外施硫酸根和蛋氨酸对大豆胱硫醚-γ-合成酶基因GmCGS表达的影响

大豆蛋白中蛋氨酸等含硫氨基酸含量偏低,探究蛋氨酸合成过程关键酶胱硫醚-γ-合成酶编码基因Gm CGS表达规律,对于改善这一缺陷具有十分重要的意义。本研究以过表达At D-CGS转基因大豆株系及其受体品种Jack为材料,从上游物质硫酸根和下游产物蛋氨酸两方面入手,探究硫酸根和蛋氨酸对Gm CGS在转录水平上的影响。结果显示,较高浓度的硫酸根会促进野生型材料中该基因的表达,抑制转基因材料中该基因的表达;蛋氨酸处理之后,对Gm CGS的表达没有显著影响;转基因株系中,Gm CGS表达量显著低于野生型材料中该基因表达量。以上结果说明通过外界硫肥等栽培措施的改变只可以小幅度改变Gm CGS表达量,难以有效改善大豆蛋氨酸含量偏低的缺陷,这为提高大豆蛋氨酸含量提供了一定的理论参考。     

高蛋氨酸转基因大豆的鉴定和遗传稳定性分析

为通过基因工程改善植物蛋白氨基酸组成,在获得种子特异性表达拟南芥蛋氨酸合成途径关键基因At D-CGS转基因大豆的基础上,通过自交繁殖和性状鉴定,筛选出纯合转基因株系中作CGS-ZG11,并利用该株系与普通大豆品种石豆5号杂交,选育出中作CGS14J890等含有At D-CGS基因、综合性状优良的大豆新品系。本研究通过PCR和Southern blot检测,证明目的基因At D-CGS整合到中作CGS-ZG11基因组,以单拷贝形式存在。RT-PCR、Western blot结果显示,At D-CGS在转录和翻译水平上稳定表达。高效液相色谱测定结果表明,中作CGS-ZG11籽粒蛋氨酸含量显著高于野生型,且含量在T6、T7和T8连续3代相对稳定。大豆新品系中作CGS14J890等蛋氨酸含量高、综合性状好,证明At D-CGS基因可在不同的遗传背景下稳定遗传与表达。     

大豆转录因子GmNAC8的克隆及耐旱性功能分析

大豆转录因子GmNAC8在耐旱材料和敏感材料中明显差异表达,该基因CDS序列全长1 092bp,编码363个氨基酸残基。通过软件预测,蛋白质相对分子质量为41.82k D,等电点为8.51,其N-端含有42aa组成的NAC保守结构域,C-端高度变异。进化树分析表明,该蛋白与菜豆、红豆、绿豆同源关系最近。在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析表明GmNAC8蛋白定位于细胞核。转录水平表达分析表明,GmNAC8基因在转基因株系叶中的表达量要明显高于根中的表达量;GmNAC8基因受0.1mmol/L IAA和ABA诱导表达量显著上升,受GA和SA抑制。GmNAC8基因在拟南芥中超量表达可以使拟南芥叶片更绿,耐旱能力增强。抗旱生理指标检测表明,在干旱处理10d后,转基因拟南芥叶中蛋白质含量、脯氨酸含量、POD活性均高于野生型拟南芥,丙二醛含量明显低于野生型拟南芥,仅为42%。本研究结果为进一步研究GmNAC8在植物耐旱反应中的分子机理奠定基础。     

叶肉细胞特异表达焦磷酸化酶基因OsIP1在不同源库类型水稻品种中的效应

 将水稻自身焦磷酸化酶基因OsIP1置于叶肉细胞特异表达启动子下,利用农杆菌介导法将嵌合基因cyFBPase:OsIP1分别导入“源限制型” 水稻品种中超123和“库限制型” 品种农垦57。 根据荧光定量PCR结果和农艺性状,筛选高表达且农艺性状没有明显改变的T2转基因纯合株系,用以检测和分析在水稻叶肉细胞中特异性过表达水稻焦磷酸化酶基因的效应。初步的研究结果显示：1）在营养生长期,转基因株系的最高茎蘖数和穗数比各受体亲本均有不同程度的提高,尤其是在分蘖性较强的品种上;2）在籽粒灌浆结实期,叶片、叶鞘中可溶性总糖、蔗糖和淀粉含量在整个灌浆期的变化趋势与对照相似,且多数转基因植株叶片和叶鞘中的蔗糖含量（除了灌浆高峰期时的叶鞘）均显著高于对照;3）转基因株系单株干物质量较野生型对照有显著提高。单株产量呈现不同程度的增加,其中“源限制型”品种中超123转基因株系单株产量较对照增幅达显著水平。     

大豆GmPRP转基因拟南芥抗盐性鉴定

为研究大豆脯氨酸富集蛋白基因Gm PRP在植物应对盐胁迫中的作用,利用前期克隆的Gm PRP基因,以p PZP为植物表达载体,构建了由组成型启动子Ca MV35S驱动Gm PRP基因的植物表达载体。通过Floral dip法对拟南芥进行遗传转化,获得7株阳性转基因株系。盐处理后,转基因拟南芥的种子萌发率高于野生型且叶片中丙二醛含量极显著低于野生型,表明Gm PRP提高了转基因拟南芥的抗盐性。     

盐生草HgNHX1基因在大麦株系中的功能验证

为了探讨盐和干旱环境胁迫对转盐生草液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因HgNHX1大麦幼苗生长及抗逆性生理指标的影响,以转HgNHX1基因大麦及野生型株系为材料,分析盐(150 mmol· L^-1 NaCl)和自然干旱环境下转基因大麦幼苗的生长特性及生理指标的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,随着胁迫时间的延长,转基因株系中HgNHX1 基因相对表达量逐渐上升;干旱胁迫条件下,转基因株系中HgNHX1 基因相对表达量呈先上升后下降的趋势,在处理3 d时达到最高。且在胁迫处理的三个不同时间点,转基因株系的相对含水量和游离脯胺酸含量均高于野生型株系,而相对电导率和丙二醛含量均低于野生型株系。这些结果说明,转基因株系中HgNHX1基因能够应答盐和干旱胁迫,具有提高大麦耐盐、抗旱性的功能。     

转TaDREB3基因大豆的品质等同性分析

将抗逆基因TaDREB3转入大豆品种东农50,得到3个稳定遗传的株系,并将T4代株系种子播于大田中。对3个转TaDREB3基因株系及非转基因对照株系的种子分别进行蛋白质含量、油份含量、脂肪酸含量、异黄酮含量等品质性状的等同性分析,研究转化外源基因TaDREB3后大豆原有品质性状是否有改变。结果表明：3个转基因株系和对照植株相比,蛋白质含量、油分含量和脂肪酸含量均没有显著性差异;转基因株系1的大豆黄素虽然和对照差异显著,但是异黄酮总含量和对照没有显著性差异。说明TaDREB3基因的导入并没有改变大豆的品质性状。     

转Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(AlNHX1)大豆纯合系筛选及生理分析

为了获得转Na+/H+逆向转运蛋白基因(Al NHX1)大豆纯合株系并验证其盐胁迫条件下生理反应,对转Al NHX1基因T3代材料进行了PCR筛选和RT-PCR鉴定,并在水培条件下研究了纯合系植株耐盐性、K+/Na+比值、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量和相关抗氧化酶活性变化。结果显示经PCR和RT-PCR鉴定,野生型植株没有出现目的条带,而转基因株系有相应的目的条带,表明Al NHX1基因已经整合到大豆基因组中并正常转录。在盐胁迫条件下,转基因各株系成活率明显高于野生型对照,地上部干重和根部干重较野生型显著增加,达到了显著差异水平(P0.05)。此外,在盐胁迫条件下,转基因幼苗能维持根和叶中较高的K+/Na+比值,同时伴随着植株体内MDA和H2O2含量的下降以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化酶(POD)的增加。本研究结果表明供试外源Al NHX1基因在大豆高代材料中超表达,提高了转基因大豆耐盐能力,可为进一步培育适应盐渍化土壤环境下生长的大豆新品种提供重要的种质资源。     

高温胁迫下黄嘌呤脱氢酶基因超表达对水稻幼苗的保护作用

【目的】黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase, XDH)是嘌呤代谢的关键酶。通过分析高温胁迫对OsXDH超表达转基因水稻株系幼苗叶片生理指标的影响,探究XDH缓解水稻高温胁迫的生理机制。【方法】以OsXDH超表达转基因株系(xdh1和xdh5)及受体品种日本晴(WT)为材料,研究了高温胁迫对水稻幼苗叶片叶绿素含量、相对含水量、可溶性蛋白含量、活性氧代谢、抗氧化酶活性、XDH活性及嘌呤代谢产物尿囊素(allantoin)和尿囊酸(allantoate)含量等生理指标的影响。【结果】高温胁迫处理前,超表达株系的叶绿素含量、相对含水量、可溶性蛋白含量、活性氧代谢及抗氧化酶活性等生理指标均与野生型无显著差异;高温胁迫5 d,超表达株系的叶绿素、相对含水量、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性均高于野生型,而过氧化氢(H₂O₂)及丙二醛(MDA)的含量显著低于野生型;适温恢复生长5 d,野生型和超表达株系的叶绿素含量、相对含水量及可溶性蛋白含量均有所提高,超表达株系均高于野生型,H₂O₂ 和MDA的含量降低,超表达株系均低于野生型;受高温诱导超表达株系与野生型中XDH酶活性及尿囊素和尿囊酸的含量均提高,且在整个处理过程中超表达转基因株系均高于野生型。【结论】XDH通过调控酰脲类物质的合成,补偿自身的抗氧化能力并增强抗氧化酶系统的活性,从而有效提高水稻幼苗对高温胁迫的耐受能力。     

玉米耐盐基因ZmHKT1;5在烟草中的功能验证

HKT类基因是与植物耐盐性密切相关的一类基因。在作物中HKT蛋白可通过排出Na+来维持植物体内的Na~+/K~+平衡,从而影响植物耐盐性。通过在烟草中过表达玉米ZmHKT1;5基因,验证该基因具有提高植物耐盐性的作用。结果表明,过表达ZmHKT1;5基因的T0代材料即显示出叶片耐盐能力的明显提高;T2代转基因株系种子在含盐培养基上的发芽能力明显强于野生型材料,T2代转基因株系幼苗阶段的耐盐能力也得到了明显的提高。通过比较在盐胁迫后2月龄的转基因材料和野生型材料的生理指标,发现野生型材料中MDA和H_2O_2的含量相较转基因材料发生了更为明显的上升,说明转基因材料中过表达ZmHKT1;5基因有效降低了盐胁迫引起的过氧化物积累。综合转基因验证的结果,证明ZmHKT1;5基因具有提高植物耐盐性的作用。     

Elevated methionine content in soybean seed by overexpressing maize β-zein protein

Soybean provides superior and readily available protein for human and livestock. However, nutritional value of soybean is limited due to the deficiency of an essential amino acid, methionine. To improve total methionine content of soybean, a methionine-rich seed storage protein, β-zein, was introduced into soybean cultivar ’Jack’ under the control of legumin B4 promoter or CaMV 35S promoter. Totally 4 T₃ transgenic lines exhibited higher expression levels of foreign genes, and legumin B4 promoter directed a stronger accumulation of β-zein protein than CaMV 35S promoter. Compared to wild type plant, total methionine content in transgenic soybean seeds significantly increased by up to approximately 15%. Although the introduction of β-zein gene improved total methionine content, the level was negligible compared to native soybean storage proteins, implying that the inadequate soluble methionine is the limiting factor. Based on these observations, a new strategy for simultaneously increasing the “source” and “sink” of methionine metabolism is proposed to further improvement of total methionine content in soybean seed.     

转α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代的生理生化特性分析

本研究对已获得的转α-微管蛋白基因SoTUA的T₂代甘蔗株系进行PCR扩增及测序,从检测阳性的转基因甘蔗中选6个转基因株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）与非转基因野生型甘蔗对照（WT）进行了低温胁迫（4 ℃）处理,在处理0、5、10 d测定甘蔗叶片丙二醛（MDA）和渗透调节物（可溶性糖、可溶性蛋白）含量以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,并采用RT-qPCR法分析了低温处理下甘蔗叶片α-微管蛋白基因的表达情况。结果表明：在4 ℃低温处理下,6个转SoTUA基因甘蔗与WT中α-微管蛋白的转录因子表达量随着胁迫时间的延长上调表达。胁迫后5、10 d转基因株系的相对表达量始终高于WT甘蔗,低温处理10 d时转基因T1显著高于其他株系（P<0.05）。在低温胁迫下,甘蔗的MDA含量逐渐增高,而转基因甘蔗增幅显著低于WT甘蔗,10 d时转基因株系MDA的含量比WT低41.77%（P<0.05）;POD活性在不同株系之间变化趋势不同,但转基因甘蔗POD活性显著高于WT甘蔗（P< 0.05）;转基因T1、T2、T4、T6株系的SOD活性随着胁迫天数增加呈现先增加后减少的趋势,而WT与转基因T3、T5的SOD活性逐渐升高;甘蔗的可溶性糖含量逐渐上升,转基因甘蔗的可溶性蛋白含量在0 d显著高于野生型甘蔗,胁迫后变化趋势在株系之间有所差异;转基因甘蔗SoTUA相对表达量与可溶性糖含量呈极显著的正相关。利用隶属函数综合分析评价,抗寒性排序结果为：T3>T2>T1>T5>T6>T4>WT。在低温胁迫下,转基因甘蔗SoTUA基因的上调表达能提高甘蔗的抗寒性,且具有遗传稳定性。     

一个水稻铜锌SOD酶基因在应答亚砷酸盐胁迫中的作用

【目的】水稻Os08g44770.1基因编码一个铜锌SOD酶,但其在响应亚砷酸盐[As(Ⅲ)]胁迫中的生物学功能未知。本研究旨在深入揭示由该基因调控水稻砷耐性改变的分子机理并为水稻抗逆育种提供理论参考。【方法】以野生型日本晴(WT)和2个Os08g44770.1过表达转基因株系为试材,通过胁迫处理、生理指标测定和基因表达分析等,系统探究了转基因植株对As(Ⅲ)的耐受性表现,并初步揭示了其调控水稻砷耐性的生理和分子机理。【结果】与WT相比,过表达转基因株系对As(Ⅲ)更加敏感;转基因植株在砷胁迫下的根系相对伸长量、生物量(干质量)、叶绿素含量、根系细胞质膜完整性、叶片抗氧化程度等均显著低于WT;Os08g44770.1在砷处理后的WT和转基因植株叶片中的表达模式略有不同,但均表现为处理24 h时被显著诱导表达。【结论】过度表达Os08g44770.1基因可导致水稻的砷耐受性极显著下降。     

转GmHSFA1基因大豆的耐热性评价

在高温胁迫条件下对11个转GmHSFA1基因的大豆品系及其受体的GmHSFA1及靶基因GmHSP70、GmHSP22和GmHSP17.9的表达和生理生化、光合特性及产量性状变化进行了研究,并采用胁迫系数与灰色关联分析相结合方法,对转基因大豆材料耐高温能力进行综合评价。结果表明:多数转基因大豆品系在常温和热诱导条件下GmHSFA1及靶基因GmHSP70、GmHSP22和GmHSP17.9表达水平明显高于非转基因受体;高温处理后,绝大多数转基因材料的脯氨酸含量增幅都要明显高于非转基因受体,丙二醛含量除HTH-4以外增幅均小于非转基因受体,可溶性糖含量增幅全部高于非转基因受体材料。多数转基因材料的光合性状与产量性状降幅均小于非转基因受体。关联度分析表明与非转基因受体相比,有9个转GmHSFA1基因品系的耐热能力得到明显提高。     

橡胶树ICE转录因子对盐胁迫的响应及功能鉴定

ICE（inducer of CBF expression）是类似MYC（myelocytomatosis）的bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子,在植物应对低温、干旱、高盐等非生物胁迫中起重要的调节作用。本研究通过qPCR分析橡胶树ICE家族成员的表达模式。结果表明：5个ICE家族成员均响应盐胁迫上调表达。在盐胁迫2 h时,HbICE2、HbICE3、HbICE4和HbICE5显著上调表达;在盐胁迫4 h时,HbICE4和HbICE5的表达量达到最大值,其中HbICE4的上调幅度最大;HbICE1在盐胁迫4 h内无显著变化,但在处理8 h时显著上调表达。过表达这5个ICE家族成员均可不同程度地提高拟南芥的耐盐性,其中过表达HbICE4的植株对盐胁迫的抗性最强,在盐胁迫下,野生型拟南芥（WT）全部枯萎,而HbICE4转化植株的存活率为96.29%,平均单株鲜重为0.03 g,平均单株干重为0.0035 g,在HbICE家族成员转化株系中均表现最高。在盐胁迫下,WT和HbICEs转基因植株的电导率均显著增加,叶绿素含量和相对含水量均显著降低,其中HbICE4转化植株的相对电导率的增加幅度最小,叶绿素含量和相对含水量的降低幅度最小。因此,HbICE4转化植株的抗盐性可能与增强膜系统的稳定性和减缓叶绿素降解和保持相对含水量有关。该研究结果对橡胶树HbICE家族成员的生物学功能有了新的认识,有望为改良农作物耐盐性提供候选靶基因。     

ZmLTP3 基因提高转基因拟南芥抗盐性的研究

通过RT-PCR方法从玉米中克隆了一个拟南芥LTP3 的同源基因,并命名为ZmLTP3。RT-PCR分析发现,ZmLTP3 的表达可以被多种生物和非生物胁迫因子所诱导。通过构建植物表达载体,把ZmLTP3 的全长cDNA转化到拟南芥中,以野生型为对照,检测转ZmLTP3 基因纯合体株系的抗盐性。结果表明,在盐胁迫条件下,转基因拟南芥生长状况较好,植株鲜重、干重、种子产量以及脯氨酸含量显著高于野生型株系,丙二醛含量和外渗电导率显著低于野生型株系,转基因拟南芥提高了抗盐性。     

利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量

利用冻融法将大豆11S球蛋白GY1基因RNA干扰表达载体转入农杆菌EH105中,以大豆"吉农28"为受体,通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法导入大豆,获得T1代转基因苗12株,并对得到的转基因植株进行分子生物学鉴定。PCR和Southern杂交检测表明,RNAi植物表达载体p3301-Gy1已成功插入到转基因大豆植株的基因组DNA中;RT-PCR和SDS-PAGE检测结果表明RNA干扰在转录后水平发挥了作用,11S球蛋白表达含量降低;利用BUCHI N-500型近红外谷物分析仪对转化的大豆蛋白质和脂肪含量进行检测,结果转化植株的籽粒蛋白质含量(36.07%)平均降低1.43个百分点,脂肪含量(21.28%)平均提高0.76个百分点。因此,利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量是可行的。     

转TaDREB3基因大豆基因漂流距离及频率的研究

为明确转基因大豆的种植及生态安全性,将导入抗逆基因TaDREB3的转基因大豆T4代播种于大田,周围种植非转基因对照,收获转基因大豆周围不同距离的非转基因大豆种子.经过连续2a的田间及盆栽试验,通过除草剂草丁膦的筛选和分子检测等手段,研究了转TaDREB3基因大豆的基因漂流距离及漂流频率.结果表明:在三叶期整株喷洒75 ...