结合不对称PCR技术构建鸡NDV-IBV-ILTV联合检测基因芯片

基因芯片(gene chip)是依据核酸杂交原理发展的一种生物新技术,在生命科学研究领域具有重要的应用价值.本研究将不对称PCR和基因芯片两种技术相结合,构建了同步检测鸡(Gallus gallus)传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的共检基因芯片.分别选取ILTV的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)和糖蛋白B(glycoproteins B,gB)基因、NDV的融合蛋白(fusion,F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(haemagglutinin-neuraminidase,HN)基因以及IBV的膜蛋白(membrane,M)和核衣壳(nucleocapsid,N)基因设计引物,从重组质粒菌中扩增制备探针基因,用乙醇沉淀法纯化后点制于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;靶基因用cy3标记引物,进行不对称PCR扩增,扩增的荧光标记单链产物与芯片杂交.不对称PCR结果显示,当限制性引物与非限制性引物浓度比例在1:10时ILTV-TK、NDV-HN和IBV-N的单链产物增加最多,当浓度比在1:20时,ILTV-gB、NDV-F和IBV-M的单链产物增加最多;相应的标记样品与3种病毒检测芯片杂交后,均出现较强的杂交信号,而阴性对照检测不到荧光信号,灵敏性实验表明,当DNA浓度为1.8x 104拷贝时杂交仍为阳性.本研究构建的诊断基因芯片对12份临床样品进行初步应用检测,与PCR检测技术检出率基本一致.本实验所建立的联合检测基因芯片能够快速、准确、高通量的诊断NDV-IBV-ILTV,可以应用于集约化养殖业中对多种鸡疫病病毒的检测.     

猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用

基因芯片标准化是其特异灵敏检测病原的基本保障,本研究针对金标银染可视化基因芯片制备中点样缓冲液的使用、点样次数、杂交温度、杂交时间、胶体金浓度以及银染时间分别进行优化实验,分析其对金标银染可视化共检基因芯片杂交信号的影响.分别选取猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(Group A porcine rotavirus,GAR)的VP7和NSP4基因设计引物.根据目的基因片段设计5’端修饰有15个T碱基的60-mer寡核苷酸探针,分别以1∶1混合点样缓冲液和直接进行喷样两种方式,利用芯片点样仪喷样分别喷样1次、2次、3次于醛基玻片上制成基因芯片.应用不对称PCR对实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记,分别在40、45、50和55℃与基因芯片杂交30、60、90和120 min.利用生物素-链霉亲和素的特异性链接,分别将稀释10、20、30、40、50及60倍的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系,通过不同银离子染色时间后后,直接眼观实验结果.应用优化后的标准化可视化芯片和RT-PCR同时对173份临床送检病料进行检测,以评价芯片临床应用.结果表明,应用探针和点样缓冲液1∶1混合的方法进行1次喷样制作的基因芯片,在50℃环境中杂交90 min后,与4μg/mL链霉亲和素修饰的纳米金颗粒结合,再进行12～14 min银染,经过10次重复性实验,可确定为金标银染可视化基因芯片的最佳优化条件.临床病料可视化芯片检测结果与RT-PCR检测结果一致.本研究确定了病毒性腹泻可视化共检芯片的最佳反应条件,为该技术的临床应用标准化研究奠定了基础.     

H9亚型禽流感病毒环介导等温扩增检测方法的建立与荧光指示剂的应用

利用反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了一种特异、灵敏、便捷的H9亚型禽流感病毒(H9subtype of avian influenza virus,H9-AIV)的检测方法。该方法使用了对应于H9亚型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin HA)基因的8个不同区域的6条特异引物,在63℃的等温条件下反应,最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段,较RT-PCR方法敏感10倍。通过对15种H亚型禽流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的检测表明,该方法具有良好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与Mn2+的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定,并且其判断结果与浊度判断结果一致。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测,RT-LAMP与RT-PCR检出阳性样本数分别为61份和46份,表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR。     

常温核酸探针点杂交法检测对虾白斑综合征病毒的PCR扩增产物

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术和核酸探针杂交技术已成为十分重要的病原检测手段,在对虾白斑综合征病毒(white spotsyndrome virus,WSSV)的检测中,已得到广泛的应用[1～3].     

核酸探针检测禽呼肠孤病毒传播动态

用地高辛标记禽呼肠孤病毒(ARV)S1基因中编码σC蛋白的基因片段作为核酸探针,在斑点分子杂交中可检测到1.6pgARV的RNA。利用该核酸探针,通过检测鸡羽毛囊及体内病毒繁殖情况,比较研究了ARV感染后在鸡体内及鸡群中的传播动态。结果显示,研究建立的核酸探针检测方法灵敏度高、特异性强和操作简便,适于批量样品的检测。同时,用此方法检测发现,ARV感染24h后可侵染大部分器官,并且很快传播到同群未攻毒的鸡中,羽毛囊中的病毒检出率与鸡内脏器官中病毒的检出率一致。用核酸探针检测鸡羽毛囊中ARV的方法检测ARV的感染与流行情况,成本低,不影响鸡群生产。     

基因芯片技术检测5种马病毒的研究

通过分子克隆技术获得马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus 1, EHV1)、马动脉炎病毒(Equine arteritis virus , EAV)、马流感病毒(Equine influenza virus, EIV)、马传染性贫血病毒(Equine infectious anaemia virus , EIAV)和东部马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis virus, EEEV)等5种病毒各一段高度保守的特异性基因片段，用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上，制备成检测芯片。提取样品中的RNA，进行反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交，对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示，制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述5种病毒，可检测到阳性杂交信号的最高稀释度为10-6的病毒液，约25个病毒DNA拷贝，但其它病毒材料未见红色荧光信号，证明了本方法的特异性。在进口马的隔离检疫期间，采集马鼻肺炎、马动脉炎中和抗体阳性但病毒分离阴性马匹的白细胞悬液，分别在EHV1和EAV位点处可检测到阳性杂交信号。证明基因芯片技术不但快速、准确和敏感，而且可同时进行多种病毒的检测。     

利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒

为满足基层普通实验室或养殖场等资源有限的实验室对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测需求,该研究开发了一种简单、快速、低成本的检测技术,可以用肉眼观察检测结果。研究将传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与胶体金试纸条技术结合,开发一种低成本的侧流核酸测定试纸条(lateral flow nucleic acid assay,LFNAA)。该体系设计了独特的尾引物,避免了传统核酸试纸条的半抗原标记及抗体的使用。经过PCR扩增后产生一端带着单链寡核苷酸尾巴的双链DNA产物,能够与胶体金标记的寡核苷酸捕获探针结合,从而在试纸条上形成可以用肉眼观察的目标产物。该LFNAA试纸条能够在猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CFSV)、猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1,PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus virus,PPV)中特异的鉴定出ASFV的存在,其灵敏度与琼脂糖凝胶电泳的分析结果一致,均能达到103 copies/μL。因此,仅需要一台普通PCR仪,即可对ASFV进行快速灵敏的鉴定(<2 h),其低成本、操作简便的特点非常适合资源有限的实验室中非专业人员的操作。此外,该技术可进一步结合等温扩增技术,能够在食品安全和医学诊断中实现更快更简便的现场检测。     

一种新型对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒复合快速检测技术-二温式多重PCR的建立

摘要：本研究建立了一种二温式多重PCR技术，用于对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus ,WSSV）和桃拉综合症病毒(taura syndrome virus ,TSV)的复合检测。根据对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因序列分别设计了两对特异引物F1 、R1和 F1、 R2，利用该PCR能特异扩增出WSSV和TSV基因片段，结果表明：二温式多重PCR技术具有较高的特异性和敏感性，最低能检测到WSSV核酸模板10pg,TSV核酸模板100pg，且对其它一些对虾病原呈现阴性。     

二温式多重PCR检测对虾的白斑综合征病毒和桃拉综合征病毒

根据多重PCR的技术原理,利用对虾(Penaeus vannamei)白斑综合征病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了两对特异引物,并将常规三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立二温式多重PCR技术用于对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)和桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)的复合快速检测。利用二温式PCR能特异地扩增出WSSV和TSV的基因片段。结果表明,二温式多重PCR技术具有较高的特异性和敏感性,最低能检测到WSSV核酸模板10pg,TSV核酸模板100pg,且对其它一些对虾病原呈阴性。     

用核酸探针检测鸡脏器及羽毛囊中禽呼肠孤病毒

摘要：用地高辛标记禽呼肠孤病毒（ARV）S1基因中编码σ3蛋白的基因片段作为核酸探针，在斑点分子杂交中可检测到1.6pg的ARV RNA。利用该核酸探针，通过检测鸡羽毛囊及体内病毒繁殖情况，比较研究了 ARV感染后在鸡体内及鸡群中的传播动态。结果显示，ARV感染后在24小时时就可侵染大部分器官，并且很快传播到同群未攻毒的鸡中。羽毛囊中的病毒检出率与鸡内脏器官中病毒的检出率一致。该研究证明用核酸探针检测鸡羽毛囊中ARV的方法检测ARV的感染与流行情况，具有灵敏、特异性高，操作方便的特点，尤其适用于大量样品的同时检测。     

DIG和碱性磷酸酶标记cDNA探针检测番木瓜PRSV的比较

利用地高辛(DIG)标记和碱性磷酸酶直接标记的cDNA探针核酸分子杂交及RT－PCR方法对番木瓜环斑病毒(PRSV)进行了检测。根据Genebank发表的PRSV中国Sm株系的外壳蛋白基因序列，设计特异引物，以美中红（Carica papaya L. cv. Meizhonghong ）带病样品的RNA为模板进行RT-PCR扩增反应,将其目的cDNA片段克隆到pGEM-T easy 质粒载体上，并测序。以重组质粒作模板，用PCR－DIG标记方法制备cDNA探针，另一种非放射性探针是经凝胶电泳分离、纯化cDNA片段，用碱性磷酸酶直接进行标记。结果表明，(1)美中红No.2序列与中国优势株系Sm的同源性为94.7%；(2) DIG标记的三种cDNA探针（861bp，455bp和215bp）对样品的总RNA检测结果是一致的, 且861bp的探针杂交斑点最为清晰，上述核酸杂交结果与RT－PCR检测结果相符, 核酸分子杂交检测的灵敏度和特异性能满足常规检测的需要；(3)碱性磷酸酶直接标记861bp的cDNA探针可进行PRSV的斑点杂交检测，而455bp的cDNA片段用碱性磷酸酶直接标记时，不能获得有效的杂交结果；(4)本试验还用DIG标记探针对叶脉进行了印迹杂交检测,结果与RT－PCR检测结果相符。     

转基因玉米多重PCR-基因芯片联用检测方法的研究

根据七种转基因玉米的重组DNA结构分别对Bt11、Bt176 、Mon810 、Mon863 、TC1507、 GA21 和NK603设计转化体特异性引物,进行多重PCR检测。在此基础上分别设计和筛选了七种转基因玉米转化体特异性oligo探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片。实验表明,该探针特异性好,同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交的灵敏度（0.01%）,优于凝胶电泳检测（0.1%）,由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确率和效率。     

新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR方法的建立与应用

研究建立检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的RT-PCR方法,并运用建立的检测方法对分离毒与人工感染样品进行应用检测.根据NDRV-NP03株S3基因全序列(NDRV-NP03,GenBank登录号:GQ888710),设计合成了一对引物,以NDRV分离株为模板,建立了检测NDRV的RT-PCR方法.结果显示:该方法仅能从NDRV分离毒中扩增到与预期大小相符长度为586 bp的特异性目的片段,检测灵敏度达到2 pg病毒RNA,而其它病毒,番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)、鸭副粘病毒(Duck paramyxovirus,DPMV)、鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)等样品的扩增结果均为阴性.应用该方法对8株NDRV分离毒和3份人工感染鸭肝脾组织进行检测均为阳性.表明建立的RT-PCR方法特异性强、敏感度高,可用于NDRV的临床诊断和流行病学调查.     

基因芯片技术检测5种马病毒

通过分子克隆技术获得马疱疹病毒1型(Equineherpesvirus1,EHV1)、马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus,EAV)、马流感病毒(Equineinfluenzavirus,EIV)、马传染性贫血病毒(Equineinfectiousanaemiavirus,EIAV)和东部马脑脊髓炎病毒(East-ernequineencephalomyelitisvirus,EEEV)等5种病毒各一段高度保守的特异性基因片段,用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。提取样品中的RNA,进行反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述5种病毒,可检测到阳性杂交信号的最高稀释度为10-6的病毒液,约25个病毒DNA拷贝,但其它病毒材料未见红色荧光信号,证明了本方法的特异性。在进口马的隔离检疫期间,采集马鼻肺炎、马动脉炎中和抗体阳性但病毒分离阴性马匹的白细胞悬液,分别在EHV1和EAV位点处可检测到阳性杂交信号。证明基因芯片技术不但快速、准确和敏感,而且可同时进行多种病毒的检测。     

口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型分型基因芯片的构建与评价

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种高度接触传染性动物疫病。本研究拟建立一种能区分FMDV O/A/AsiaⅠ型的基因芯片。根据FMDV O/A/AsiaⅠ型的VP1基因序列设计3对特异性引物,用RT-PCR扩增获得248、206和239 bp的三个靶基因片段,并针对这三个片段分别设计了3种探针,以引物荧光标记法标记靶基因,建立了一种鉴别FMDV O/A/AsiaⅠ型的分型基因芯片并进行了敏感性、特异性、重复性和保存期评价。结果表明最佳反应条件为:水化温度37℃,封闭液为0.25%BH_4Na/25%乙醇,杂交温度为42℃。灵敏性实验表明,FMDV-O检测限为118 pg/mL,FMDV-A为18.4 pg/mL,FMDV-AsiaⅠ为129 pg/mL,芯片方法灵敏度比常规RT-PCR高10~100倍;特异性实验表明,O、A和AsiaⅠ三型之间无交叉杂交;该芯片可至少保存3个月仍能重复使用。本研究建立的FMDV分型基因芯片为O、A和AsiaⅠ型鉴别提供了新方法。     

基因芯片检测转基因油菜

在设计转基因油菜(Brassica napus)的基因芯片检测方法时，根据油菜中所转入的外源基因，选择了CaMV35S启动子、FMV35S启动子、Nos终止子、Bar基因、Barnase基因、Barstar基因、EPSPS基因、GOX基因、PAT基因和内源基因Fbp等设计了引物对与探针，并制备了寡核甘酸芯片，通过多重PCR对样品核酸进行扩增和荧光标记后，将PCR产物与芯片杂交，检测油菜样品中所含的外源基因。结果表明，实验有较好的特异性和重复性，在检测低含量的转基因油菜时灵敏度可达到0．5％。由于采用了多重PCR和芯片的多基因并行杂交的技术，一次可同时检测10个基因，在检测多品种混合的转基因油菜商品时具有独特优势。     

多重连接探针扩增(MLPA)技术同时检测五种病毒的研究

现有的动物疫病诊断技术多是针对单一病原进行的,而动物疫病的流行却出现了多种病毒混合感染,现有诊断技术不能很好地满足国境口岸快速、高通量检疫的需求,动物疫病多重检测新技术的研究近来已经成为动物疫情监测、疫病控制领域关注的焦点。本研究利用多重连接探针扩增(MLPA)技术特异、敏感、高通量等技术优势,以猪流感病毒(SIV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)为研究对象,分别设计了这5种病毒的MLPA探针,将这5种探针混合,建立了可以同时检测这5种病毒的MLPA扩增方法。方法特异性试验表明,针对每种病毒的探针都只能扩增出其对应的病毒模板,其余病毒模板的扩增都是阴性结果;而且,5种探针混合物都只能从单个目的病毒中扩增出单一的特异性条带,而猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的扩增均为阴性。敏感性试验结果表明,5重MLPA扩增的最低检测限可以达到单个病毒核酸3000~6000个拷贝。本研究建立的5种病毒MLPA检测方法在国内外首次实现一次采样,一次分析,检测5种猪病的目的,该技术特异性强,敏感性高,加之其多重性检测优势,有望成为未来疫病检测的新方向。     

检测及鉴定Roundup Ready转基因大豆寡核苷酸芯片的制备

通过对Roundup Ready转基因大豆（简称RRS）的基因盒结构分析,筛选了包含筛选基因、种属相关基因、目的基因、交联结构基因、特异结构基因、内对照基因、其它阴性控制基因和阳性参考目的基因的特异探针,制备了检测及鉴定Roundup Ready转基因大豆的寡核苷酸芯片。实验表明,该芯片探针特异性好,可在一张芯片上完成对Roundup Ready转基因大豆结构的鉴定;内对照基因灵敏度高,检测极限为0．1ng（DNA）,从而消除假阴性概率;同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交方法灵敏度（RRS为0．5％）优于凝胶电泳检测（RRS为1％）。