实时荧光定量PCR技术在检测外源基因拷贝数中的应用

通过对PCR法、Southern Blot法、IPCR法与实时荧光定量法4种转基因外源基因检测方法的比较认为:PCR扩增虽十分灵敏,但有时会出现假阳性扩增,因而对外源基因是否整合还需进行验证.Southren方法准确性高,特异性强,但存在费时、费力的缺点.同时实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA,而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后,一般都比较细弱,不宜大量取样.IPCR法虽可以转座突变分离基因,但当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时,由于T DNA整合到染色体中引起插入突变并分离基因造成误差.实时定量PCR技术的特异性和高信噪比为转基因拷贝数定量提供了方便,实时定量PCR法,花费试剂少、节省劳力和时间,需要DNA样品量少、并不进行放射检测.同时对实时荧光定量PCR法计算进行了详细介绍.     

番木瓜pds基因时空表达的荧光定量PCR分析

以番木瓜黄果肉品种Dwarf solo和红果肉品种Sunrise solo为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对2个番木瓜品种的不同组织器官以及果实发育成熟过程中5个时期的八氢番茄红素脱氢酶基因(pds)表达进行分析.结果表明,在2个番木瓜品种的果实、花、叶片中,pds转录水平上均有表达,但不同组织部位pds表达量存在差异,在成熟果实中最高,其次为花、叶;在2个番木瓜品种的果实成熟过程中,pds的表达逐渐增加,以在红果中的增加变化更为明显,且pds在红果肉中的表达量高于黄果肉.因此,pds基因可能在调控番木瓜果肉颜色形成中起重要作用.今后将对番木瓜果实中psy、zds、lcy-e等基因的表达进行分析,以全面研究番木瓜类胡萝卜素合成及果肉颜色形成的机理.     

实时荧光定量PCR应用技术综述

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高灵敏度的核酸定量技术。使用EB加入PCR反应体系,经改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度,其优势性决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。与传统PCR技术相比,实时定量PCR能够更加快速、灵敏,并有效地对核酸进行实时定量检测。     

实时荧光定量PCR技术及其在植物中的应用

阐述了实时荧光定量PCR技术的基本原理及方法,综述了近几年实时荧光定量PCR技术在转基因植物、植物病害及与植物表皮气孔变化相关激酶检测过程中的运用情况;展望了实时荧光定量PCR反应在植物核酸定性、定量检测及分析其在植物中的应用前景。     

CPT-I基因荧光定量PCR检测方法的建立

CPT-ImRNA的表达对研究奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢具有重要作用,CPT-I在肝脏中脂肪酸从细胞浆转移到线粒体过程中起关键作用。本研究应用双标准曲线方法,建立了CPT-I基因的相对荧光定量方法。结果表明,所建立的SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测CPT-I基因具有较好的效果,为肝细胞CPT-I基因定量分析奠定了基础。     

CHRNA7基因荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测烟碱型乙酰胆碱受体(nicotine acetylcholine receptors,nAChRs)α7亚基基因(CHRNA7)的表达,笔者根据人源CHRNA7基因序列设计引物,PCR扩增CHRNA7基因,亚克隆到pMD-18T载体中后,测序鉴定并制备重组质粒,以梯度稀释的重组质粒为模板,进行荧光定量PCR来绘制标准曲线,并进行灵敏度和重复性实验,成功建立了检测CHRNA7基因的荧光定量PCR方法。该方法最低可检测10~1 copies·μL~(-1),且重复性良好,在10~4,10~5,10~6 copies·μL~(-1)时,5次重复的变异系数分别是1.22%,1.90%,2.63%。此外,还对人宫颈癌细胞SiHa和人正常宫颈细胞Ect1/E6E7中α7 nAChR亚基基因表达量进行检测,结果显示,α7 nAChR亚基在SiHa细胞系的表达明显低于其在Ect1/E6E7细胞系中的表达(P=0.015)。     

实时荧光定量PCR技术在番茄研究中的应用

随着实时荧光定量PCR技术的不断完善和发展,该技术越来越受到人们的青睐。它以快速、灵敏、高特异性和安全性高等优点广泛应用于科学研究等各个领域。近年来,实时荧光定量PCR技术在番茄的各研究领域不断深入,大大提高了番茄的病害检测能力、特异基因的表达水平和转基因的检测效率。     

荧光实时定量PCR研究GA负调控因子基因在棉花纤维不同发育时期的表达模式

棉花纤维发育经历起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期、脱水期共4个发育时期。为了了解GA负调控因子基因在整个纤维发育时期的调节作用,采用敏感的实时定量PCR对GA负调控因子基因Gh RGL在棉花纤维不同发育时期中的转录水平进行了定量研究,通过提取来源于不同纤维发育阶段[包括-3~0 DPA(开花后)胚珠,3 DPA胚珠,5 DPA胚珠,10 DPA胚珠,15 DPA纤维,25 DPA纤维]的样品总RNA,探讨不同发育时期Gh RGL基因的表达模式。结果显示,Gh RGL基因在所有被选的样品中都有表达,其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中转录水平较高,在10 DPA胚珠中表达水平最高,在-3~0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维中的表达水平较低,表明Gh RGL基因在纤维伸长期表达水平较高,暗示Gh RGL可能对纤维伸长起着重要作用。     

用实时荧光定量RT-PCR方法定量绵羊PrP基因的表达

为快速、准确定量绵羊PrP基因的mRNA,建立了绵羊PrP基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法。根据已报道的绵羊PrP基因序列,设计合成引物;采用RT-PCR方法扩增目的片段;构建标准重组质粒制备标准曲线,用于样品检测。结果发现,中枢神经系统组织PrP基因的表达量(copies/ng总RNA,39420)比外周组织(为7845)的高;在中枢神经系统中,脑干的PrP基因的表达量最高(为67020);外周器官中,淋巴结PrP基因的表达量最高(为29086),肾脏的表达量最低(为125)。建立绵羊PrP基因实时荧光定量PCR方法,对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析,为进一步研究绵羊组织器官的PrP表达在传染性海绵状脑病发生中的作用提供基础数据。     

实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。近年来,实时荧光定量PCR技术在植物检疫研究上不断深入,大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平。综合论述了实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。     

鸭RLRs和IFN基因SYBRGREENⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

首次建立以GAPDH为内参,同时检测鸭RIG-I、MDA5、IFN-α和IFN-γ等4种mRNA相对表达量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法(RT-FQ-PCR)。以目的基因的克隆质粒为标准品,建立标准曲线,并进行熔解曲线、重复性及稳定性分析。该方法 Ct值线性范围为12.0~32.0;目的基因(RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-γ)和内参基因(GAPDH)的扩增效率均在95%~105%,其相关系数均在0.99以上;扩增产物的熔解曲线都只出现1个特异性单峰,无引物二聚体或其他非特异性产物生成,RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-γ和GAPDH的Tm值依次为(81.9±0.33)、(81.9±0.32)、(93.6±0.23)、(81.8±0.28)、(87.8±0.24)℃,其敏感度均达到100copies·μL-1,重复性和稳定性好,为从mRNA水平上深入研究RIG-I样受体、干扰素与鸭机体免疫功能相关性奠定了基础。     

鲜切马铃薯实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]选择鲜切马铃薯实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析中合适的内参基因。[方法]以受到高温、光照等胁迫的鲜切马铃薯为材料,应用qRT-PCR技术,分析18S rRNA、GAPDH、Actin和EF1a 4个常用内参基因的表达情况。[结果]经GeNorm软件分析发现,当利用qRT-PCR分析比较鲜切马铃薯中的基因表达差异时,可选择Actin作为校正内参基因。[结论]该研究为进一步开展鲜切马铃薯分子生物学研究奠定了方法学基础。     

实时定量PCR检测逆境下盐芥ABI1基因表达水平

运用实时定量PCR的方法对盐芥ABI1基因在干旱、ABA、冷和盐胁迫下的表达情况进行了检测,并对ABI1在耐盐植物中的抗逆能力进行了分析,为粮食作物的耐逆性改良奠定基础。     

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为快速检测出食用肉类中掺假物质,确保消费者切身利益,维持正常市场秩序,提升贵州省产品质量监督检验的检测能力,采用实时荧光定量PCR对猪源性成分和牛源性成分进行检测.结果表明:荧光PCR可以用来检测猪、牛等动物源性成分,且检测灵敏度为1％;荧光PCR检测动物源性成分提高了检测效率及灵敏度,降低了假阳性机率.     

山羊痘病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中山羊痘病毒(AY077835)gp063基因DNA序列,应用Beacon Designer 7.0软件,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,同时制备含有靶DNA序列的pEASY-T1重组质粒标准品。通过引物、探针浓度的筛选及反应条件的优化,建立了山羊痘病毒TaqMan法实时荧光定量PCR。该方法组内和组间重复试验变异系数均低于2%,最低浓度检测极限值为1×100copies/μL,上机检测时间少于40 min。运用该方法对不同时期流行于云南局部的山羊痘临床组织病料进行定量检测,生成的标准曲线斜率(Slope)为-3.36,截距(Intercept)为41.08,相关系数(R2)为0.999 989,阳性对照及送检样品抽提DNA中病毒含量依次为:P(TK)2.70×105copies/μL,华坪(HP)毒株1.45×106copies/μL,景谷(JG)毒株5.12×105copies/μL,保山(BS)毒株2.96×105copies/μL,宣威(XW)毒株1.86×105copies/μL,永胜(YS)毒株1.36×103copies/μL。结果表明:所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适合于山羊痘的早期检测。