猪圆环病毒2型与3型双重PCR检测方法的建立

【目的】建立针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的一种双重PCR检测方法。【方法】先优化猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的单独PCR检测方法条件,在此基础上优化这2种猪圆环病毒的双重PCR检测方法条件,之后进行其特异性与灵敏度的检测,并进行初步临床应用检测。【结果】建立的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型双重PCR检测方法对猪圆环病毒1型、猪细小病毒、伪狂犬病病毒等当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性,检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的灵敏度分别是610、800 copies/μL。该方法对120份仔猪样品的检测结果显示,猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的检出率分别为56.7%和38.3%,虽然稍低于各自单独PCR检出率;但并没有显著差异(P0.05),且与单独PCR检测方法的符合率都达到95%以上。【结论】建立了一种特异性强、敏感性高的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法,为区分猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型提供了一种快速检测方法。     

猪圆环病毒 2型 LAMP 诊断方法 的建立及初步应用

根据 GenBank 中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列,设计合成 2 对引物,通过对环介导等温,LAMP 扩 增条件的优化袁敏感性、特异性试验,成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAMP 诊断方法。 敏感性结果显示,建立的 LAMP 诊断方法最低核酸检测量为 0.30 pg/L袁而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/L曰特异性结果显示,猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95 份自然感染病猪样 品的检测结果表明,该 LAMP 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95.8%。 整个扩增反应可在 30 min 内完成,结 果肉眼可见,为猪圆环病毒 2 型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法,能够满足基层现场快速检疫的需要。     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

Ⅱ型猪圆环病毒SYBR GreenⅠ模式实时定量PCR检测方法的建立

登录GenBank下载猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV-2)的全基因组序列,根据其保守区域,设计1对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立该模式的实时定量PCR检测方法,构建了检测PCV-2型的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102～1.0×107拷贝·μL-1浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999。该方法用于猪圆环病毒2型的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪圆环病毒2型的快速检测。     

酵母双杂交筛选与杨树 Subgroup 4MYB 转录因子相互作用的蛋白质

根据 GenBank中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列、设计合成 2对引物、通过对环介导等温（LAM P）扩 增条件的优化、敏感性、特异性试验、成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAM P 诊断方法。 敏感性结果显示、建立的 LAM P 诊断方法最低核酸检测量为 0. 30 pg/ L、而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/ L;特异性结果显示、猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95份自然感染病猪样 品的检测结果表明、该 LAM P 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95. 8% 。 整个扩增反应可在 30 mi n内完成、结 果肉眼可见、为猪圆环病毒 2型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法、能够满足基层现场快速检疫的需要。     

猪圆环病毒2型LAMP可视化快速检测方法的研究

本研究旨在建立有效的针对猪圆环病毒2型(PCV2)的诊断技术及开发试剂盒。采用环介导等温扩增方法(LAMP)检测猪圆环病毒2型(PCV2),对PCV2的ORF2基因设计出3对特异性引物,扩增PCV2基因的最佳温度和时间优化到59℃孵育55 min。用该方法对临床样品进行检测,LAMP检测对PCV2的检测限为10拷贝/μL,而常规PCR检测法的检测限为1 000拷贝/μL,表明LAMP检测法灵敏度高。该检测法不会与猪圆环病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎的猪病毒和轮状病毒发生交叉反应。用建立起的LAMP检测法对1 100个临床样品进行检测,950个样品被检测出为阳性样品。稳定性试验表明该试剂盒可以耐受至少40次的反复冻融。结果显示,该方法建立的猪圆环病毒2型诊断方法灵敏度高,特异性强,稳定性好。     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR方法的建立及在藏猪猪圆环病毒检测中的应用

为同时并快速检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)与猪圆环病毒3型(PCV-3),并调查西藏林芝地区猪圆环病毒的感染情况,根据笔者所在实验室PCV-2和PCV-3单重PCR方法,建立检测PCV-2和PCV-2双重PCR的方法,构建标准质粒并经优化反应条件和反应体系后进行特异性和灵敏性的测定,并对西藏林芝周边地区藏猪粪便...     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重PCR方法。本研究根据GenBank中登录的PEDV和PCV3基因组序列,分别在M基因和Rep基因高度同源保守区设计2对特异性引物,建立了检测PEDV和PCV3双重PCR方法,即可同时扩增225bp(PEDV)和138bp(PCV3)2条特异性片段,而该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪博卡病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌核酸扩增均为阴性;PEDV和PCV3的最低检出量分别为428和325拷贝/μL,且特异性强、敏感性好,为快速、高效检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

猪圆环病毒3型微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立能灵敏、高效、准确诊断猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,并运用该方法研究PCV3传播特性及组织嗜性,根据GenBank中PCV3 ORF2基因(MF631813.1)的核苷酸序列,设计合成PCV3的引物和探针,通过退火温度以及引物、探针用量和特异性等优化,建立了PCV3微滴式数字PCR检测方法.试验结果表明建立的猪圆环病毒3型微滴式数字PCR检测方法具有较好高的灵敏性、重复性和特异性,最低能检测到1μl 16.35拷贝的质粒标准品,可用于猪圆环病毒3型的早期诊断.     

猪圆环病毒2型的分离与鉴定

以PCR方法,从疑似断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)自然病例的淋巴结和脾脏中扩增出预期长度的猪圆环病毒2型(PCV 2)的DNA片段,测序PCR产物,并对部分序列进行了同源性分析。结果显示,扩增产物与标准毒株的序列同源性均在98%左右,说明扩增产物具有良好的特异性,由此表明分离出的病毒为猪圆环病毒2型。对沪、苏、鲁、浙等地5个猪场进行检测,证实了猪圆环病毒2型的存在。     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的方法,参照GenBank上已登录的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法,并对其进行特异性、灵敏性、可重复性检验.特异...     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白抗体间接酶联免疫吸附测定方法的建立与应用

[目的]建立一种检测猪圆环病毒3型抗体的血清学方法.[方法]以猪圆环病毒3型衣壳蛋白为包被抗原,通过筛选和优化反应条件建立一种检测猪圆环病毒3型衣壳蛋白抗体的间接酶联免疫吸附测定方法,并进行特异性试验与重复性试验以及初步临床应用.[结果]确定检测猪圆环病毒3型衣壳蛋白抗体的间接酶联免疫吸附测定方法的各项最佳反应条件;仅有猪圆环病毒3型阳性血清的检测结果为阳性,显示出良好的特异性;批内变异系数和批间变异系数都小于5％,显示出良好的可重复性.在来源于北京地区与河北地区的318份猪的血清中检出猪圆环病毒3型衣壳蛋白抗体阳性率为32.70％,表明这两个地区存在较多的猪圆环病毒3型感染.[结论]建立了一种具有良好特异性和可重复性的检测猪圆环病毒3型衣壳蛋白抗体的间接酶联免疫吸附测定方法,可用于猪圆环病毒3型抗体的检测.     

猪圆环病毒1型LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒1型(PCV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为现场诊断提供技术支持,本试验根据GenBank公布的PCV1全基因组序列,在其保守区设计了4条特异性LAMP引物,并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样本检测,首次建立了PCV1的LAMP检测方法。结果表明,62℃水浴60 min为最佳反应条件;LAMP的检出限为1×10~1 copies/μL,普通PCR最低检测限为1×10~3 copies/μL;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)进行扩增,结果显示为阴性;应用该方法对103个临床疑似病料进行检测,阳性率为34.0%(35例),普通PCR阳性率为29.1%(30例),两种检测方法符合率为89.5%。本试验为PCV1临床检测提供了一种特异、快速、成本低廉的方法。     

猪博卡病毒 N P1 基因特异性的PCR 方法建立及应用

该研究根据Genbank公布的猪博卡病毒Porcine bocavirus,PBoV的核苷酸序列,在其NP1保守区域设计一对特异性引物,建立一种能扩增多种猪博卡病毒亚型的PCR检测方法,并进行特异性试验,敏感性试验,重复性试验及可靠性检测.结果显示:所建立的PCR检测方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型无交叉反应;敏感度可以检测到58pg/μL;经3次重复检测,结果一致,重复性好;对阳性产物测序,与Genbank公布的猪博卡病毒NP1序列同源性在97.3%以上,可靠性强.用建立的PCR方法对2011年重庆部分地区猪场的266份育肥猪血清样本进行检测,结果45份为猪博卡病毒阳性,证明了在重庆地区育肥猪中存在PBoV感染的情况.     

猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析（英文）

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在PK15细胞上增殖,特异性PCR检测可扩增出特异性片段,经PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%~96.8%;与AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ和AF055392属于基因型PCV2a,与PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区PCVAD的防控提供了理论依据。     

检测猪圆环病毒2型PCR方法的建立

[目的]为快速诊断猪圆环病毒病提供参考。[方法]根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,建立诊断PCV-2地方分离株的PCR方法。[结果]各物质在PCR反应中最佳浓度分别为:dNTP 220 pmol/ml,Taq酶0.1 U/μl,引物20 pmol/μl。从PCV-2阳性病料中提取DNA,在优化条件下进行PCR扩增,获得预期的494 bp特异性条带。用该PCR方法对PCV-2、PRRSV、HCVS、IV、PPV进行检测,PCV-2为阳性,而PRRSV、HCV、SIV、PPV检测均为阴性,未出现交叉反应,说明该PCR方法对PCV-2具有良好的特异性。该PCR方法可检出1.25 ng模板DNA,具备较高的敏感性。[结论]使用该PCR方法检测PCV-2是切实可行的。     

猪瘟病毒RT-nested PCR检测方法的优化和应用

为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳性毒和健康猪脾、肝组织及阴性PK-15细胞均未扩增出特异性条带,说明该方法特异性强。应用此方法对福建省133份病料进行检测,结果有60份病料为阳性,阳性率为45.1%。结果提示优化的检测方法灵敏度高,特异性强;福建省猪群CSFV感染率高,需要加强CSF预防控制工作。     

鸭圆环病毒和鹅圆环病毒三引物鉴别检测方法的建立

【目的】建立一种可同时检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR方法。【方法】根据已发布的鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组分子特征设计3条引物，应用3条引物建立了一种在一个反应管中可检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的三引物PCR方法。【结果】该方法可特异性扩增鸭圆环病毒和鹅圆环病毒，并根据扩增片段大小鉴别病毒种类，检测最低限分别为110、80 pg·μL^-1。应用该方法对临床疑似病例样品进行检测，其结果与用2种病毒对应的单病毒PCR检测方法一致。【结论】建立的三引物PCR方法特异性强，敏感性高，丰富了水禽圆环病毒病的临床病例的诊断及流行病学监测的技术手段。     

猪圆环病毒2型201105ZJ分离株的遗传变异分析

[目的]了解我国部分地区猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异特性。[方法]使用细胞传代的方法对 PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料进行病毒分离,并通过 PCR、IFA进行初步鉴定,并特异性扩增出该分离病毒的全基因组,并进行同源性和系统进化树分析。[结果]该研究成功分离出1株 PCV2毒株,并命名为201105ZJ株;该分离株能在 PK15细胞上增殖,特异性 PCR检测可扩增出特异性片段,经 PCV2阳性血清作用后,呈现特异性免疫荧光,其 TCID50偏低,为102.67;基因组全长1768bp,与13株参考毒株的序列同源性介于94.1%～96.8%;与 AF055392PCV2a的同源性最高,为96.8%;分离株201105ZJ 和AF055392属于基因型 PCV2a,与 PCV2c基因型亲缘关系较远。[结论]该研究中201105ZJ分离株的遗传变异特征对于疫苗的研发、PCV2致病机理的研究和华东地区 PCVAD的防控提供了理论依据。