Aurora A对猪卵母细胞向胚胎转换过程中纺锤体结构的影响

极光激酶A(Aurora A)是一种参与体细胞中心体复制、纺锤体组装与胞质分裂等生物学事件的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.为了探讨AuroraA在猪(Susscrofa)卵母细胞向胚胎转换这一特殊时期的动态表达及其相关功能,本研究采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微成像技术检测AuroraA在转换过程中动态表达与亚细胞定位,并在此基础上通过特异性抑制实验分析Aurora A在该特殊转换时期的调节作用.结果表明,AuroraA在猪卵母细胞向胚胎转换的各个时期均有表达,并与α-微管蛋白(α-tubulin)具有相似的亚细胞定位;使用AuroraA特异性抑制剂MLN8054处理卵母细胞,卵母细胞的第一极体排出率呈浓度依赖性下降,且纺锤体异常率显著升高(P＜0.05);将经MLN8054处理且排出第一极体的卵母细胞孤雌激活后,胚胎卵裂率与对照组相比无显著差异.结果表明,在猪卵母细胞向胚胎转换过程中,AuroraA 的表达与α-tubulin分布密切相关,且呈现阶段性分布特点;AuroraA主要通过调节纺锤体组装及其稳定性参与猪卵母细胞成熟分裂的调控;MLN8054抑制AuroraA后,对所获得的第二次减数分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)卵母细胞顺利向胚胎期转换并无显著影响.研究结果为进一步了解AuroraA在猪卵母细胞向早期胚胎转换这一特殊时期的调控作用提供了重要的实验依据.     

猪卵母细胞中Aurora-B的定位与功能

Aurora-B是一种在细胞有丝分裂过程中起重要调控作用的丝氨酸/苏氨酸激酶,在哺乳动物卵母细胞减数分裂过程中的表达、定位与功能研究较少,相关猪的尚未见报道。本实验采用特异性抑制剂处理猪(Susscrofa)卵母细胞,研究其减数分裂过程中Aurora-B的表达、亚细胞定位与功能作用。激光共聚焦显微镜分析表明,Aurora-B均匀分布在生发泡(GV)期卵母细胞质中;生发泡破裂后,Aurora-B主要集中在浓缩染色质的周围,并随纺锤体的装配和染色体的分离而发生相应的迁移。使用Aurora-B特异性抑制剂AZD-1152处理后,阻滞在Pro MⅠ-AITI期卵母细胞与对照组相比有显著增加(P0.05),MⅡ期卵母细胞显著降低(P0.05),同时MⅡ期卵母细胞染色体的排列发生紊乱、纺锤体形态异常,并出现一定程度的微丝断裂和分散。抑制猪卵母细胞Aurora-B的表达,其孤雌胚胎的发育将受严重影响。本研究表明,Aurora-B可能在猪卵母细胞减数分裂过程中对于微管装配、染色体分离等,起着关键的调控作用。     

细胞骨架在猪GV期与MⅡ期卵母细胞的分布规律

采用免疫荧光技术,在激光扫描共聚焦显微镜下观察并分析猪GV期和MⅡ期卵母细胞的细胞骨架分布。结果发现,猪新鲜GV期与MⅡ期卵母细胞的微管、微丝和染色体结构与分布,具有不同的特点和规律。在GV期卵母细胞,结构完整的微管尚未形成;染色体未发生致密化,仍存在于生发泡内;而微丝则分布于质膜下及整个胞质中。MⅡ期卵母细胞的微管,主要存在于纺锤体上,少量微管出现在第一极体周围;染色体排列于纺锤体赤道板上;微丝均匀分布于质膜下。本研究表明,微管、微丝和染色体三者间密切联系、相互作用,共同参与卵母细胞成熟与发育进程的调控。     

超表达细胞周期蛋白A2基因(CycA2)抑制猪卵母细胞PB1体外排出

在卵母细胞成熟过程中,细胞周期蛋白A2(CyclinA2,CycA2)可与不同周期蛋白依赖激酶(cyclindependent kinase,CDK)相互作用,通过其周期性表达和降解,参与调控细胞周期.为探讨CycA2基因对猪(Sus scrofa)卵母细胞体外成熟的影响,本研究从猪卵巢中克隆CycA2基因,构建野生型pVenus-CycA2和非降解型pVenus-DN157CycA2真核表达载体,转染至hela细胞,确认重组质粒的表达及定位情况.将pVenus-CycA2、pVenus-DN157CycA2体外转录为cRNA,对猪卵母细胞进行显微注射后,体外成熟培养一段时间后统计第一极体排出率,并观察其表达和定位.结果显示,显微注射了pVenus-CycA2、pVenusDN 157CycA2cRNA的卵母细胞,其第一极体(first polar body,PBl)的排出率与对照组相比极其显著降低(P＜0.001,);用Roscovitine处理的pVenus-DN 157CycA2表达的卵可恢复排出PB1的能力,其PB1排出率与对照组相比差异不显著.本研究首次揭示了CycA2基因对猪卵母细胞体外成熟过程的影响,为探索CycA2参与染色体分离调控的分子机制提供理论依据,同时也为进一步研究第二次减数分裂过程中CycA2基因的作用提供了一个平台.     

牦牛KDM2A基因克隆及其在不同组织和减数分裂进程的表达

组蛋白去甲基化酶(histone demethylase,KDM)2A是细胞周期基因表达所必需的调控分子。为了研究牦牛(Bos grunniens)KDM2A基因的结构和功能,并进一步分析该基因在不同组织及卵母细胞减数分裂进程中的表达模式,本研究首先克隆获得牦牛KDM2A基因序列全长3 546 bp,包括完整的开放阅读框3 489 bp,编码氨基酸1 162个(Gen Bank登录号:MH345760)。牦牛KDM2A基因与其他物种的相似度与构建的系统进化树结果一致。牦牛KDM2A蛋白分析显示,其理论分子质量为132.7 k D,理论等电点为7.59,不稳定指数52.73,总平均亲水指数-0.587。KDM2A蛋白氨基酸序列中存在117个磷酸化位点,6个N-糖基化和2个O-糖基化位点;二级结构包括无规则卷曲、α螺旋和β折叠。KDM2A蛋白含有cupin超家族jumonji-C(Jmj C)结构域、锌指(CXXC zinc finger,ZF-CXXC)结构域、植物同源域(plant homeodomain,PHD)、F-盒蛋白(F-box,FBOX)结构域和有丝分裂相关蛋白(antagonist of mitotic exit network protein 1,AMN1)结构域,不含跨膜结构域和信号肽,主要在细胞核发挥生物学功能。KDM2A mRNA在子宫、脾脏和卵巢的表达量较高,极显著高于其他组织(P0.01);KDM2A mRNA在卵母细胞减数分裂过程中均表达,其中MⅡ期的表达量极显著高于GⅤ期和MⅠ期(P0.01),GⅤ期KDM2A的表达水平高于MⅠ期,但差异不显著(P0.05)。本研究成功克隆了牦牛KDM2A基因序列,并明确其在组织和卵母细胞减数分裂进程中的表达模式,为深入探讨KDM2A基因在牦牛卵母细胞减数分裂进程中的作用机制提供了基础资料。     

卵母细胞生发泡破裂(GVBD)发生前后脱卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响

成熟卵母细胞的细胞质对供体细胞的重编程有作用,卵母细胞的成熟状态成为核移植过程的关键因素。为了研究卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)发生前后脱卵丘细胞对卵母细胞的影响,本研究采用猪(Sus scrofa)卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外培养,每隔5 h取卵母细胞采样,置于地衣红染液中染色,根据卵母细胞染色体构型的变化确定卵母细胞的分期,然后在21、27和42 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,观察极体数。体外培养不同时间压片观察结果表明,直径2~6 mm卵泡卵母细胞在体外培养时,2~17 h大部分卵母细胞处于GV期(88.30%~52.38%);22 h有63.25%的卵母细胞处于生发泡破裂至前中期(germinal vesical breakdown~premetaphaseⅠ,GVBD~pre-MⅠ);27 h处于中期Ⅰ(metaphaseⅠ,MⅠ)的卵母细胞最多(42.25%);32 h处于后期Ⅰ(anaphaseⅠ,AⅠ)的卵母细胞比例最多(29.90%);37 h处于末期Ⅰ(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞比例最多(40%);42 h绝大部分卵母细胞达到了中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)(72.81%)。分别采取21、27和44 h的卵母细胞进行脱卵丘细胞处理,发现21 h脱卵丘细胞后卵母细胞成熟率为25.56%,低于27 h处理卵的成熟率(34.33%),42 h脱卵丘细胞的卵母细胞的成熟率最高达到84.33%。结果说明,体外卵母细胞成熟过程中,卵丘细胞对卵母细胞的成熟具有重要意义,为进一步探讨和分析猪卵母细胞体外成熟培养的方法,改良体外培养体系,提高猪卵母细胞体外培养成熟率,进而提高胚胎体外培养质量提高奠定基础。     

黄牛体细胞核移植初步研究

对牛体细胞核移植的有关影响因素进行了系统研究,结果表明,电场强度为100v／mm,电脉冲2次,脉冲时间为10μs的融合率显著高于30μs的融合率,囊胚发育率差异不显著;在耳部成纤维细胞的注核微滴中添加7％乙醇可提高重组胚的卵裂率,供体细胞的预激活可提高核移植效果;TⅠ期(第二次减数分裂末期)去核卵母细胞核移植总囊胚率低于MⅠ期(第二次减数分裂中期)去核卵母细胞的,TⅠ期去核卵母细胞的核移植效果不如MⅠ期去核卵母细胞的;成纤维细胞直接注射后3h用离子霉素(5μmol／L,5min)和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP,2mmol／L,3h)激活处理的重组胚发育率显著高于注核后0h和6h激活的重组胚,供体细胞核与受体卵母细胞激活前的胞质因子互作一段时间,有利于核移植胚胎的早期发育。     

丁内酯-Ⅰ影响猪卵母细胞的体外成熟和发育能力

体外成熟的卵母细胞存在核成熟与胞质成熟不一致的情况,从而使得体外成熟的卵母细胞质量不高.本实验采用cdc2激酶抑制剂丁内酯-Ⅰ (butyrolactone Ⅰ,BL-Ⅰ)抑制猪卵母细胞核体外成熟,期望解决卵母细胞体外培养过程中细胞核与细胞质发育的不同步问题.结果表明,分别用0、10、20、40和80 μmol/LBL-Ⅰ处理猪卵母细胞44 h后,对卵母细胞成熟的抑制程度与BL-Ⅰ浓度的升高成正比.用20、40和80μmol/L处理时,处于生发泡(GV)期的卵母细胞分别为25％、47％和67％,与对照组(5％)相比差异极显著(P＜0.01);而到达MⅡ期的卵母细胞分别为38％、9％和0,与对照组(67％)相比差异极显著(P＜0.01).将20、40和80 μmol/L处理44 h后的卵母细胞,再在不含BL-Ⅰ的卵母细胞体外成熟培养液中培养44 h后,到达MⅡ期的卵母细胞为57％、41％和5％,与抑制44 h时相比均有显著差异,表明BL-Ⅰ对卵母细胞成熟的抑制作用是可逆的.20 μmol/L BL-Ⅰ抑制培养20 h再正常培养24 h(20 h++24 h-处理组)后卵母细胞的成熟率显著低于对照组(正常培养44 h)(65.6％vs 70.1％,P＜0.05).对20 h++24 h-处理组成熟的卵母细胞进行孤雌激活,其卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均好于对照组,但无显著差异;对20 h++24 h-处理组成熟的卵母细胞进行核移植(NT),获得重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均优于对照组,并且卵裂率有显著差异(68.9％vs 62.4％,P＜0.05).结果提示BL-Ⅰ处理对猪卵母细胞的核成熟有明显抑制作用,这种抑制作用是可逆的,对猪卵母细胞孤雌胚胎发育能力和核移植胚胎的发育能力有一定的提高.     

超表达线粒体融合蛋白2基因(Mfn2)抑制小鼠卵母细胞体外成熟

线粒体融合蛋白2基因(mitofusin2,Mfn2)参与细胞凋亡和细胞周期调控,在卵母细胞和胎盘发育中起着重要作用.本研究旨在探讨Mfn2基因对小鼠(Mus musculus)卵母细胞体外成熟过程的影响.从小鼠卵巢中克隆Mfn2基因并构建pMfn2-Venus真核表达载体.经脂质体2000介导重组质粒pMfn2-Venus转染293T细胞(病毒包装细胞),确认重组质粒在293T细胞内的表达及定位.将pMfn2-Venus体外转录为cRNA,并注射入小鼠卵细胞中,进行体外成熟培养,并统计卵母细胞生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBD)发生率以及第一极体(first polarbody,PB1)排出率,荧光显微镜下观察其表达及定位.结果显示,注射了Mfn2-Venus cRNA的卵母细胞,其GVBD发生率以及PB1排出率与对照组相比显著降低(P＜0.0001,P＜0.05).本研究首次揭示了Mfn2基因对小鼠卵母细胞体外成熟过程的影响,为卵母细胞体外成熟的研究提供了一个新方向,同时也为研究减数分裂过程中Mfn2基因提供了一个平台.     

猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,H1foo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用.本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体.首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体;用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位;最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位.序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7％、67.9％和54.3％;真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在He(l)a细胞中表达并可以准确的定位在细胞核;体外转录的H1foo-venusmRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核.本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体;体外转录的H1foo-venusmRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料.     

牛p53基因真核表达载体构建及其在卵母细胞中表达定位

p53是一种肿瘤抑制基因,在细胞周期阻滞、细胞凋亡、衰老和自噬过程中发挥着调控作用,在机体的各个组织中广泛表达.本研究旨在构建牛p53基因真核表达载体并研究其在牛卵母细胞中的表达和定位.首先从牛(Bos taurus)卵丘细胞中克隆了p53基因并将其连接到pMD 19-T载体上,双酶切鉴定后定向连接到pVenus载体上构建了pVenus-p53真核表达载体,经脂质体2000介导转染Hela细胞,确定重组质粒在Hela细胞中的表达定位,主要定位于细胞核.然后用体外转录试剂盒将p53-Venus转录成cRNA,通过显微注射观察其在卵母细胞中的表达定位情况,主要定位于细胞核,但胞质中也有少量表达.最后,取体外培养不同时期的牛卵母细胞,通过实时定量PCR检测p53在体外培养不同时期的表达量的变化,采用2-ΔΔC法分析p53/β-actin表达水平的变化值,p53的表达从GV期到MⅠ期迅速升高,在MⅠ期其表达量达到最高,随后又逐渐降低.本研究构建了牛p53真核表达载体pVenus-P53,并且体外转录的p53-Venus cRNA能在牛卵母细胞中正确表达定位,检测了p53在牛卵母细胞成熟培养各个时期表达量的变化,为进一步研究p53在牛卵母细胞体外成熟中的作用提供了参考资料.     

黑芥与花椰菜体细胞杂种花粉母细胞的减数分裂不同步及染色体行为异常

本研究对黑芥与花椰菜体细胞杂种及其双亲的花粉母细胞减数分裂行为进行了观察和比较,结果表明黑芥与花椰菜的花粉母细胞减数分裂同步性很高,而其体细胞杂种表现出明显的减数分裂不同步,各杂种不同株系间减数分裂不同步的程度与跨度各异。减数分裂不同步发生是由于为部分花粉母细胞在减数分裂某一时期发生停滞或推迟,这一时期(或第一个停滞时期)主要发生在第一次减数分裂的前期。花粉母细胞发育虽不同步,但最后均完成减数分裂形成花粉粒,所形成的花粉粒的活性相差甚远。此外,研究结果还显示,体细胞杂种有着较高的减数分裂染色体行为异常频率,尤其是在中期Ⅰ后。主要表现为减数分裂中期Ⅰ的染色体的早迁、后期Ⅰ和后期Ⅱ的染色体滞后及染色体不均等分离、四分体时期的异常等现象。花粉粒的活性与减数分裂时期染色体行为异常程度有关,染色体行为异常及微核现象出现的频率越高,相对的花粉粒活力也越低。     

乙二胺四乙酸钠、能量基质、氨基酸对猪卵母细胞的体外成熟和早期孤雌发育的影响

本研究探讨了:(1)成熟培养基中葡萄糖和丙酮酸钠剂量对猪卵母细胞体外成熟极体排放率的影响;(2)培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、牛磺酸和亚牛磺酸的剂量对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响,同时探讨不同浓度乙二胺四乙酸钠(EDTA-N a)对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在含不同剂量葡萄糖 丙酮酸钠的成熟液中体外成熟44~48 h,计算其极体排放率(试验1),进行化学法孤雌激活后,在含不同剂量的葡萄糖 谷氨酰胺 牛磺酸 亚牛磺酸与不同浓度的EDTA-N a的培养基中体外培养,计算孤雌激活胚的第48小时卵裂率和第168小时囊胚率(试验2)。结果表明:(1)葡萄糖 丙酮酸钠在1倍剂量(浓度分别为3.05 mm o l/L和0.91 mm o l/L)时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率为(59.3±5.0)%,当其剂量加倍时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率极显著下降(P<0.01),为(51.0±4.4)%;(2)随着EDTA-N a添加浓度的增加,猪孤雌激活胚的的囊胚发育率不断上升,添加浓度达到50μm o l/L时囊胚率最高(7.2±4.1)%,超过此浓度后囊胚率开始下降,培养基中添加适当浓度(25-100μm o l/L)的EDTA-N a对猪孤雌激活胚的囊胚发育率具有有利作用(P<0.05),添加浓度达到200μm o l/L时其有利作用消失;(3)培养基中葡萄糖 氨基酸的剂量过高(葡萄糖、谷氨酰胺、牛磺酸、亚牛磺酸的浓度分别大于5.55,1.0,7.0,5.0 mm o l/L)对猪孤雌激活胚的卵裂率无显著影响(P>0.05),但对其囊胚发育率有不利作用(P<0.05)。本研究得出以下结论:(1)适当浓度(25~100μm o l/L)的EDTA-N a对猪早期胚胎体外发育具有促进作用;(2)培养基中能量基质剂量过高会抑制猪卵母细胞体外成熟;(3)培养基中能量基质 氨基酸的剂量过高会抑制猪早期胚胎的体外发育。     

小鼠SN和NSN卵成熟分裂过程中S1核酸酶敏感性变化

摘要： 比较了两种染色质构型不同的小鼠卵泡卵子体外成熟过程中S1核酸酶敏感性的变化。结果发现，染色质构型不同的两类小鼠卵子在第1次减数分裂中期（MⅠ期）S1核酸酶的敏感性存在显著差异，NSN(non-surrounded nucleolus，染色质结构较松散，散布在核质中)型卵子S1核酸酶的敏感性显著高于SN(surrounded nucleolus，染色质高度凝集，集中围绕在核仁周围，形成染色质环)型卵子（P <0.01）；然而在第2次减数分裂中期（MⅡ期）两种类型卵子S1核酸酶的敏感性趋于一致，二者无显著差异（P >0.05）。染色质构型不同的两种卵子发育至MⅠ期时，染色体单链构型丰富度存在显著差异，但由MⅠ期发育到MⅡ期过程中，二者单链构型丰富度趋于一致。     

化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂,使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合,并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外,达到去核目的。目前以化学去核处理的MⅡ期卵母细胞为受体,已获得克隆小鼠。然而,第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞经化学去核后,进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比,该方法对卵母细胞无机械损伤,完全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时,程序简单,所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。剪取超排小鼠的卵巢,以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体,进行体外成熟培养。成熟培养5 h后去除卵丘细胞,挑选生发泡破裂的细胞顺序移入含脱羰秋水仙碱(DC,0.4μg/mL,2 h)和DC(0.4μg/L) 放线菌酮(CHX,50μg/mL)的M16培养液中继续培养,直到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素(PHA,200μg/mL)粘合后,转入电击槽;施加1个5 V/mm、3μs交流电脉冲和2个92 V/mm、70μs直流电脉冲进行电融合。3 h后,以SrCl2激活6h,于四孔培养皿中制作的“孔中孔”(well of well)体外培养重构胚。试验重复3次,共计698个卵母细胞,获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体。试验分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则三组间差异不显著(P>0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合,完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,同时提高了核移植的生产力,最终提高核移植总效率。     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的研究

卵母细胞生长发育和成熟调控机理的研究,是生殖生物学领域研究的热点和难点。研究发现,卵丘细胞的存在与否严重影响卵母细胞的体外成熟质量,且小鼠无卵丘的卵母细胞经体外成熟并常规体外受精后未能得到“试管后代”,表明常规体外培养方法明显降低无卵丘的卵母细胞发育潜能。可能的原因是:(1)卵母细胞与颗粒细胞间的间隙连接丢失,这种连接对卵母细胞的胞质成熟是至关重要的。(2)皮层颗粒的减少或继续生成路径的障碍。(3)卵母细胞易于贴底,造成变形,从而可能引起卵母细胞内细胞器机械性移位,造成损伤,且贴底后可能影响卵母细胞与培养基的物质交换。因此,探明卵丘细胞在卵母细胞体外成熟的作用及机制,探索培养无卵丘的水牛卵母细胞的新方法,对于今后进一步提高卵母细胞成熟质量具有重大的指导意义。本研究针对去卵丘细胞的卵母细胞体外培养存在的问题,以卵巢组织、卵丘细胞为介质来模拟卵母细胞在体内的状态,试验分为5组:M1,直接培养法(对照组);M2,与单层卵丘细胞共培养法;M3,未扩展卵丘细胞包围法;M4,扩展卵丘细胞团支撑法;M5,卵巢组织薄片包围法。培养24 h后计算第一极体(PB1)排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活。结果发现:成熟24 h时,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其他各组间没有显著差异(P>0.05);孤雌激活结果显示M5组的卵裂率显著低于M1组(P<0.05),而M2组与M1组间没有差异(P>0.05);但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组(P<0.05)。结论:(1)扩展卵丘细胞团支撑法支持无卵丘的水牛卵母细胞的体外核质成熟,而未扩展卵丘细胞包围法促进卵母细胞胞质的成熟,这可能是通过重新构建卵丘-卵母细胞间的间隙连接实现的;(2)与单层卵丘细胞共培养法并不能促进无卵丘的水牛卵母细胞的核成熟及其发育潜力;(3)用卵巢组织包围不能模拟体内卵巢的环境,且卵巢组织可能分泌抑制卵母细胞胞质成熟的因子。目前对无卵丘卵母细胞的培养方法的研究甚少,而我们建立的卵丘细胞团包围/支撑法及卵巢组织包围培养法未见类似的报道。本研究初步建立了水牛无卵丘卵母细胞的有效培养方法,将为研究卵母细胞生长发育和成熟调控机理提供新的模型,为利用无卵丘的水牛卵母细胞提供理论和技术支持。     

SAHA对水牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育潜能的影响

卵母细胞体外成熟过程中组蛋白修饰发生了剧烈的变化,其表达模式的改变对卵母细胞的成熟乃至后续胚胎的发育有着至关重要的作用.去乙酰化酶抑制剂-伏立诺他(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)作为新型抗癌药物,是组蛋白去乙酰化酶的潜在抑制剂,在体内和体外抑制多种类型肿瘤细胞生长并促进其分化和凋亡.为探讨组蛋白去SAHA对水牛Bubalus bubalus)卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0,2,5,10,20和40 nmol/L)SAHA处理成熟期的水牛卵母细胞对其成熟率(第一极体排出率)、受精卵分裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的影响.结果表明,10 nmol/L SAHA处理组成熟率、卵裂率、囊胚率显著高于对照组((77.07±1.79)％和(62.3士2.08)％,(86.81±1.93)％和(74.86±2.07)％,(27.56±2.86)％和(24.23±1.74)％,P＜0.05).随着浓度增加,各处理组囊胚总细胞数有提高的趋势,但组间差异不显著(141±10,151±13,165±17,170±14,147±20,185士22,P＞0.0S).qRT-PCR检测结果显示,SAHA对水牛卵母细胞成熟过程的处理,均显著下调了cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein,CREB)结合蛋白基因CBP、组蛋白乙酰转移酶1基因(histone acetyltransferases 1,HAT1)、组蛋白去乙酰化酶1基因(histone deacetylase 1,HDAC1)在MⅡ期卵母细胞中的表达,P300则有所上调.实验结果表明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA处理是一种能够提高水牛卵母细胞体外成熟效率促进胚胎发育的有效途径之一,该研究结果可为今后研究转基因克隆胚胎发育相关基因调控机理提供了理论基础.     

小鼠极体重组卵母细胞的体外受精与发育

分别以昆明系、ICR系、C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系(即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠)和无标记C57BL/6J系小鼠(Mus musculus)为试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能.超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs),利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体(Pb Ⅰ);以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbⅠ进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将Pb Ⅰ核供体注射到去核卵母细胞中,进一步观察重组卵母细胞体外受精和体外培养发育能力.结果表明,注射hCG后12～14 h回收的Pb Ⅰ活力最佳,4℃条件下保存48 h后Pb Ⅰ仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重组卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎,38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎.初步证明小鼠第一极体重组卵母细胞可体外受精和体外早期发育,为发掘和利用家畜母本基因资源提供了参考依据.     

不同成熟液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期胚胎发育的影响

本研究探讨了不同成熟液[改良TCM-199液(mTCM)和改良NCSU-23液(mNCSU)]对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期胚胎发育的影响，以期提高其受精和胚胎发育潜能。试验表明：(1)猪卵母细胞的核成熟与其周围的卵丘细胞扩展没有必然的联系，卵丘细胞扩散或成放射状不宜作为猪卵母细胞核成熟的标准，只有排出第一极体才能作为猪卵母细胞核成熟的标志；(2)利用mTCM 10％猪卵泡液和mNCSU 10％猪卵泡液的猪卵母细胞体外培养核成熟效果优于mNCSU 10％胎牛血清，但这三组成熟液对猪卵母细胞的卵丘细胞扩散和体外受精后的早期胚胎发育无显著影响。     

丁内酯-Ⅰ对绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响

绵羊(Ovis arise)卵母细胞经丁内酯-Ⅰ(BL-Ⅰ)抑制培养,然后转入成熟培养液培养不同时间,进行体外受精并观察胚胎发育情况.结果表明,解除8 h抑制再培养8 h组处于MⅡ期卵母细胞率6.38%,显著低于其它组(P<0.01).继续培养16和20 h的卵母细胞成熟率与对照组(常规培养24 h)差异不显著,培养24 h组卵母细胞成熟率(70.83%)稍高于对照组(66.18%),但差异不显著(P>0.05).培养16和20 h组囊胚率分别为2.99%和13.64%与对照组24.39%差异显著(P<0.05),培养24 h组的囊胚率20.33%与对照组差异不显著(P>0.05).表明BL-Ⅰ对绵羊卵母细胞的体外成熟有明显抑制作用,但其抑制作用是可逆的,而经BL-Ⅰ处理后未能提高绵羊卵母细胞体外受精和胚胎的整体发育能力.