非生物胁迫下多年生黑麦草qRT-PCR分析中内参基因的选择

提高实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)准确性的先决条件是选择表达稳定性较高的内参基因。本研究以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)为材料,利用q RT-PCR技术检测翻译起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4 alpha,e IF4A)、TNF结合蛋白Ⅰ(Tat binding protein-1,TBP-1)、泛素连接酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)、多聚泛素酶基因(ubiquitin,UBQ)、生物钟受体蛋白(zeitlupe,ZTL)和甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)6个候选内参基因在不同非生物胁迫下的表达情况。运用ge Norm(ver.3.5)、Normfinder(ver.0.953)、Best Keeper(ver.1.0)、Delta Ct和Ref Finder软件综合分析表明,在干旱、盐、热胁迫及ABA处理下,e IF4A基因表达稳定性最高;在涝胁迫下,UBQ基因表达稳定性最高。因此,e IF4A和UBQ候选基因可作为不同胁迫下的内参基因,为进一步开展多年生黑麦草基因表达的定量研究了提供了一定的理论依据。     

毛竹qRT-PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)是目前研究基因表达的常用方法,而在特定的实验材料及条件下选择合适的内参基因是准确分析目标基因相对表达量的首要条件。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)的根、茎、叶和笋等器官和组织为实验材料,通过qRT-PCR技术对5种常用内参基因:甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(actin,ACT)、热休克蛋白(heat shock protein,HSP)、18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S r RNA)和真核起始因子4α(eukaryotic initiation factor 4α,e IF-4α)在毛竹不同器官和组织中的表达情况进行了分析。经Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3个软件对比分析发现,对5种常用内参基因而言,在利用qRT-PCR分析比较毛竹不同叶片之间的基因表达差异时,可选取e IF-4α作为校正内参基因;比较笋不同部位之间的基因表达差异时,可选取18S r RNA或ACT作为校正内参基因;而比较毛竹根、茎、叶不同器官组织分化中的基因表达差异时,可选取18S r RNA作为校正内参基因。而上述发现与多数文献中把ACT作为毛竹唯一内参基因的研究不一致。本研究为在毛竹qRT-PCR分析中选择合适的内参基因提供了理论依据。     

杜氏盐藻磷脂酶C基因DsPLC的克隆及盐胁迫下的表达分析

为了研究磷脂酶C基因的结构与功能,采用RT-PCR和RACE技术从盐藻中克隆出了一种磷脂酶C基因(GenBank Accession No.KF573428),命名为DsPLC,并对其进行了生物信息学分析和盐胁迫条件下的表达分析。结果表明,DsPLC的cDNA全长2 628 bp,开放阅读框1 782 bp,编码593个氨基酸。该蛋白质为亲水性稳定蛋白,没有信号肽,也没有跨膜区域,是一种非跨膜蛋白,存在多个潜在的磷酸化位点,二级结构的主要元件为无规卷曲和α-螺旋。进一步的进化分析结果表明,盐藻与衣藻、团藻的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,正常情况下DsPLC的表达量很低,当受到高盐胁迫时表达量急剧升高,且在胁迫4 h时表达量达到最高,是对照组的10倍左右,差异极显著(P0.01),表明DsPLC可能在盐藻抵御外界盐胁迫的过程中起重要作用。这些研究结果为进一步阐明DsPLC的功能及其作用机制奠定了分子基础。     

牙鲆胚胎低温处理下内参基因筛选及CIRP和Hsp70基因表达分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国主要的海水经济养殖鱼类,在胚胎冷冻保存方面已获得了超低温冷冻保存成功的案例,但在分子水平上对牙鲆胚胎在低温状态下相关基因的表达进行研究,至今还未见报导。本研究首先收集了牙鲆的3个胚胎时期(肌节期、尾芽期和心跳期),分别在0℃及16.5℃进行处理培养,使用实时荧光定量PCR技术检测4个内参基因18S rRNA、ACTB、GAPDH及EF1α的表达水平,并用Ge Norm和Norm Finder软件对其的稳定性进行排序分析。Ge Norm软件分析结果显示,18S rRNA和EF1α的稳定性最好,稳定性最差的为GAPDH;Norm Finder软件分析结果显示,18S rRNA的稳定性最好。综合两个软件的分析结果,在不同发育时期以及低温处理的牙鲆胚胎中,18S rRNA表达量相对稳定,较其他3个基因更适合作为内参基因。为探究牙鲆胚胎在低温处理下分子水平的变化,本研究选取了对温度适应性较强的尾芽期胚胎为实验材料,分别在低温0℃和正常培养温度16.5℃下进行培养,并选取与应激反应相关的热休克蛋白基因(heat shock protein,Hsp)70和冷诱导RNA结合蛋白基因(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)进行表达量分析。实时荧光定量PCR的结果表明,CIRP的表达量在0℃处理30 min之内逐渐下降,在30 min时达到最低值,30~120 min内上升,并在120 min时达到峰值,之后回落,在180 min时,其表达量回落到与对照组相似的水平。而Hsp70在低温处理的前30分钟表达量下降,后回升,120 min达到最大值后回落的现象,与对照组有显著性差异(P0.05)。研究结果说明低温会导致CIRP及Hsp70基因表达水平的改变,先下降后升高再回落的趋势也说明了机体内对低温应激产生了保护反应,为探索牙鲆胚胎在低温下调节和适应的分子机理提供了一定的依据。     

铜胁迫下天蓝苜蓿根组织实时定量PCR内参基因的选择

豆科植物-根瘤菌共生体系因固氮能力卓越,肥土效应明显,常被作为先锋植物进行环境修复。利用qRT-PCR分析铜胁迫下天蓝苜蓿(Medicago lupulina L.)与根瘤菌(Sinorhizobium meliloti,CCNWSX0020)共生固氮过程中差异基因时,由于环境中铜离子差异可能使持家基因表达不稳定,因此需要筛选合适的持家基因作为内参。本研究选取8个天蓝苜蓿的持家基因(肌动蛋白(beta actin,ACT)、组蛋白(histone H2A,H2A)、核糖体蛋白18S(ribosomal 18S,18S)、微管蛋白(tubulin beta,TUB)、泛素连接酶(ubiquitin,UBI)、延伸因子1(elongation factor 1,EF1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和亲环蛋白(cyclophilin,CYP))作为候选内参基因,人工模拟不同水平铜(浓度分别为50、100、150和200 mg/kg)污染,以接种根瘤菌后30 d的天蓝苜蓿根为材料,筛选最佳内参基因。经引物特异性及PCR扩增效率检测,各候选内参基因引物均符合稳定性筛选要求。荧光定量PCR分析结果表明,8个候选内参基因的表达水平和稳定性随铜离子浓度不同而呈现差异。在线评估所有样品中候选内参基因表达稳定性,结合geNorm软件分析最佳内参基因组合数目,结果发现,最适内参基因组合为GAPDH和EF1;分别在线评估不同铜浓度处理下候选内参基因表达稳定性,结果表明,低浓度铜(≤50 mg/kg)处理下最佳内参基因为GAPDH,中高浓度铜(≥100 mg/kg)处理时最佳内参基因为UBI。本研究结果为铜胁迫下天蓝苜蓿共生结瘤过程中差异基因的表达分析提供了基础资料,同时为其他重金属胁迫下内参基因的筛选提供了参考和借鉴。     

磷化氢诱导下赤拟谷盗实时定量PCR内参基因的筛选

实时定量RT-PCR(qRT-PCR)是进行基因表达水平分析的一种常用技术手段,而选择相对稳定的内参基因对数据进行标准化是获得可信数据的关键。本研究使用qRT-PCR技术评价8个内参基因—β-actin、GAPDH、α-Tubulin、SYN1、SYN6、RPS3、RPS18和RPL13a在磷化氢诱导后的不同品系赤拟谷盗(Tribolium castaneum)中的表达水平,采用相对定量方法并分别使用geNorm和NormFinder程序进行数据分析。其中经geNorm软件分析的8个内参基因的稳定性由高到低排列顺序为RPS18=RPL13a(0.007)SYN6(0.015)RPS3(0.038)β-actin(0.044)α-Tubulin(0.105)SYN1(0.154)GAPDH(0.205),且内参基因配对差异值V2/3值为0.006,从而确定内参基因的最适数目为2个,分别为RPS18和RPL13a。NormFinder与geNorm相似,其运行结果以稳定值的大小排序,经NormFinder分析的各内参基因的稳定性由高到低的排列顺序为RPS18(0.002)RPL13a(0.016)β-actin(0.042)RPS3(0.044)SYN6(0.055)α-Tubulin(0.066)SYN1(0.077)GAPDH(0.126),由此得出RPS18的稳定性最高,最终由该程序判定的最佳组合是RPS18和RPL13a。因此,geNorm和NormFinder两款软件的分析结果一致,最终确定相对适合的内参基因有两个:RPS18和RPL13a,该结果为赤拟谷盗基因的表达研究提供了基础资料,也为其他昆虫内参基因的筛选提供参考。     

花生中低温胁迫相关转录因子基因的筛选

为了研究花生低温胁迫下的基因表达调控机理,以花生花育19为材料,通过低温处理后芯片杂交实验,筛选花生叶片中低温胁迫响应转录因子基因。结果表明,175个具有转录调控活性的基因在低温胁迫的花生叶片中表达变化量达到2倍以上,其中92个为上调基因,83个为下调基因。通过基因功能分类分析发现,这些基因中53个上调基因和46个下调基因编码转录因子。进一步分析发现,参与花生低温抗性调控的转录因子主要包括MYB、WRKY、NAC及AP2/ERF等家族蛋白。此外,一些不包含已知保守结构域的转录因子也参与了花生低温抗性调控。本研究为花生低温抗性调控研究提供了新的转录因子基因资源。     

牡丹实时定量PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR(qPCR)是目前研究基因定量表达的重要方法,根据特定实验材料及条件选择qPCR分析中合适的内参基因对于准确校正目的基因的表达至关重要。本研究以牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)不同组织(根、茎、叶和花瓣)、切花开放不同时期及不同处理(乙烯或葡萄糖处理)的花瓣为材料,利用qPCR技术探讨了5种常用看家基因:β-微管蛋白基因(β-tubulin)、泛素基因(ubiquitin)、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(GAPDH)、肌动蛋白基因(actin)及18S核糖体RNA(18S rRNA)的表达情况,各看家基因均能特异扩增并显示较高的扩增效率。经geNorm和NormFinder程序统计学计算处理,综合分析结果显示,在牡丹不同组织或切花开放不同时期花瓣中,ubiquitin表达最为稳定;在不同处理的切花花瓣中,GAPDH表达最为稳定,二者分别适宜作为相应条件下的内参基因。本研究认为,各实验条件下使用ubiquitin和GAPDH两个表达最稳定的基因组合,即可获得更为精确的基因表达结果。本研究结果对牡丹中关键基因的定量表达分析具有重要的实用价值。     

冬瓜实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为筛选适合冬瓜稳定表达的内参基因,以黑皮冬瓜低温、高温、干旱胁迫处理不同时间的叶片和正常处理不同组织为试验材料,利用RT-qPCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价7个候选内参基因(28SrRNA、UBQ、RP Ⅱ、GAPDH、EF-1α、UBC21和TUA)稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同组织和不同胁迫处理下表达丰度及稳定性存在差异; EF-1α在低温胁迫处理下表达稳定性最好;UBQ和TUA在高温和干旱胁迫处理下表达稳定性最好; EF-1α 在不同组织中表达稳定性最好。本研究结果为冬瓜内参基因的选择提供了一定的理论参考。     

玉兰肌动蛋白基因的克隆与序列分析

本研究选取玉兰（Magnolia denudata Desr.)为材料，提取总RNA，利用设计的肌动蛋白编码区两端的特异性引物和5'RACE试剂盒，扩增出肌动蛋白编码的cDNA基因。以豌豆卷须肌动蛋白基因作探针，通过Southern杂交进行检测，证明同源性很高。将所获得序列克隆到pGEM-T载体上进行测序，测序结果在GenBank中进行查询，并与其他高等植物肌动蛋白基因序列进行了分析。     

黄秋葵实时荧光定量PCR内参基因的克隆与筛选评价

为筛选黄秋葵实时荧光定量PCR的稳定内参基因,本研究以绿白1号为试验材料,根据黄秋葵RNA-seq数据库,筛选并验证获得18SrRNA、ACT、EF-1α、TUA、TUB、GAPDH等6个内参基因ORF序列;以黄秋葵不同组织、不同发育时期果实、不同发育时期叶片和低温、高温、干旱胁迫处理的叶片为材料,利用实时荧光定量PCR技术分析测定基因表达量,并结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价6个内参基因的稳定性。结果表明,6个基因在不同组织、各发育阶段及不同胁迫下均有表达,但表达稳定性不尽相同,其中,EF-1α在黄秋葵果荚发育、高温胁迫下表达稳定性最好;18SrRNA在黄秋葵各组织、叶发育和干旱胁迫下表达稳定性最优;ACT在低温胁迫下表现最稳定。此外,在29个处理中,18SrRNA、EF-1α、ACT表达均较稳定,可以用于荧光定量表达分析。本研究结果为黄秋葵基因功能分析和调控机理研究提供了基础。     

扇脉杓兰实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出扇脉杓兰实时荧光定量PCR(RT-qPCR)中最适内参基因,以扇脉杓兰幼根、茎、叶、唇瓣、种子为研究材料,利用RT-qPCR技术检测12个常见看家基因TIF3I1、CYP22、RPS4、UPL1、UBC2、TUBB3、RPL26B、RAN1、SAMDC、ACT3、PP2A3和EF1的表达情况,结合geNorm、...     

柳枝稷根组织实时定量PCR分析中内参基因的选择

选择表达稳定性高的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)准确性的重要条件。本研究以能源植物柳枝稷(Panicum virgatum L.)根组织为材料,通过不同非生物条件胁迫,利用qRT-PCR技术检测UBQ1(泛素基因)、ACT2(肌动蛋白基因)、UBQ2(泛素基因)、TUB(β微管蛋白基因)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因)、CBP20(类胡萝卜素结合蛋白基因)、UCE2(泛素接合酶基因)、18S rRNA1(18S核糖体RNA基因)、NAC(NAC域蛋白基因)和CYP2(亲环蛋白基因)10个内参基因的mRNA的表达情况,并运用Delta-Ct method,Genorm(ver.3.5)、Bestkeeper(ver.1.0)和NormFinder(ver.0.953)软件综合分析10个内参基因的表达稳定性。结果显示,在不同的非生物环境胁迫条件下,最适合作为柳枝稷根组织研究的内参基因各不相同。10个内参基因平均表达稳定由高到低排序为:ACT2,TUB,UCE2,CBP20,CYP2,UBQ2,18S rRNA1,NAC,UBQ1,GAPDH。在干旱胁迫条件下,ACT2基因表达稳定性最高;在盐胁迫和热胁迫条件下,18S rRNA1基因表达稳定性最高;在冷胁迫和涝胁迫条件下,ACT2基因表达稳定性最高。经软件综合分析显示,ACT2、TUB和UCE2基因最适合作为柳枝稷非生物胁迫研究的内参基因;UBQ1和GAPDH基因最不合适作为内参基因。该研究结果可用于柳枝稷非生物胁迫下各种基因表达的进一步研究。     

利用实时荧光定量PCR筛选新蚜虫疠霉内参基因

内参基因的准确选择是利用实时荧光定量PCR进行准确分析基因相对表达量的前提。虫霉目真菌新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis)是重要蚜科专化性病原真菌,经常引发多种作物上蚜虫种群的流行病。本研究通过实时荧光定量PCR分析了新蚜虫疠霉ARSEF 5403中3个传统管家基因18Sr RNA(18S)、28Sr RNA(28S)和延伸因子1α相似蛋白(elongation factor-1 alpha-like protein,EF1)m RNA表达差异情况,并利用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件综合分析了其在4个生长阶段(分生孢子、萌发管时期、短菌丝和长菌丝)和3种营养条件(GLEN培养基、OS-SDB培养基和Grace培养基)下表达的稳定性。结果表明,基于公共数据库序列设计的候选内参基因的引物具有良好的扩增效率和特异性。经ge Norm软件分析,新蚜虫疠霉在不同生长阶段和不同营养条件下3个候选内参基因的平均表达稳定性(M值)分别为:18S(0.457)28S(0.534)EF1(0.749)和18S(0.389)28S(0.557)EF1(0.607)。利用Norm Finder软件分析,新蚜虫疠霉不同生长阶段和不同营养条件下3个候选内参基因的平均M值分别为:18S(0.084)28S(0.264)EF1(0.509)和18S(0.118)28S(0.355)EF1(0.403)。而Best Keeper软件分析得到的稳定性等级有所差异,在不同生长阶段和不同营养条件下候选内参基因28S表达最稳定,18S次之,EF1最不稳定。综合分析3款软件对荧光定量PCR结果的稳定性等级的平均值,得出在不同生长阶段和不同营养条件下候选内参基因18S表达最为稳定。筛选出的18S可作为分析新蚜虫疠霉基因表达差异的一个较为可靠的内参基因,同时为后续研究新蚜虫疠霉的生长、毒力相关基因的表达分析研究提供技术支持。     

西南鸢尾花色变异实时定量PCR内参基因的筛选与验证

为筛选适用于不同花色西南鸢尾花色合成途径相关基因表达分析的内参基因,本研究根据西南鸢尾及其白花变型白花西南鸢尾花蕾组织的转录组测序数据,筛选了6个常用内参基因(ɑ-TUB、β-TUB、AQP、ACT、GAPDH、UBQ),同时以百合18S做为对照内参基因,在西南鸢尾及其白花变型白花西南鸢尾的花蕾组织中,分别通过反转录PCR(RT-PCR)初筛和RT-qPCR检测表达量,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行评价。RT-PCR初筛结果显示,7个候选内参基因引物的特异性均较好,在6个样品间没有明显差异;RT-qPCR分析表明,7个候选内参基因的表达量存在一定差异,其中18S表达量最高,UBQ最低;geNorm、NormFinder和BestKeeper分析结果表明,ACT表现最稳定,最适合做为内参基因,β-TUB相对稳定性最低;以Actin为内参对西南鸢尾类黄酮/花青素和类胡萝卜素2类色素合成途径中部分相关基因的RT-qPCR分析结果与转录组测序结果相一致。本研究为鸢尾属植物花色素合成相关基因表达分析内参基因的筛选以及鸢尾属植物资源利用和花色育种研究提供了理论参考。     

盐胁迫下三角叶滨藜根系超滤特性的分析

对耐盐蔬菜三角叶滨藜(Atriplex triangularis)在盐胁迫下的蒸腾吸水量、Na+吸收和根系径向反射系数进行了测定,分析其根系超滤特性与植物耐盐性的关系。结果表明,随着盐胁迫强度的增加,三角叶滨藜的Na+吸收量逐渐增多、蒸腾吸水量和根系径向反射系数则逐渐降低;但以根外溶液盐浓度为基础的Na+相对吸收量却呈降低趋势,同时进入木质部的Na+的量也不随根的径向反射系数的减小而显著增多。说明三角叶滨藜在盐胁迫下一方面通过改变根系的超滤特性,降低根系径向反射系数来防止木质部拉力过大导致的木质部空化的危险,另一方面通过减少对盐分的吸收来避免盐分过多积累对植株的伤害。     

盐胁迫下葡萄光合特性的研究

对葡萄(8804品系)扦插苗进行不同程度的盐处理(0.2%,0.4%,0.6%),在一定时期对叶片的光合特性和叶绿素含量进行测定,结果表明:葡萄的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)的变化规律与叶绿素a、b的含量变化规律基本一致,即在处理前期都持续下降,中期出现一段时间稳定甚至上升,后期又开始下降;细胞间CO2浓度(C i)前期几乎不变,后期则迅速下降。类胡萝卜素含量的变化幅度较小。