坝上长尾鸡TYR基因核心启动子鉴定与单核苷酸多态性分析

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)作为参与黑色素形成并起调节作用的关键酶,对于动物毛色表型具有重要意义。TYR功能异常会阻断黑色素形成通路,TYR突变会产生白化而导致皮肤、被毛和羽毛呈现白色表型。基因启动子区的转录调控对基因表达具有重要作用。为探明坝上长尾鸡(Gallus gallus)TYR基因启动子活性区及其结构,本研究首先构建了双荧光素酶表达载体,通过脂质体瞬时转染至鸡胚成纤维细胞DF1,利用双荧光素酶检测试剂盒进行启动子活性检测;进而成功克隆了TYR基因5'侧翼区片段1813 bp,构建了7个含有不同长度启动子片段的表达载体(P1~P7)及2个启动子区突变载体(mut-1和mut-2),确定了鸡TYR基因启动子的核心区域为-810~+65,其中-810~-213区域可能存在重要的正向调控元件SP1、Oct-1、GATA-1、C/EBP、SRF、NF-1、YY1、NF-κB、TBP和AP-1的结合位点。通过测序筛选出-963~-957、-955、-932、-692、-391和-321等6个多态位点,利用SHEsis软件预测到8种单倍型:Hap1~Hap8;白羽鸡和黑羽鸡基因型及等位基因频率差异显著(P0.05),白羽鸡的优势基因型分别为BB、DD、FF、II、KK和MM,Hap1频率为100%,黑羽鸡的优势基因型分别为AA、CD、EF、HH、JJ和LL,Hap2频率最高为40%;突变体mut-2的活性值显著低于其对应的非突变体P2,突变体mut-1的活性值显著低于其对应的非突变体P6(P0.05)。上述6个多态位点可能是影响TYR基因启动活性的重要位点,但不是全部的作用位点。启动子活性降低可能影响TYR基因转录,从而影响黑色素合成。本研究探明了坝上长尾鸡TYR基因启动子活性区及其结构,为深入探讨该基因在毛囊组织中的表达调控提供了实验依据。     

猪肥胖基因ob近端启动子的生物信息学分析

通过检索网上数据库资料,获得ob的转录本信息;利用F irstEF等预测程序分析并获得ob的启动子序列,并使用M atlspector程序对启动子序列的转录因子结合位点进行预测。结果表明,目前已知的ob转录本中,5′UTR区最长的序列为AF 492499(G enB ank登录号);利用F irstEF等预测程序分析成功获得了长度为529 bp的猪ob的启动子序列,M atlspector程序分析该启动子中含有24个转录因子结合位点,包括TATA盒、SP 1、C/EBP等多种顺式反应元件。通过分析获得了猪ob启动子序列及其转录调控信息。     

鸡的酪氨酸酶基因5''''调控区的单链构象多态性分析

酪氨酸酶(byrosinase，TYR)是动物黑色素合成的关键酶。对鸡TYR基因上游调控区序列-641～-2125bp进行了单链构象多态性(SSCP)分析，发现在该区域内存在3个单核苷酸多态(SNP)位点，并分析了SNPS位点与中国农业大学资源群体亲代(P)和F2代个体黑色素性状的相关性。结果显示TYR基因调控区SNPS位点与鸡的胫色和皮肤色显著相关。     

沉默鸡B-Fα基因对IL-2、IL-4和IL-6转录水平的影响

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)和白介素(interleukin, IL)都是重要的免疫分子,其中MHCⅠ类分子递呈内源性抗原并启动细胞免疫,IL则是重要的免疫调节因子。关于鸡(Gallus gallus) MHCⅠ类分子(又称为B-Fα)与下游调节因子IL基因的关系尚不明确。本研究旨在应用基因沉默法研究下调B-Fα基因表达对IL-2、IL-4、IL-6转录水平的影响。首先构建沉默鸡B-Fα基因的重组慢病毒载体。根据B-Fα基因和短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)序列的结构要求,筛选3段DNA序列并设计合成shRNA;利用限制性内切酶定向插入慢病毒表达质粒pLL3.7,获得重组质粒。分别将3个重组质粒转染293T细胞,均能表达标签蛋白并包装慢病毒。将3株重组病毒感染HD-11细胞,感染效率达95%以上。利用qRT-PCR进行检测分析显示,重组病毒干扰B-Fα基因表达,分别下调至39%、97%和61%。将其中干扰效果最佳的重组慢病毒(pLL-sh B-Fα-257)感染鸡源巨噬细胞系HD-11细胞,并检测IL-2、IL-4和IL-6的转录水平。结果显示,B-Fα基因表达下调的同时,IL基因转录水平受到不同程度的影响,其中IL-2表达下调(P0.01),IL-4上调(P0.05),IL-6没有明显变化。上述结果提示,应用基因沉默法可抑制B-Fα基因表达,并影响IL基因的转录水平,提示启动细胞免疫的B-Fα基因与下游调节免疫反应的细胞因子之间存在关联。本研究为深入探讨免疫反应的调控机理提供了基础资料。     

CAST基因5'调控区的多态性与鸡肉质性状的关联性分析

为探讨钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)基因5'调控区的多态性与鸡肉质性状的关系,本研究以中国农业科学院家禽研究所选育的F、D、Y、B和S3等5个优质肉鸡(Gallus gallus)品系为试验素材,利用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术检测CAST基因的SNPs,并分析其多态性与肌肉pH值、维生素B1、肉色、系水力、肌内脂肪和肌纤维密度之间的关系.结果显示,在距CDS-198位点发现1个突变位点(G→A),G-198A位点检测到3种基因型GG、GA和AA,相关分析显示,AA基因型个体的肌内脂肪和肌纤维密度显著高于GG型和GA型个体(P＜0.05),而其他肉质性状无显著差异(P＞0.05).由此可见,对于肉质性状而言,AA是最有利基因型,本研究结果初步表明CAST基因G-198A多态位点的A等位基因是提高鸡肉质性状的一个潜在的DNA标记.     

雄性不育烟草atp6基因育性相关生物信息学分析

线粒体基因atp6与多种植物细胞质雄性不育(CMS)关系密切。为探索atp6基因致烟草CMS的潜能,以2对烟草不育系和相应保持系为材料克隆atp6基因,测序结果显示不育系与保持系atp6基因间有6个碱基差异。进一步的生物信息学分析结果表明,6个碱基差异导致4个预测氨基酸残基差异及差异残基所处区域的亲/疏水性改变,不育系atp6基因预测蛋白在二级结构和结构域上均呈现出周期结构(主要为α-螺旋)增加而非周期结构(主要为无规卷曲)减少的趋势,不育系atp6基因的碱基差异能在一定程度上引起编码亚基空间结构类型发生改变。推测atp6编码亚基尤其是亚基结构域空间结构类型的改变可能干扰线粒体F₀F₁-ATP合成酶的功能,从而成为影响烟草育性的因素之一。     

猪FUT1基因启动子区的确定及活性分析

F18大肠杆菌(Escherichia coli F18,E.coli F18)是养猪(Susscrofa)业中发生最普遍、危害最大的病原菌之一,球系列鞘糖脂生物合成通路及通路中α-(1,2)岩藻糖转移酶1基因(alpha(1,2)fucose transferase 1,FUT1)对断奶仔猪F18抗性具有重要调控作用.本研究运用生物信息学技术挖掘课题组前期获得的断奶仔猪转录组测序结果,确定FUT1基因的转录起始位点和启动子区.同时对启动子区序列进行CpG岛分析;采用双荧光素酶报告基因以及AliBaba 2.0软件,分别分析启动子区活性和CpG岛序列潜在的转录结合位点.通过比对人类(Homo sapiens)和猪的基因序列信息数据库,结果表明,FUT1基因转录起始区域具有5种可变剪接(AS-1,AS-2,AS-3,AS-4和AS-5)和2个启动子区域(启动子1和启动子2);双荧光素酶报告基因检测结果进一步显示,FUT1基因启动子2的转录活性极显著高于启动子1的转录活性(P＜0.01),启动子2的活性是启动子1的2.75倍,根据结果可以推测启动子2在转录过程中起主导作用;CpG岛分析显示,猪FUT1基因启动子1和启动子2分别存在一个CpG岛.FUT1启动子1扩增片转录因子预测分析表明,FUT1基因启动子1存在20个潜在的转录因子结合位点,并且Sp1出现在多个转录结合位点处.本研究结果为猪FUT1基因的甲基化检测和调控机制分析提供一定的基础和依据.     

浙贝母HMGR基因保守区序列的克隆及生物信息学分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸途径中的第一个限速酶,在植物生物碱类物质代谢过程中发挥重要的作用。为探究HMGR酶在浙贝母甾体类生物碱合成代谢途径中的调控作用,以百合科浙贝母狭叶品种为材料,利用RT-PCR技术和Ta克隆技术首次从浙贝母中克隆出HMGR基因保守区序列,长度为390 bp。序列分析表明,浙贝母HMGR基因保守区序列与其他9种植物的HMGR基因有较高的相似性(84%~79%);蛋白质同源比对、特征区及系统进化树分析表明,浙贝母HMGR氨基酸片段与其他植物有较高的同源性(95%~88%),与球药隔重楼和海枣等单子叶植物的亲缘关系较近,据此,初步确定该基因为浙贝母HMGR基因,命名为Ft HMGR。Ft HMGR基因的克隆及分子鉴定为进一步解析该基因在浙贝母甾体类生物碱合成代谢途径中的分子调控作用奠定了基础,有助于对浙贝母活性物质的合成进行调控,从而提高产量。     

黑素皮质素受体3基因(MC3R)多态性及其单倍型组合与京海黄鸡屠体性状的关联分析

本研究旨在探讨黑素皮质素受体3基因(melanocortin 3 receptor,MC3R)对鸡(Gallus gallus)屠体性状的影响。采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)检测及测序的方法,检测MC3R在京海黄鸡群体中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),并对这些多态位点进行连锁不平衡和单倍型分析。结果表明,在MC3R编码区序列(coding sequence,CDS)共检测到6个SNPs位点,各位点间均不存在强连锁不平衡;6个SNPs位点在379只京海黄鸡的群体中形成了5种单倍型和11种单倍型组合。最小二乘法分析结果表明,不同单倍型组合间京海黄鸡屠体性状(包括活体重、屠体重、胸肌重、腿肌重、全净膛重、半净膛重和腹脂重)存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01),其中单倍型组合H3H4和H3H3的各种屠体性状均极显著高于单倍型组合H4H5(P<0.01),也显著高于其他部分单倍型组合(P<0.05),为屠体性状优势组合;单倍型组合H4H5各屠体性状均为最低,均显著或极显著低于其他大部分单倍型组合(P<0.05或P<0.01),为屠体性状劣势组合。因此,MC3R可能是影响鸡屠体性状的主效基因或与主效基因连锁,本研究为京海黄鸡屠体性状分子标记辅助选择提供了参考依据。     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.     

酉州乌羊MC1R基因的克隆鉴定、生物信息学及多态性分析

MC1R是影响皮肤色素沉着中黑皮素系统的重要基因,通过信号分子的相互作用影响黑色素的生成。为探究酉州乌羊 MC1R的生物学特性,本研究对酉州乌羊MC1R进行了分离鉴定、生物信息学分析。结果表明,酉州乌羊皮肤组织MC1R基因的CDS序列为954 bp,共编码317个氨基酸,酉州乌羊与各物种MC1R具有较高同源性。酉州乌羊MC1R编码蛋白的分子式是C₁₆₀₃H₂₅₆₅N₄₁₁O₄₁₀S₂₂,其为疏水蛋白,有7个α-螺旋组成的跨膜结构域和3个保守功能结构域,MC1R氨基酸序列大部分都用于构成α-螺旋。此外,酉州乌羊MC1R基因c.676A>G突变,其编码的氨基酸由赖氨酸转变为谷氨酸,位于受光刺激和G蛋白配体结合的保守结构域上,氨基酸的异义替换还造成了酉州乌羊MC1R空间构象的差异。而对重庆市山羊群体多态性检测发现,山羊MC1R基因c.676A>G变异位点在重庆合川白山羊、巫溪白山羊、本地白山羊、酉州乌羊中共享,且c.676A>G位点的各基因型在皮肤白色和乌色山羊群体中的分布差异不显著(P>0.05)。本研究初步揭示酉州乌羊MC1R的序列特征和蛋白结构,为酉州乌羊MC1R影响皮肤色素沉积的分子机制研究提供了理论数据。     

芒果MADS1基因生物信息学分析

选取南逗迈4号芒成花前后的顶芽进行转录组测序,在构建的c DNA文库中获得一条表达量变化明显的c DNA,经分析该c DNA属于MADS-box基因家族,命名为MADS1基因,该基因全长为1377bp,编码459个氨基酸。通过NCBI网站的blast功能分析发现其具有MADS基因家族典型的MADS结构域和K-box结构域、DNA结合位点、磷酸化位点、二聚体接口;氨基酸同源性比较发现其与番木瓜的MADS1基因具有较高的相似性,推测它们可能为同源基因,具有相似的生物学功能。     

鸡胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的多态性检测

胰岛素样生长因子-Ⅰ是胰岛素样生长因子家族中的一员，因氨基酸序列与胰岛素原高度同源(49％)而得名。鸡的生长发育受到生长轴的高度调控，垂体分泌的生长激素经过血液循环到达肝脏，与细胞表面的生长激素受体结合，启动细胞膜上的信息传递，调节鸡胰岛素样生长因子-Ⅰ(chicken insulin-like growth factorsⅠ，cIGF-Ⅰ)基因的表     

鸡MHC基因多态性与抗病性状的相关性研究进展

鸡主要组织相容性复合体(MHC)基因具有高度多态性和稳定性,与多种疾病抗性和生产性能紧密相关。本文介绍了国外有关鸡MHC与传染病、寄生虫病和自体免疫病的抗性相关性以及抗性基因的研究进展,并讨论了其在鸡抗病育种中的应用前景。     

绵羊ANO5基因的生物信息学分析

作为Anoctamin蛋白家族的第五个成员,ANO5基因主要在绵羊肌肉再生、肌母细胞融合和肌细胞膜修复中发挥作用。为探究ANO5基因在绵羊体内的功能,本研究利用生物信息学软件分析了绵羊ANO5基因及其编码产物的结构与功能。结果显示:绵羊ANO5基因含有一个最大长度为3 351 bp的开放阅读框,推测其编码1116个氨基酸残基。该基因编码蛋白的分子式为C5897H9014N1546O1668S42,分子质量为129 602.32 Da,理论等电点为7.24,估计半衰期为30 h,不稳定指数为49.71,脂肪族氨基酸指数为79.43。绵羊ANO5蛋白位于质膜的可能性最大(56.5%),不含信号肽,具有8段跨膜区,属于不稳定亲水性跨膜蛋白。二级结构以无规卷曲(68.43%)为主,三级结构主要由无规卷曲缠绕折叠形成。     

绵羊ELOVL5基因的生物信息学分析

极长链脂肪酸延伸酶蛋白家族(elongation of very-long-chain fatty acids, ELOVLs)是一类催化脂肪酸合成的限速酶,主要调控血脂、血糖及一些代谢疾病的发生。为探究绵羊ELOVL5基因的结构和功能,本研究对该基因及其编码产物进行了生物信息学分析。结果显示,绵羊 ELOVL5 基因编码737个氨基酸,其编码蛋白分子式为C1656H2448N416O415S16,其分子质量为35 335.39 Daltions,理论等电点为9.47,估计半衰期为30 h,不稳定性指数为33.35。亚细胞定位主要位于内质网中(55.6%),ELOVL5基因编码蛋白没有信号肽序列,不属于分泌蛋白。该蛋白存在多个跨膜区域,属于跨膜蛋白,存在7个保守结构域,并且为亲水性蛋白,二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,三级结构主要由α螺旋缠绕折叠而成。     

牦牛MT-3基因生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对牦牛金属硫蛋白3基因进行生物信息学分析,从而预测 MT-3 基因编码产物的理化性质以及功能结构域,并构建MT-3同源基因的系统进化树。结果表明,牦牛MT-3 基因含有1 个 513 bp 的ORF,编码 170 个氨基酸。MT-3蛋白分子质量约为17 556.37 Da,理论等电点为 5.68。MT-3 编码产物的二级结构主要以β折叠和无规则卷曲为主,推测是非酶类蛋白质。MT-3具有神经生长抑制活性,通过清除自由基和 NO ,从而起到保护脑细胞的作用。