脱氧雪腐镰刀菌烯醇( DON) 在小麦籽粒中的积累分析

 镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)污染小麦后对人畜具有较大的毒害作用。为明确DON毒素在小麦籽粒中的积累数量及其与镰刀菌菌株、接菌数量、小麦品种和病害严重度的关系,试验采用单花滴注方法在5个抗病性不同的小麦品种上分别接种9 个禾谷镰刀菌菌株,每个菌株接种1 × 106 、1 × 105 和1 × 104 个/ mL 3 个分生孢子浓度,并利用ELISA 法测定收获麦粒中DON 毒素含量。结果表明,麦粒中DON 毒素含量差异主要是由于不同禾谷镰刀菌菌株产生毒素能力不同所致。接种菌株8003、4020 的所有麦粒中DON 毒素含量均显著高于相同条件下接种其他7 个菌株的小麦。当接种产毒素能力强的菌株时,小麦抗病品种表现出在一定程度上降低DON 毒素积累的能力。不同接菌浓度对小麦赤霉病的发病程度和麦粒中DON 毒素含量有显著影响,在相同条件下,接菌浓度越高,病害严重度越高,DON 毒素含量也越高;反之,接菌浓度越低,病害严重度越低,DON 毒素含量也越低。     

镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱毒菌及脱毒酶研究进展

 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由镰刀菌在侵染小麦等禾谷类作物过程中产生的一种有毒次级代谢产物,是目前小麦及其制品中污染最为普遍的一种真菌毒素。DON能够对真核细胞产生多种毒性作用,严重危害人畜健康。DON又是一种毒力因子,促进镰刀菌扩展蔓延,加重赤霉病发病程度。利用脱毒菌、脱毒酶对DON毒素进行生物脱毒是最好的脱毒方式之一,其可将DON转化成低毒或无毒代谢产物,减少毒素对人畜健康的危害。脱毒基因还可作为新型抗源用于小麦赤霉病抗性改良,加速抗性品种的选育,从源头防止DON毒素的污染。本文概述了DON毒素生物脱毒的类型、代谢产物的毒性、脱毒基因的鉴定以及脱毒材料的应用等方面的研究进展,以期为DON毒素的生物防控和小麦赤霉病抗性改良提供参考。     

几种杀菌剂防控小麦赤霉病穗腐及籽粒脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素的评价

小麦赤霉病是小麦穗期的主要病害之一。化学防控一直是小麦主产区防控赤霉病的主要措施。为明确几种新型杀菌剂对小麦赤霉病的防效和对小麦籽粒DON毒素含量的影响,于2018年进行了氰基丙烯酸酯类和三唑类杀菌剂单剂及其复配剂对赤霉病的防效试验。结果表明:30%戊唑·多菌灵悬浮剂(SC)1500 mL/hm^2处理对赤霉病病穗防效达92.40%,病指防效达93.20%,小麦籽粒DON毒素检出量较不用药对照降低80.38%;25%氰烯菌酯SC 2000 mL/hm^2处理对赤霉病的病穗防效达86.80%,病指防效达88.78%,小麦籽粒DON毒素检出量较不用药对照降低88.19%;48%氰烯·戊唑醇SC 900 mL/hm^2和40%丙硫·戊唑醇SC 600 mL/hm^2对小麦赤霉病的病穗防效分别为77.20%、78.00%,病指防效分别为80.27%和79.59%,对籽粒DON毒素检出量较不用药对照分别降低73.87%和81.42%。在小麦赤霉病较重发生的情况下,上述4种杀菌剂单剂或复配剂1次用药既能高效控制病情,又能有效控制小麦籽粒DON毒素不超标。本试验研究进一步阐明,氰烯菌酯、戊唑醇、丙硫菌唑等杀菌剂及其复配剂均能有效控制小麦赤霉病的危害,并能有效降低小麦籽粒DON毒素含量;吡唑醚菌酯单剂及其复配剂虽然对小麦赤霉病的病穗和病指防效也较高,但控制小麦籽粒DON毒素含量效果相对较差。研究结果为小麦穗期赤霉病化学防控提供了科学参考。     

镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱毒菌及脱毒酶研究进展

 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由镰刀菌在侵染小麦等禾谷类作物过程中产生的一种有毒次级代谢产物,是目前小麦及其制品中污染最为普遍的一种真菌毒素。DON能够对真核细胞产生多种毒性作用,严重危害人畜健康。DON又是一种毒力因子,促进镰刀菌扩展蔓延,加重赤霉病发病程度。利用脱毒菌、脱毒酶对DON毒素进行生物脱毒是最好的脱毒方式之一,其可将DON转化成低毒或无毒代谢产物,减少毒素对人畜健康的危害。脱毒基因还可作为新型抗源用于小麦赤霉病抗性改良,加速抗性品种的选育,从源头防止DON毒素的污染。本文概述了DON毒素生物脱毒的类型、代谢产物的毒性、脱毒基因的鉴定以及脱毒材料的应用等方面的研究进展,以期为DON毒素的生物防控和小麦赤霉病抗性改良提供参考。     

小麦赤霉病穗中脱氧雪腐镰刀菌烯醇量的变化

 用JF-12菌株的子囊孢子接种5个不同程度抗感赤霉病的小麦品种,于不同时间对穗组织中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的量进行了测定。结果表明:感病品种(宁麦6号及扬麦3号)穗中的DON量自接种后第4~8天迅速升高,最高可达37.64μg/gdw),抗病品种(望水白)的DON含量较低(≤7.35μg/gdw),且自接种后第8天起逐渐下降,中抗(扬麦4号)和中感(宁8026)品种的DON含量居于抗、感病品种之间。DON含量与穗发病程度的相关性依品种不同而异,即在感病品种上两者有较显著的相关性(r=0.909~1.00),但在抗病及中抗品种上相关性不显著(r=0.466~0.531)。说明抗病品种可能存在降解DON的解毒机制。另外,所有供试品种均在接种后24小时、尚未表现症状时即可检测到一定量(0.46~2.41μg/gdw)的DON,表明DON可能在病菌与寄主建立寄生关系过程中有重要作用。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇在小麦赤霉病病程中的作用

 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)系小麦赤霉病菌——禾谷镰孢(Fusarium graminearum,有性态Gibberell azeae)产生的一种单端孢霉烯族毒素(trichothecenes,以下简称"单族毒素")。作者以病菌正常产毒的野生型菌株GZ3639及其产毒基因Tri5损坏、不能产毒的转化子GZT40(Tri5^-,TRI^-)为材料,对DON在病菌致病过程中的作用进行了研究。结果显示:GZ3639能引起典型的赤霉病症状,病害可由接种小花发展至其它小穗,病菌也可定殖于其它小穗组织;而GZT40仅在接种小花处产生鸟眼状坏死斑点,不能引起典型的赤霉病症状,病菌仅定殖于接种小花处。当病菌与一定浓度(400 μ g·mL^-1)的DON混合处理小花后,GZT40的定殖时间提前2 d (感病品种上)至4 d (抗病品种上),定殖范围可扩大到1~3个小穗,接种20 d后的病小穗率也由病菌单独接种时的2.8%提高到12.5%。DON也使GZ3639的定殖时间提前1 d (感病品种上)至2 d (抗病品种上),定殖范围更广,其所致的病害发展更迅速,接种后20 d的病小穗率由病菌单独接种时的78.0%提高到100%。因此,作者认为,单族毒素在病害发展和病菌在寄主组织内的扩展中起着决定性作用,一旦丧失产毒能力,病菌虽能侵入寄主,但不能在寄主组织中扩展。DON可以缩短病菌成功定殖寄主所需的时间,更有助于病菌在寄主组织内的扩展。     

小麦穗组织中脱氧镰刀菌烯醇毒素的免疫细胞化学定位

 采用免疫细胞化学技术对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)在侵染小麦穗部过程中产生的脱氧镰刀菌烯醇毒素(deoxynivalenol,DON)进行了定位分析。在接种后24h,当菌丝在外稃、内稃的内侧表面扩展而尚未侵入寄主细胞前,病菌已分泌DON,并且DON已扩散到寄主组织内。在菌丝细胞内,DON主要被定位于细胞质、线粒体及细胞壁上;在寄主细胞中DON主要分布于细胞壁、叶绿体、细胞质和内质网上。在侵染初期(接种后2 d),菌丝仅能在寄主细胞间隙扩展,随寄主组织中DON浓度的升高,寄主细胞相应发生了一系列病理变化。随寄主细胞坏死(接种后3~4d),病菌进入坏死的寄主细胞。上述结果表明,DON在禾谷镰刀菌的侵染、致病和定殖过程中起着重要的作用。毒素标记结果表明病菌产生的毒素可通过穗轴微管束组织从侵染部位向上、向下转输,毒素向上的转输量明显高于向下转输     

小麦四种镰刀菌毒素的ELISA检测及毒素污染分析

为明确镰刀菌毒素在小麦中的污染与分布状况,选取以四种镰刀菌毒素的特异性抗体制备的ELISA试剂盒,检测了来自全国范围内的183个冬小麦、46个春小麦品种(系)样品中的镰刀菌毒素含量,并对不同麦区小麦样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、伏马(fumonisin)、单端孢霉烯醇(T-2)和玉米赤霉烯酮(ZON)四种毒素含量及污染率进行比较分析.结果表明,我国小麦品种(系)中镰刀菌毒素污染比较普遍,但污染水平较低,均符合国家规定标准.四种镰刀菌毒素中以DON毒素为主,其平均含量为73.87μg/kg.不同麦区间DON、fumonisin和T-2毒素的含量存在显著差异(P<0.01),而ZON毒素的含量在麦区间差异不显著(P>0.05),东北春麦晚熟组、长江中下游冬麦组和黄淮冬麦区南片冬水组镰刀菌毒素总体含量较高.DON与ZON毒素污染率在麦区间存在显著差异(P<0.01),而fumonisin与T-2毒素污染率差异不显著(P>0.05).在不同麦区间,东北春麦晚熟组的DON毒素的含量和污染率均为最高.     

我国不同麦区小麦镰刀菌毒素检测及毒素污染分析

为明确镰刀菌毒素在我国不同小麦产区的污染与分布,利用超高效液相色谱-串联质谱仪对全国214个小麦品种籽粒中的7种镰刀菌毒素含量进行了测定和比较分析。结果表明:7种镰刀菌毒素的平均回收率在95.02%～116.52%之间,相对标准差为6.32%～21.50%。所有测试小麦样品均被镰刀菌毒素污染,7种毒素中以雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol,NIV)含量最高,即使在NIV含量最低的长江中下游冬麦区,平均含量也高达182.56μg/kg,虽然目前并没有关于NIV的相关限量标准,但也应该予以足够重视;脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)含量较高,在8.07～337.23μg/kg之间,低于国家限量标准1 000μg/kg;T-2含量在4.05～78.05μg/kg之间,低于现有国际限量标准100μg/kg;玉米赤霉烯酮(zearalmone,ZEA)含量在5.30～12.50μg/kg之间,低于国家限量标准60μg/kg;其它3种毒素含量较低,均低于17.73μg/kg。不同麦区间毒素比较发现,DON和3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量在长江中下游冬麦区最高,分别为43.09μg/kg和6.39μg/kg,且显著高于其它麦区;来自长江中下游冬麦组和黄淮冬麦区南片水地组的小麦品种籽粒中毒素T-2和HT-2的含量显著高于其它麦区;其余毒素在不同麦区间均无显著差异。     

小麦赤霉病穗组织中黄色镰刀菌和DON毒素的定量分析

为阐明小麦赤霉病穗组织中黄色镰刀菌Fusarium culmorum(简称Fc)与毒素产生之间的关系.分别用TaqMan探针实时定量PCR和ELISA法,对接种4天后的17个小麦品系穗组织中的FcDNA和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)含量进行了测定.在Fc DNA定量检测中,TaqMan探针实时PCR技术具有高度的稳定性和可重复性.不同小麦品系的Fc DNA含量差异显著,感病品种比抗病品种高100倍左右;DON含量也不相同,Fc生物量的增加伴随着DON产量的提高,两者之间存在对数关系(y=19758 lnx-111230).菌量较低时,DON含量相对较大;而菌量较高时,DON含量相对偏低.     

我国四大麦区小麦籽粒镰刀菌毒素检测与污染分析

为明确自然发病条件下我国小麦主产区小麦籽粒镰刀菌毒素污染情况,用超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)测定了长江中下游冬麦组(CZX)、黄淮冬麦区南片冬水组(HNS)、黄淮冬麦区北片水地组(HBS)、北部冬麦区水地组(BBS)180份小麦样品中DON、3ADON、15ADON、T-2、HT-2和ZEN共6种镰刀菌毒素含量并对其进行比较分析。结果显示:来自CZX小麦籽粒中的DON、3ADON与ZEN毒素含量显著高于其他麦区;T-2毒素在CZX小麦籽粒中含量显著低于其他麦区;15ADON毒素含量在HNS与CZX、HBS与BBS以及CZX与BBS差异不显著,其他麦区间该毒素含量差异显著,15ADON在HNS含量最高;检出率方面,HT-2毒素均未检出;ZEN、3ADON检出率较低,DON、15ADON和T-2毒素的检出率较高。     

玉米穗腐病菌的拮抗菌筛选、鉴定及降解DON毒素能力测定

穗腐病是玉米生产上的重要病害,在造成产量损失的同时,产生的毒素严重危害人畜健康。为获得兼具降解毒素功能的玉米穗腐病菌的生防菌株,以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）毒素为靶标,从玉米病穗上分离筛选到一株能够降解该毒素的细菌菌株TP,经菌落形态特征、结合16S rDNA和gyrB基因序列分析,初步鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。对峙试验和复筛共培养结果显示,菌株TP对禾谷镰孢F18的抑制率分别达到70.63%和99.5%。经HPLC检测,TP在含DON的无机盐溶液中培养10 d后,其对DON的降解率为98.97%。以上研究结果表明,贝莱斯芽胞杆菌TP能拮抗禾谷镰孢菌,且能高效降解DON毒素,该菌株在防治禾谷镰孢菌引起的玉米穗腐病以及降低毒素危害中具有广阔的应用前景。     

生姜腐皮镰刀菌的分离鉴定及PCR快速检测方法构建

 由腐皮镰刀菌(Fusarium solani)引起的生姜枯萎病是一种毁灭性真菌土传病害,其病原菌的快速高效检测,有助于枯萎病的早期诊断及预警。通过回接试验、形态学观测以及系统进化树分析,对湖北生姜产区分离的菌株进行鉴定,获得生姜腐皮镰刀菌(F. solani)。基于镰刀菌属通用引物TEF-1αF/TEF-1αR基因序列,以腐皮镰刀菌基因组DNA为模板进行扩增测序,根据序列信息设计筛选出一对腐皮镰刀菌特异性引物,构建了基于普通PCR的快速高效分子检测方法,并对接种过病菌的生姜植株和土壤进行检测验证。通过病原菌的菌落形态、孢子显微结构观察、真菌通用引物ITS1/ITS4鉴定和致病性测定,确定引起生姜枯萎病的病原菌为腐皮镰刀菌(F. solani)。用设计的特异性引物F8/R8进行PCR,特异扩增获得约381 bp的目标条带,检测灵敏度为454 pg·μL^-1,利用该引物对带菌生姜幼苗和土壤进行检测验证,证实可从发病生姜幼苗和带菌土壤中特异性检测到腐皮镰刀菌(F. solani)。本研究明确了引起湖北生姜枯萎病的病原菌为腐皮镰刀菌(F. solani),并建立了PCR快速检测方法。该检测方法简便、灵敏、高效,可用于生姜枯萎病的早期诊断与预防。     

储存玉米中黄曲霉毒素主要产生菌的检测及污染预防研究

通过对储存玉米霉变初期的感官症状观察、分离菌的PCR检测及在不同环境条件下的生长预测模型建立,探讨了识别、预防储存玉米发生黄曲霉毒素及其主要产生菌污染的实用方法。结果表明:籽粒色泽及致密性改变、表面有潮湿感、粮堆内局部发热等症状的出现可表征储存玉米有可能发生真菌污染。以毒素合成相关的全局性调控因子veA基因为靶标,对污染玉米样品分离菌进行PCR检测,扩增出约1.9kb的条带,与预期大小相符,证明污染菌是黄曲霉或寄生曲霉。污染曲霉在不同玉米水分活度和环境温度下的生长数据,经Baranyi函数拟合、估测其最大生长速度,并建立了生长速度随玉米水分活度和环境温度变化的多项式回归模型;模型显示玉米水分活度和环境温度对污染曲霉的生长影响具有协同性;要确保储存玉米安全,储存参数的限值选择应远离适合污染菌生长的区域。本研究为储存玉米安全管理决策、玉米水分活度和环境温度限值的选择及调控提供支持,利于降低储存玉米的黄曲霉毒素及其主要产生曲霉(黄曲霉或寄生曲霉)的污染风险。     

不同小麦品种(系)对赤霉病的抗性和麦穗组织中DON毒素积累分析

 为明确不同小麦品种(系)对赤霉病的抗性和麦穗组织中DON毒素积累水平,培育和利用抗赤霉病和DON毒素积累的品种提供资源和依据,本研究采用单小花滴注接种法对河南省的106个小麦品种(系)抗赤霉病性进行鉴定分析,并用ELISA测定了病穗组织中DON毒素水平。结果表明不同小麦品种(系)对赤霉病的抗性有显著差异,106个小麦品种(系)中未发现抗病和中抗材料,中感品种(系)有华育198、郑麦103和春丰0021等14个,占13.2%;感病的有曌式2010-06、百农898和中麦63等92个,占86.8%。不同小麦品种(系)籽粒、颖壳和穗轴中DON毒素积累水平有显著差异,籽粒中DON毒素水平在(0.70~287.63)mg/kg之间,其中郑03876、豫保1号和中麦63 的DON毒素水平在2 mg/kg 以下,为抗毒素材料;其他的103个品种DON毒素水平大于2 mg/kg;颖壳和穗轴中的DON毒素水平在(51.03~392.87)mg/kg之间,普遍比籽粒中DON毒素含量高。籽粒中DON毒素水平与小麦品种(系)的平均病害严重度间呈极显著正相关。     

气相色谱法同时检测水果中氟吡菌酰胺、肟菌酯及其代谢物肟菌酸的残留量

采用气相色谱法建立了水果中氟吡菌酰胺、肟菌酯及其代谢物肟菌酸残留的分析方法。样品用乙腈匀浆提取,氯化钠和无水硫酸镁盐析后,经N-丙基乙二胺（PSA）分散固相萃取净化,气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）检测。结果表明:在0.05~1 mg/kg添加水平下,氟吡菌酰胺、肟菌酯及其代谢物肟菌酸的平均回收率为79%~120%,相对标准偏差（RSD）为0.7%~16%。氟吡菌酰胺、肟菌酯及其代谢物肟菌酸在不同水果样品中的检出限（LOD）分别为0.01、0.015和0.01 mg/kg,定量限（LOQ）均为0.05 mg/kg。该方法快速、简单和稳定,可以满足水果中氟吡菌酰胺、肟菌酯及其代谢物肟菌酸残留量的检测要求。     

茶叶中八氯二丙醚(S-421)的检测及污染来源研究

建立了茶叶中八氯二丙醚(S-421)残留的检测方法,并明确了茶叶中八氯二丙醚的污染来源。茶叶样品用正己烷-丙酮(22∶ 3,V/V) 提取,经硅藻土545-浓硫酸(1 g+0.4 mL)净化,以正己烷洗脱,GC-ECD检测,外标法定量。在0.01~1.0 mg/kg的添加水平下,平均回收率在93.0%~96.6%之间,相对标准偏差在1.70%~4.05%之间,方法的定量限为0.01 mg/kg。该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合农药残留测定的技术要求。用该方法对茶园常用化学农药25种、生物源农药11种、肥料9种、叶面肥7种进行检测,均未检测到八氯二丙醚残留,但茶叶能直接吸附蚊香、气雾杀虫剂中的八氯二丙醚。根据目前的研究结果认为,蚊香和气雾杀虫剂中的八氯二丙醚是构成茶叶中八氯二丙醚残留的主要来源。     

液相色谱与气相色谱法测定小麦中丙环唑(Propiconazole)的残留

用高压液相色谱紫外检测法,在波长229纳米处测丙环唑;气相色谱则采用电子捕获检测器。两法均以甲醇作样品的浸提溶剂,用液-液分配进行初步净化。如用气相色潜电子捕获检测器,需用氧化铝柱层析进一步净化。两法的回收率都大于80％。气相色谱法对样品的最低检出浓度为O.02毫克/公斤,液相色谱法则为0.4毫克/公斤。     

白菜軟腐細菌(Erwinia aroideae)的越冬及传佈

 白菜軟腐細菌Erivinia aroideae不能在田間土壤中越冬,但能在未分解的病菜根和病菜叶中越冬。用病根及病叶等所作的堆肥中不能分离出具有致病力的軟腐細菌。菜窖中的废菜叶为軟腐細菌越冬及繁殖的主要場所之一。春季由麻蝇(Sarcophaga sp.)及花蝇(Fannia sp.)传布到田間的感病作物上,另外也可以由蜜蜂(Apis mellifera L.)、叶蜂(Athalia rosae L.)及小菜娥(Plutella maculipennis curtis)等繼續在白菜間传布。此外窖中移出的菜种株上亦带有病原細菌。因此認为菜窖中及田間殘菜根的越冬細菌是軟腐病的初次侵染源     

浙江省西(甜)瓜蔓枯病菌对甲基硫菌灵和啶酰菌胺的抗性检测及抗性机制

从浙江省5地采集了112株西 (甜) 瓜蔓枯病菌Stagonosporppsis citrulli,采用区分剂量法检测其对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵 (以下简称Ben) 和琥珀酸脱氢酶抑制剂类 (SDHIs) 杀菌剂啶酰菌胺 (简称Bos) 的抗性。结果显示:112株西 (甜) 瓜蔓枯病菌对Ben和Bos的抗药性频率分别为100%和28.6%,其中对甲基硫菌灵产生高水平抗性 (BenHR) 的菌株达100%,对啶酰菌胺产生低水平抗性 (BosLR) 和高水平抗性 (BosHR) 的菌株分别为18.8%和9.8%。抗药性分子机制研究表明:BenHR菌株中β-tubulin的第198位氨基酸由Glu (E) 突变成了Ala (A);BosHR菌株中Sdh B的第277位氨基酸由His (H) 突变成了Tyr (Y),但BosLR的抗性机制还需进一步研究。研究结果表明,浙江省西 (甜) 瓜蔓枯病菌对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵的抗性已十分严重,尽管大多数菌株对啶酰菌胺仍表现敏感,但在一些地区已存在高水平抗性菌株,应在加强抗药性监测的同时,注意SDHIs类杀菌剂的科学使用。