奶牛硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子的克隆及活性分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶,为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制,本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760bp),采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点,将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后,瞬时转染到HepG2细胞,对细胞施加胰岛素(10IU/mL)和亚油酸(120μm)处理,通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性,结果发现,在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点,随着SCD启动子片段长度的延长,启动子活性也显著提高,pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比,pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05),其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高,达到了46.93。在亚油酸刺激下,pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化,而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05),研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。     

西农萨能奶山羊PPARγ基因启动子结构与功能分析

过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是核受体家族成员,作为配体激活型转录因子,在调控脂肪酸代谢和脂滴形成等方面发挥重要作用。为分析PPARγ基因启动子结构及功能,完善奶山羊(Capra hircus)乳脂代谢调控网络,本研究以西农萨能奶山羊全血DNA为模板,通过PCR技术扩增PPARγ基因5′侧翼序列,并克隆得到7个长度不同的缺失片段,分别连接pGL3-basic载体构建重组体,利用双荧光素酶报告系统检测各重组质粒活性,结合生物信息学分析确定其转录核心区域;并通过启动子定点突变和过表达CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)研究转录因子C/EBPα对PPARγ基因的转录调控。结果表明,克隆得到的PPARγ基因启动子序列全长为2 328 bp(包含转录起始位点上游2 181 bp,GenBank登录号:MG770492.1),启动子上无典型的真核生物元件TATA框,但存在C/EBPα、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding protein,SREBP)及特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)等多个转录因子结合位点;缺失片段分析结果表明,PPARγ基因启动子核心区域位于转录起始位点上游194~108 bp,且启动子上存在负调控元件;转录因子C/EBPα通过结合位于启动子上游119 bp处的C/EBPα结合元件而调控PPARγ基因的转录。本研究为后续开展PPARγ调控羊奶脂肪酸代谢的机理研究提供了资料。     

猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)启动子克隆及其分析

本研究旨在对猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)的转录调控机制进行初步探讨.首先通过PCR方法扩增MC4R基因5’上游启动区l 234 bp(-1 264～-31 bp)的片段,再利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,最后采用步移缺失获得了11段长度不等的启动子片段,并分别克隆到荧光素酶(LUC)报告基因表达质粒(pGL3-Basic)中.同时,通过双荧光素酶报告活性分析检测MC4R基因启动子区不同长度片段在猪上皮型肾细胞(PK15)中瞬时转染后的活性.结果表明,猪MC4R 5’端-682 bp处存在1个潜在的转录起始位点(TSS),细胞检测结果显示-514～-486bp区域内存在控制MC4R基础转录活性的顺式调控元件,推测该序列内的热休克转录因子(HSF)结合位点可能对MC4R基因的表达调控及功能行使具有重要作用.     

北极狐PMEL基因启动子活性及转录调控区域研究

前黑素小体蛋白基因(premelanosome protein gene,PMEL)可以直接启动黑素小体内纤维的形成,促进黑素小体合成,是调控动物毛色的主要候选基因之一。目前关于北极狐(Vulpes lagopus)毛色差异表达基因的相关研究相对较少,本研究旨在筛选调控北极狐毛色的PMEL基因的启动子核心区域及转录因子。研究通过基因组测序技术,获得了北极狐PMEL基因启动子序列,利用生物信息学方法对其核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,扩增出该基因不同长度的启动子缺失片段,并连接至p GL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了8个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐PMEL基因的-1 162/+8区域为核心启动子区域;生物信息学预测分析发现在北极狐PMEL基因的-1 162/-655区域存在5个转录因子结合位点,分别为Sp1(-966/-952)、Sp1(-912/-900)、Sp1(-750/-736)、NF-1(-712/-699)和NF-1(-682/-673);利用重叠延伸PCR技术成功构建了5个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现该5个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这5个转录因子是北极狐PMEL基因转录调控的正调控元件。本研究为探究该基因的表达调控机制提供了科学依据,并为北极狐毛皮品质分子育种和彩色毛皮材料的创制提供了思路。     

猪Nramp1基因启动子克隆及其组织表达活性分析

Nramp1基因在猪肺泡巨噬细胞中具有较高的组织表达特异性,本研究的目的是克隆并分析猪(Sus scrofa)Nramp1基因在肺泡巨噬细胞中的特异性表达调控元件.本研究首先利用5'RACE技术确定了Nramp1基因转录起始位点,在此基础上构建了-1 327～+86 bp区域内不同长度的嵌套缺失片段,分别连接至pGL3-BASIC载体上,构建了pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274及pLUC179共8个缺失表达载体.采用脂质体转染法,与海肾荧光素酶载体共转染猪肺泡巨噬细胞、肾细胞、脂肪前体细胞和胎儿成纤维细胞,采用双荧光素酶报告系统验证了Nramp1基因不同启动子片段的表达活性,结果表明Nramp1基因核心启动子区位于-386～-173 bp.进一步比较了pLUC487[-386～+86]启动子区在巨噬细胞、猪肾细胞、脂肪细胞和胎儿成纤维细胞中的表达活性,结果表明Nramp1基因在巨噬细胞中的表达活性极显著地高于肾细胞、脂肪细胞和成纤维细胞(P<0.01),表明Nramp1基因启动子具有较高的巨噬细胞特异性.本研究获得了能够在猪肺泡巨噬细胞中特异表达的调控元件,为进一步实现外源基因在猪肺泡巨噬细胞中的特异性表达提供了基础.     

小鼠生殖细胞特异基因Oct4启动子片段克隆及报告载体构建

本研究通过PCR方法从小鼠(Mus musculus)基因组中扩增出Oct4启动子的CR4区和CR1区,将其克隆到真核报告载体pEGFP-1,构建了携带Dct4启动子片段的小鼠生殖细胞特异性报告载体CR1,4-pEGFP-1.用该载体转染多种细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞中的表达情况,同时以半定量RT-PCR检测转染细胞中Oct4及其它生殖细胞特异性基因的转录情况.结果显示,GFP在小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和C2C12细胞中均不表达,而在P19细胞和睾丸细胞中表达.RT-PCR结果显示,Oct4在P19、睾丸细胞和生殖干细胞中特异性转录.这表明所构建的绿色荧光蛋白报告载体只在生殖细胞和多能生殖干细胞中内表达,该质粒可作为示踪生殖细胞的工具,同时也可以作为生殖干细胞多能性状态的一个监测标记.     

填饲对朗德鹅SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化和mRNA表达的影响

DNA甲基化是表观遗传学的研究热点之一.为了探索填饲是否能够引起朗德鹅Anser anser)肝脏脂类代谢中DNA甲基化水平以及基因表达量的变化和DNA甲基化修饰作用和基因表达之间的关系.本研究运用焦磷酸测序技术分析鹅肝脏硬脂酞辅酶A去饱和酶5基因(stearovl-CoA desaturase 5,SCD5)、固醇调节元件结合蛋白2基因(sterol regulatory element-binding protein 2,SREBP2)和超长链脂肪酸延伸酶6基因(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)的甲基化水平,再运用qRT-PCR技术进行定量验证.结果显示,SCD5、SREBP2和ELOVL6各2个片段的甲基化水平均在20％以上,均属于高甲基化状态;对照组3个基因各2个片段的甲基化水平均高于填饲组,填饲组与对照组的SCD5-1S和SREBP2-1S片段甲基化差异显著(P＜0.05),SREBP2-2S片段甲基化差异极显著(P＜0.01),SCD5-2S、ELOVL6-1S和ELOLV6-2S片段甲基化差异不显著(P＞0.05);填饲组SCD5和ELOVL6的mRNA表达量均高于对照组,而SREBP2在填饲组的mRNA表达量显著低于对照组(P＜0.05).综合各项指标,填饲引起鹅肝脏组织SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化水平降低,SCD5和ELOVL6 mRNA表达量上升,SREBP2的mRNA表达量降低,表明SCD5和ELOVL6的甲基化修饰对mRNA的表达起反向调控的作用.本实验结果为表观遗传学上DNA甲基化研究方法提供参考,为选育鹅肥肝高产高质系提供重要的分子遗传学依据,也为人类肥胖症和脂肪肝等代谢疾病的研究提供理论依据.     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.     

信号转导及转录活化因子基因(stat3)转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察

应用PCR技术从含有人信号转导及转录活化因子(star3)基因cDNA的质粒pOTa7中扩增star3基因片段.将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中.构建重组表达质粒.利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(bovinemammary epithelial cells).G418筛选阳性克隆.RT-PCR检测star3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达,并通过流式细胞术(flowcytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量.结果表明.转染24 h后大约16%的细胞被导入含star3基因的重组表达质粒.在mRNA水平证实细胞内有stat3基因的高表达.导人star3基因后,细胞增殖能力增强,染色体变为三倍体,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代.表明导入star3基因能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命.     

牛肌细胞生成素基因(MyoG)启动子的活性及组织特异性分析

肌细胞生成素(myogenin,MyoG)在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用。为了研究牛(Bos)MyoG基因启动子的启动效率和组织特异性。本研究首先克隆了牛MyoG基因启动子区域,以pDsRed2载体为外源载体,红色荧光蛋白为目的基因,构建了pDsRed-BosMyoG真核表达载体。利用脂质体介导转染体外培养的绵羊(Ovis aries)骨骼肌卫星细胞和成纤维细胞,最后通过实时定量PCR和Western blot检测红色荧光蛋白的表达,从而确定牛MyoG基因启动子的启动效率及组织特异性。结果显示,pDsRed-BosMyoG转染绵羊骨骼肌卫星细胞后在显微镜下可观察到红色荧光蛋白的表达,但在转染后的成纤维细胞中并没有观察到红色荧光蛋白的表达。在mRNA水平上,转基因骨骼肌卫星细胞中红色荧光蛋白mRNA表达量明显高于转基因成纤维细胞(P0.01)。Western blot结果显示,转基因骨骼肌卫星中高表达红色荧光蛋白,而在转基因成纤维细胞中并未检测到此蛋白。结果表明,本研究克隆得到的牛MyoG基因启动子可以特异性的在绵羊骨骼肌卫星细胞中驱动外源基因的高表达,是一种有效的肌肉细胞特异性启动子。克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为改良家畜肉质研究提供实验依据。     

高温诱导体外培养奶牛乳腺上皮细胞的应激响应

实验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究不同时间高温(42℃)热处理对细胞热休克蛋白HSP、细胞凋亡、乳脂肪和乳蛋白合成相关基因mRNA表达丰度的影响.结果发现,热休克转录子hsf-1和热休克蛋白基因hsp27、hsp70和hsp90在高温处理0.5 h后mRNA表达上调,其中hsp70转录水平有急剧上调过程,且随热处理时间延长均表现出先上升后下降的趋势;标志细胞凋亡的Bax基因从处理的0.5 h开始mRNA表达下调,随后升高;但细胞凋亡Bcl-2 mRNA表达上调;在检测的热处理过程中,αS1-酪蛋白(CSN1S1)基因转录先上调后下降,而β-酪蛋(CSN2)和嗜乳脂蛋白(BTN)基因转录均下调;与脂肪酸合成和调控相关的基因乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、过氧化物酶激活受体.-γ(PPARG)和固醇调节元件转录因子-1(SREBF-1)基因表达显著上调,而过氧化物酶激活受体-α(PPARA)基因mRNA转录没有明显变化.本实验结果证明热应激诱导了奶牛乳腺上皮细胞的应激反应,对细胞的乳蛋白和乳脂肪合成功能产生了显著影响,细胞产生热耐受.     

腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因(SREBP2)过表达载体的构建与鉴定

固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛（Bos taurus）的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因（Accession No.NM₀01205600）mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区（coding sequence,CDS）全长。将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用PacⅠ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109GFU/mL。将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。     

高、低脂系肉鸡肝脏脂肪合成代谢相关基因的表达差异分析

为探讨高、低脂肉鸡肝脏脂肪合成代谢的差异,本研究以东北农业大学肉鸡高、低腹脂双向选择品系第14世代鸡群为实验材料,利用实时荧光定量PCR方法,比较了乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调控元件结合蛋白1(SREBP1)、肝X受体(LXR)、甘油磷酸酰基转移酶(GPAT)、载脂蛋白A-1(ApoA-1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)和载脂蛋白B(ApoB)8个与脂肪合成代谢相关的基因在1～12周龄高、低脂系肉鸡肝脏中的表达模式和表达差异.结果显示,从总体上看,ACC、FAS、SREBP1、LXR、GPAT和ApoA-1基因在高脂系鸡肝脏中的表达量高于低脂系鸡的表达,其中,ACC、FAS和SREBP1基因在第10周龄高脂系鸡中的表达量均极显著高于低脂系鸡(P＜0.01); LXR基因在第9和10周龄高脂系鸡中的表达量极显著高于低脂系鸡(P＜0.01); ApoA-1基因在第6、8和10周龄高脂系鸡中的表达量极显著高于低脂系鸡(P＜0.01),在第11周龄高脂系鸡中的表达量显著高于低脂系鸡(P＜0.05);同时,研究发现,GLUT2基因在第5、8周龄低脂系鸡的表达量显著高于高脂系鸡(P＜0.05),并且ApoB基因在7周龄低脂系鸡肝脏的表达量也显著性的高于高脂系鸡(P＜0.05).本研究表明,高、低脂系肉鸡肝脏脂肪合成相关基因的表达存在着明显的差异,高脂系肉鸡肝脏具有更强的脂肪合成能力.本研究结果为进一步揭示肉鸡脂肪性状形成的分子机制提供了基础研究资料.     

STAT3基因转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察

应用PCR技术从含有人STAT3基因cDNA的质粒pOTB7中扩增STAT3基因片段。将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达质粒。利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial cells)。G418筛选阳性克隆,RT-PCR检测STAT3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达情况,并通过流式细胞术(Flow cytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量。结果表明,转染24h后大约16%的细胞被导入含STAT3基因的重组表达质粒。在mRNA水平证实细胞内有STAT3基因的高表达。导入STAT3基因后,细胞增殖能力增强,染色体倍数发生变化,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代,表明导入STAT3基因后,能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。     

Cre-LoxP系统调控肠道粘蛋白2启动子活性和特异性

靶基因的高丰度组织特异性表达是基因治疗和制备转基因动物的重要条件。运用Cre-LoxP系统是提高组织特异性启动子转录活性的有效途径之一。本研究利用Cre-LoxP系统,以肠道粘蛋白2启动子调控Cre重组酶表达,转染细胞后检测荧光素酶活性。结果显示,Cre-LoxP系统能使粘蛋白2启动子介导的靶基因在肠细胞SW480中的表达量提高约6倍。细胞特异性检验后发现,Cre-LoxP系统显著弱化了肠道粘蛋白2启动子的细胞特异性。研究结果提示,运用Cre-LoxP系统尽管可以大幅提高弱启动子的活性,但对启动子的特异性要求较高。     

光诱导转录因子MdMYB1对苹果果皮花青苷合成调控的表达分析

MdMYB1是调控苹果(Malus domestica)果皮着色的重要转录因子。黄绿色苹果脱袋后果面现红色,为了研究其花青苷合成表达调控机制,本研究采用Real-time PCR方法分析了光照对4种不同颜色苹果黄绿色品种金冠和陆奥、红色品种富士、深红色品种红星果皮转录因子MdMYB1表达的影响。研究表明,不同颜色苹果品种着色速度、面积和MdMYB1转录表达速度及累积量有关。通过金冠、红星苹果果实套袋处理,研究了果皮着色过程中结构基因苯丙氨酸解氨酶(MdPAL)、花青素合成酶(MdANS)、查尔酮异构酶(MdCHI)和类黄酮糖基转移酶(MdUFGT)的相对表达变化,结果表明,红星处理和对照转录因子MdMYB1及结构基因在着色过程中是持续表达的,而黄绿色品种金冠则没有出现持续表达的态势。金冠苹果转录因子MdMYB1与结构基因MdCHI表达模式相同,与MdPAL相似,经分析MdMYB1和结构基因MdCHI和MdPAL启动子序列,金冠苹果携带等位基因MdMYB1-2,其启动子区域有多个G-box光结合位点,据此推测,光照调控的光敏色素通过结合其启动子区域的G-box位点来调控转录因子MdMYB1-2;MdCHI在启动子区域含有顺式作用元件MBS,MdPAL含有顺式作用元件MBS和MBSⅡ,说明转录因子MdMYB1-2调控结构基因MdCHI表达,并有可能调控基因MdPAL或有密切相关性。结果表明,红星果皮全面着色可能与着色期转录因子及结构基因的持续表达和基因间协调表达有关;而金冠果皮在着红色过程中光诱导的转录因子MdMYB1调控的结构基因起决定性作用。     

牛MEN1基因真核表达载体的构建及其表达分析

多发性内分泌腺瘤致病因子1 (multiple endocrine neoplasia Ⅰ,MEN1)参与乳腺发育与泌乳行为的调控.本研究克隆了牛(Bos taurus) MEN1基因(bMEN1)的全长cDNA,并在不同细胞中检测bMEN1mRNA及其编码蛋白menin的表达情况.根据GenBank中bMEN1基因序列,设计特异性引物,用qRT-PCR方法得到附带EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的bMEN1片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(A)中.体外转染物种同源性细胞牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cell,MAC-T)和异源性细胞中国仓鼠(Cricetulus barabensis)卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12),利用qRT-PCR和Westem blot技术检测转染前后bMEN1 mRNA和蛋白menin的表达.双酶切和基因测序结果表明,成功构建了bMEN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-bMEN1.所建立的转染体系可以使目的基因bMEN1在3种不同细胞中成功表达mRNA和目的蛋白,转染后24 h都达到最高表达量,并达到极显著水平(P＜0.01),之后逐渐降低.其中,CHO细胞中的转染24 h后bMEN1 mRNA和menin蛋白的表达量分别是对照的28 415倍和5.65倍.本研究建立了bMEN1基因的真核表达载体及其转染体系,能够在不同细胞中成功表达,为体外研究MEN1基因对于乳腺的调节功能及其对于机体代谢的调节机制提供了一种工具和技术体系.     

睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因载体构建及在大肠杆菌中的表达

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,利用PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pKtac2(含强启动子tac)和pK18中,构建重组质粒pKtac2-teiR和pKteiR100。将重组质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)HB101, 提取细菌总蛋白,ELISA测定细菌总蛋白中teiR基因的表达量,结果表明: 含tac强启动子的pKtac2-teiR重组质粒具有更高的转录活性;将p6(含3a-HSD/CR基因)分别和重组质粒(pKtac2-teiR和pKteiR100)共转化大肠杆菌(Escherichia coli)HB101, 测定细菌总蛋白中3a-HSD/CR 和teiR基因的表达量,结果表明: 在大肠杆菌中teiR可以明显促进3a-HSD/CR 的表达, pKtac2-teiR与p6共转化后teiR基因的表达量比pKteiR100与p6共转化后teiR基因的表达量高,但是pKtac2-teiR与p6共转化后的3a-HSD/CR的表达量低于pKteiR100与p6共转化后的3a-HSD/CR的表达量。     

真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达

为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

鸭SCD1基因过表达对原代肝细胞脂质代谢的效应研究

硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Stearoy-Co A desaturase 1,SCD1)是肝细胞合成单不饱和脂肪酸的限速酶,对机体脂肪酸的组成具有重要调控作用。为了探究鸭(Anas platyrhynchos)SCD1基因对其脂肪沉积的遗传调控机制,本实验采用Ⅳ型胶原酶消化肝脏分离培养法分离21日鸭胚原代肝细胞并进行培养,构建携带HIS标签的p EGFP-N3-SCD1真核过表达载体,转染鸭胚原代肝细胞,利用HIS标签检测试剂盒测定SCD1基因在鸭胚原代肝细胞中的过表达量,探讨其过表达对鸭原代肝细胞脂质指标的效应。实验结果显示肝细胞初分离效果良好,细胞培养至96 h基本贴满培养板,p EGFP-N3-SCD1重组质粒在肝细胞中能稳定过表达并发出绿色荧光,SCD1基因的过表达与总胆固醇(total cholesterol,TC)及低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)含量呈极显著正相关(P0.01),与高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)含量呈极显著负相关(P0.01),与甘油三酯(triglyceride,TG)则不相关(P0.05)。结果表明:Ⅳ型胶原酶消化肝脏提取法能成功分离培养鸭原代肝细胞,p EGFP-N3-SCD1重组质粒转染效果良好,SCD1基因过表达对鸭原代肝细胞的脂质代谢具有调控作用,这对今后进一步研究SCD1对肉鸭脂肪沉积的遗传调控机制具有重要的指导意义。