿属的黄花苜蓿(Medicago falcata)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的AtpA氨基酸序列同源性较高。表达模式检测结果显示,MsatpA基因在叶中的表达量最高,根中最少;结荚期的基因表达量显著高于其他发育时期;MsatpA基因响应低温、高温、盐和渗透胁迫应答,且呈现出不同的表达特点。研究结果为紫花苜蓿atpA基因功能研究奠定基础。     

两种紫花苜蓿苗期耐盐生理特性的初步研究及其耐盐性比较

为研究2种紫花苜蓿:肇东苜蓿和农菁1号苜蓿的耐盐程度及其在盐胁迫处理下的生理反应规律,在1/2 Hogland营养液水培条件下,用0,50,100,200,300,400 mmol/L NaCl溶液模拟盐胁迫处理2种紫花苜蓿幼苗,观察记录各处理的盐害情况,分别测定胁迫前和胁迫3,6,9,12,15,21 d的丙二醛(MDA)、叶绿素(Chl)和脯氨酸(Pro)含量,分析了不同胁迫程度和胁迫时间下相关生理指标的变化情况,并采用隶属函数法对二者的耐盐性进行了综合评价。结果表明,低浓度盐胁迫对其生长无显著影响,2种苜蓿具有较强的耐盐性,能够抵抗一段时间较高浓度(200 mmol/L)的盐胁迫。随着浓度的增加,MDA含量逐渐升高,但随胁迫时间的延长,在200,300 mmol/L处理下,2种苜蓿的MDA含量表现出先增加,后下降,然后又上升的动态变化趋势。随着胁迫浓度的增加和时间的延长,二者受到的盐害逐渐增大,Chl含量逐渐降低,Pro含量大量累积,但二者的Pro累积程度与它们的耐盐表现并不完全一致。综合评价结果表明,在100,200 mmol/L NaCl胁迫下,农菁1号苜蓿比肇东苜蓿更耐盐;而300,400 mmol/L NaCl处理时,肇东苜蓿的耐盐性大于农菁1号苜蓿。