雷公藤转录因子TwWRKY1基因的克隆与表达分析

雷公藤(Tripterygium wilfordii)作为传统的药用植物,其主要活性成分萜类和生物碱类在农业和医药领域有着广泛的应用。WRKY转录因子广泛参与植物的生长发育、衰老、逆境胁迫反应和次生代谢产物生物合成调控等过程。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)和q RT-PCR技术,从雷公藤发状根中克隆得到1个WRKY转录因子TwWRKY1(Gen Bank No.GAVZ01022264.1),该基因全长962 bp,开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸;生物信息学分析表明,TwWRKY1编码蛋白包含1个WRKY保守结构域,具有C2H2锌指结构,属于WRKY转录因子家族的第Ⅱ类;进化树分析结果表明,TwWRKY1与日本黄连(Coptis japonica)CjWRKY1同源性最高,具有83%的同源性。qRT-PCR技术检测TwWRKY1基因组织差异性表达表明,TwWRKY1基因在根、茎、叶中均有表达,在叶中表达丰度最高,其次是发状根、茎和不定根,自然根中最低。雷公藤发状根经茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)诱导后,TwWRKY1基因在6 h内诱导表达,随后诱导表达减弱;水杨酸(salicylic acid,SA)在9 h内诱导变化不明显,12 h后对TwWRKY1有明显的诱导作用。高效液相色谱分析发现,雷公藤发状根中内酯醇、吉碱和次碱均响应MeJA诱导,吉碱和次碱含量变化较大,内酯醇含量变化较小,但含量的增加都呈先增后减的变化趋势,与TwWRKY1基因受Me JA诱导处理后表达量的变化一致。研究结果为深入研究该基因的分子生物学特性及其调控雷公藤次生代谢产物的生物合成提供科学依据。     

转植酸酶基因玉米提高土壤磷素有效性初步研究

大田栽培条件下,研究了3种转植酸酶(phyA2)基因事件C63、C83-1-7和C84-1-14玉米根系分泌的植酸酶对土壤酸性磷酸酶活性、土壤磷素有效性以及作物磷积累量的影响。结果表明,3种转基因玉米根系植酸酶活性远远高于阴性对照,显著提高了根际土壤酸性磷酸酶的活性、增加了对根际土壤有机磷的活化和利用、减少了土壤速效磷的降低;与阴性对照相比,转phyA2基因玉米生长发育状况更好,C63和C84-1-14植株干重和磷积累量显著高于阴性对照,磷积累量分别是阴性对照的4.3倍和3.4倍。初步说明在土壤条件下,转phyA2基因玉米对土壤有机磷的利用增加,土壤磷素有效性显著提高。     

拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得

目前商业化种植的抗草甘膦转基因作物中使用的基因主要是来自土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4和大肠杆菌(Escherichia coli)的5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)基因,抗性基因资源过于狭窄,有必要拓宽可用基因种类。本研究通过PCR方法克隆了拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS基因,对其进行定点突变,并将野生型基因(AtEPSPS)和突变基因(AtTIPS)分别转化EPSPS基因缺陷型大肠杆菌菌株ER2799。草甘膦抗性鉴定结果表明,含AtTIPS基因的重组菌株在20 mmol/L草甘膦胁迫条件下长势良好(P0.01),而含AtEPSPS基因的重组菌株在5 mmol/L的草甘膦胁迫条件下即受明显抑制(P0.01)。同时将两个基因分别构建到植物表达载体中,并转化野生型拟南芥。对T1代转基因植株进行PCR验证和转录水平分析,证明外源基因已整合到拟南芥基因组中并正常表达。对转基因拟南芥进行草甘膦抗性分析结果表明,在0.5 mmol/L草甘膦处理下,转AtTIPS基因拟南芥相比转AtEPSPS拟南芥有更高的植株鲜重和存活率(P0.05),表明转AtTIPS基因拟南芥有更高的草甘膦抗性。以上结果表明AtTIPS具有较高的草甘膦抗性能力,可以用于抗草甘膦转基因作物的培育。     

水稻OsGPDH1的克隆与功能鉴定

为了解水稻甘油-3-磷酸脱氢酶基因在水稻抗逆性中的作用,本研究从水稻品种日本晴中克隆了1个编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因,命名为OsGPDH1,该基因编码的蛋白酶具有NAD(P)+结合域和脱氢酶域,且这2个结构域在植物中高度保守。构建过表达OsGPDH1基因载体转化水稻得到转基因植株,RT-qPCR分析表明,OsGPDH1基因在水稻孕穗期的叶、幼穗、茎、节、叶鞘中均有表达,说明该基因参与了水稻的生长发育过程。OsGPDH1基因也受到PEG6000、高盐、双氧水等逆境和甲基茉莉酸(mJA)、水杨酸(SA)等激素诱导表达,且诱导12h后,OsGPDH1的表达量达到最高水平,但对脱落酸(ABA)不敏感。盐胁迫下的发芽试验表明,过表达转基因水稻的发芽率高于野生型,说明OsGPDH1基因表达量的提高可增强转基因植株对盐胁迫的耐受性。对过表达OsGPDH1的转基因水稻进行苗期20%PEG6000胁迫处理后,转基因水稻的成活率显著高于野生型,说明OsGPDH1基因过表达可提高水稻苗期抗旱能力。本研究初步证明了OsGPDH1水稻抗盐胁迫和渗透胁迫的重要作用,为培育抗性转基因水稻新品种提供了新的基因资源。     

大豆发状根乙醇诱导表达系统的建立及验证

为在大豆中建立目的基因表达可控的化学诱导表达系统,本研究构建了基于乙醇诱导表达系统(ALCA switch)的GUS和GmFT2a表达载体,利用发状根农杆菌介导的根系转化体系,分别获得转ALCA-mini35S-GUS和ALCA-mini35S-GmFT2a的发状根,通过检测GUS的表达情况和GUS酶活性高低评定该系统在大豆发状根中的诱导效率,并通过检测GmFT2a表达水平加以验证。结果表明,在非诱导条件下,ALCA-mini35S-GUS发状根中未见GUS表达,而在培养基中添加乙醇后组织化学染色效果明显,说明GUS基因表达。乙醇诱导表达的效率与乙醇浓度有关,当乙醇浓度为0.05%、处理60 h时GUS相对表达量达到最高值,处理72 h时GUS酶活性最高;0.05%乙醇处理72 h时,ALCA-mini35S-GmFT2a发状根中GmFT2a相对表达量平均值约为诱导前的150倍,个别样本可达初始值的400倍。综上所述,乙醇诱导表达系统可以在大豆发状根中发挥作用,该系统不仅可用于大豆基因功能研究,而且可为培育外源基因表达可控的转基因大豆品种提供新的技术手段。     

巴西橡胶树HbMCS1基因的克隆及表达分析

2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环化磷酸合成酶（2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS）是异戊烯基焦磷酸合成途径之一——甲基赤藓糖磷酸（methylerythritol phosphate,MEP）途径中的第五个酶,催化2-磷酸-4- (胞苷-5’-二磷酸)- 2-C-甲基-D-赤藓糖醇生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-4-环化磷酸。根据植物MCS的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的MCS基因,命名为HbMCS1。序列分析表明HbMCS1长965bp,编码241个氨基酸,该氨基酸序列与长春花、拟南芥、水稻、银杏和三尖杉的MCS同源性分别达到70.8%、69.4%、64.9%和63.3%和62.2%。半定量RT-PCR结果显示,伤害诱导胶乳HbMCS1的表达,乙烯对HbMCS1的表达几乎没有影响;HbMCS1的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达。HbMCS1的克隆和表达分析为了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和对天然橡胶生物合成的调控作用打下了基础。     

转5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因抗草甘膦烟草和棉花的获得

以从抗草甘膦的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)G2中克隆的、并按双子叶植物偏爱密码子改造的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因aroAG2M为目的基因,用菊花Rubisco小亚基的启动子驱动,在基因的5'端加叶绿体定位信号肽,构建植物表达载体。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得转基因植株,PCR检测表明,外源基因已整合到烟草基因组中。转基因和非转基因植株6～8叶龄苗的叶片涂抹不同浓度的草甘膦异丙胺盐,表明转基因植株可抗4‰浓度的草甘膦,而非转基因对照植株则在2‰草甘膦时即死亡。花粉管通道法转化棉花(Gossypium hirsutum),得到3株具有草甘膦抗性的转基因植株,PCR和Southern检测显示,外源基因已整合到棉花基因组中,田间喷洒草甘膦异丙胺盐水剂,表明T1代转基因植株具有草甘膦抗性。     

高粱5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)叶绿体转运肽(CTP)的克隆及其在转基因玉米中的功能验证

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化莽草酸-3-磷酸(S3P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP),具有与草甘膦结合的活性位点,且结合后会抑制EPSPS的活性,在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值.为了培育抗草甘膦玉米(Zea mays),本研究通过对高粱(Sorghum bicolor)EPSPS基因的结构分析,克隆了该基因5'端的叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide,CTP).将该转运肽与来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4 EPSPS基因整合,以Ubiquitin为启动子,35S polyA为终止子,构建表达载体,同时以不含有转运肽的CP4 EPSPS基因为对照,遗传转化玉米得到稳定转基因株系;用PCR、Southern blot、ELISA等方法检测转基因玉米CP4 EPSPS基因的表达量并对其进行草甘膦抗性检测,研究发现,不含转运肽的转化事件虽然CP4 EPSPS基因表达量与含有转运肽的基本一致但却不具有草甘膦抗性,而含有转运肽的转化事件则抗性明显.说明转运肽并不影响CP4 EPSPS基因的表达,但对转基因植株草甘膦抗性起着重要作用,说明本研究克隆的叶绿体转运肽能够正常行使其生物学功能.研究结果为利用EPSPS基因培育抗草甘膦作物提供了重要参考资料.     

作物海藻糖合成相关基因的研究进展

海藻糖是一种非还原性二糖,广泛存在于自然界各种生物中。随着海藻糖代谢途径的发现,人们逐渐重视对海藻糖及其中间产物海藻糖-6-磷酸（trehalose 6-phosphate,T6P）的研究。T6P是糖信号重要标志,也是植物生长发育必不可少的组成部分。海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthases,TPS）催化T6P的生成,然后在海藻糖-6-磷酸磷酸酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）催化作用下发生去磷酸化反应生成海藻糖。海藻糖合成相关基因在植物生长发育、逆境调控中具有重要作用,本文对海藻糖合成及作物中相关基因的功能进行了总结。     

植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros的构建及其在草莓上的验证

为了研究多基因互作,减少多次转化的不确定性,本研究在花青素合成调节基因del(delila)和ros(rosea1)的上下游分别引入CaMV 35S启动子和nos终止子,以pBI121-del和pCAMBIA1301-ros做中间载体,并利用BamHⅠ和BglⅡ产生相同4碱基末端的片段,在连接酶的作用下将CaMV 35S启动子分别驱动的del和ros基因构建在同一个植物表达载体pCAMBIA2301上,利用所构建的载体pCAMBIA2301-delros通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导的方法转化草莓(Fragaria ananassa Duch.),并进行PCR检测,获得转基因草莓。通过组织观察发现,转基因草莓的根和叶的颜色变成红紫色;实时RT-PCR分析表明,在转基因草莓中花青素合成的结构基因花色素合成酶(anthocyanidinsynthase,ANS)、查尔酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase,CHI)、查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)、二羟黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)和类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(UDP glucose-flavonoid 3-O-glcosyl-transferase,UFGT)在转基因株系中的表达均上调,这也进一步证实通过该方法构建的植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros可以用来转化植物。本研究结果表明,植物表达载体pCAMBIA2301-del-ros成功构建,为多基因植物表达载体的构建提供了一种思路,也为在植物体内同时研究多个基因的互作提供借鉴。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

洋甘菊细胞色素P450还原酶基因(CPR)的分子克隆及表达分析

细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是生物体内氧化系统中的电子供体,在细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用,是氧化反应中的关键酶。本研究根据已经报道的其他植物的CPR基因设计简并引物,并在洋甘菊(Matricaria recutita L.)中克隆CPR基因的部分片段,然后通过RACE扩增得到CPR基因全长。结果表明,克隆得到洋甘菊的CPR基因,提交至GenBank,得到登录号KJ004519,其cDNA全长2 272 bp,包含2 106 bp的编码区,翻译701个氨基酸序列;生物信息学分析表明,洋甘菊与青蒿(Artemisia annua)的亲缘关系最近,CPR基因氨基酸序列有94%的相似性,CPR蛋白质结构包括结合P450结构域和辅因子黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核甘酸(flavin mononucleotide,FAM)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)结构域;通过qRT-PCR检测CPR基因在洋甘菊开花阶段舌状花冠、管状花冠、茎和叶中的表达量,结果表明,CPR mRNA转录本积累量在管状花冠中表达量最高,是叶中表达量的20多倍,在舌状花冠和茎中有微量表达量。本研究首次克隆了洋甘菊中CPR基因,CPR基因是植物萜类的氧化修饰过程中关键酶,为进一步研究细胞色素P450氧化酶系在洋甘菊中萜类的生物合成途径中的具体作用提供了基础资料。     

紫外(UV-B)及超声波处理对雷公藤悬浮细胞中三种次生代谢物含量的影响

目前已经找到一种由雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法,但是这种方法生产的次生代谢物产量较低,因此本研究利用紫外光(UV-B)辐照和超声波处理对雷公藤悬浮培养体系中萜类次生代谢物的含量进行了检测分析.在雷公藤悬浮细胞的不同培养时期,利用不同时长的UV-B辐照和超声波分别处理的雷公藤悬浮细胞和培养体系,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对悬浮细胞和培养液中雷公藤内酯醇、吉碱和次碱的含量进行测定.结果表明,利用UV-B辐照和超声波处理均可以显著提高雷公藤悬浮培养体系中悬浮细胞生长量及其次生代谢物的含量.紫外辐照及超声波处理均可使雷公藤悬浮细胞的生长量比对照提高1～2倍.在雷公藤悬浮细胞生长周期的第13天用UV-B辐照90 min,雷公藤悬浮细胞中内酯醇、吉碱和次碱产物含量达到最大,分别为5.185、39.747和42.189 μg/L;超声波处理40 s时,次生代谢物含量达到最大,分别为5.185、40.080和45.472 μg/L,与对照相比提高1～3倍.另外超声波处理对雷公藤悬浮细胞中次生代谢物释放分泌入细胞培养液中有一定程度的促进作用,通过对雷公藤悬浮细胞培养液中次生代谢物含量的检测发现,在处理时长分别为40 s时,内酯醇、吉碱和次碱的转化率分别达到93.7％、86.6％和88.1％,与对照相比含量提高1～3倍.本研究为解决雷公藤野生资源短缺,利用雷公藤悬浮细胞培养生产雷公藤内酯醇、吉碱和次碱提供基础资料.     

巴西橡胶树HbMCSl基因的克隆及表达分析

2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环化磷酸合成酶(2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphat synthase,MCS)是异戊烯基焦磷酸合成途径之一.甲基赤藓糖磷酸(methylerythritol phosphate,MEP)途径中的第5个酶.催化2-磷酸-4-(胞苷-5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-4-环化磷酸.根据植物MCS的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树(Hevea brasiliensis)中获得了与其相应的MCS基因,命名为HbMCSl(GenBank登录号:FJl96164).序列分析表明HbMCSI长965 bp,编码241个氨基酸,该氨基酸序列与长春花(Catharanthus roseus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza sativa)、银杏(Ginkgo biloba)和三尖杉(Cephalotaxus fortunei)的MCS同源性分别达到70.8%、69.4%、64.9%和63.3%和62.2%.半定量RT-PCR结果显示,割胶诱导胶乳HbMCSI的表达,乙烯对HbMCSI的表达几乎没有影响;HbMCSI的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达.     

抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育

5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,epsps)是一个高抗草甘膦的基因,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因(Bt基因)cry1Ac M是一个能在单子叶植物中高效表达的抗亚洲玉米螟基因。为了获得具有抗虫、抗除草剂优良复合性状的转基因玉米,本研究构建出质粒p CAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1Ac M-Tnos,通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的玉米(Zea mays)茎尖遗传转化法将目标基因转入玉米。通过分子检测、草甘膦抗性筛选和田间接种亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis(Guenée))试验筛选出转基因株系,在此基础上进行了转基因植株室内抗亚洲玉米螟试验和田间草甘膦抗性分析,并采用RT-PCR检测和Western blot方法确定了抗虫蛋白在转基因植株中稳定表达。从大量转基因株系中优选出6个遗传稳定且抗亚洲玉米螟、抗除草剂草甘膦的转基因玉米株系,这些株系的抗亚洲玉米螟、抗草甘膦特性完全满足大田应用的需求。综上所述,将改造后的Bt抗虫基因cry1Ac M和抗草甘膦基因epsps一同转入玉米,赋予两种玉米骨干自交系植株抗玉米螟、抗草甘膦特性,为我国抗亚洲玉米螟抗草甘膦转基因玉米的大面积推广培育出了优良自交系。     

Leafy启动子控制下5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶基因(CP4EPSPS)的表达增强芽对草甘膦的抗性

抗草甘膦基因在转基因植物体内持续高效表达,不但增加植物代谢压力,有的甚至改变植物形态造成植物的生长发育畸形。为了减少转基因植株的代谢负担和能源浪费,从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)基因组中克隆了Leafy组织特异性启动子替代CaMV35S启动子,用其驱动改造后加二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)小亚基引导肽的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)基因,同时调控报告基因gus的编码区构建植物表达载体p3300-Leafy-gus和p3300-Leafy-CP4EPSPS,嵌合基因经农杆菌(Agrobacterium)介导转化烟草。稳定表达后经GUS组织染色分析表明,Leafy驱动的gus表达仅局限在植物茎尖和幼叶部分,转基因植株成熟的叶片、茎部和根系均未能检测到GUS活性。草甘膦试验分析表明,Leafy驱动的CP4EPSPS的转基因植株幼芽部位有草甘膦抗性。结果表明,Leafy启动子驱动CP4EPSPS表达增强植株芽端对草甘膦的抗性。     

转基因大豆加工产品的定性PCR检测*

利用改良的CTAB法，对多种大豆（Glycine max)加工产品DNA进行分离纯化，并以大豆特异性内源基因大豆凝集素基因为参照，对用该方法获得的DNA的可扩增性加以验证。设计CaMV35S启动子和NOS终止子特异性引物对大豆及其加工产品是否为转基因产品进行初步的定性PCR筛选，用转基因抗除草剂大豆中的目的基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene,CP4-EPSPS)对阳性结果进行确证。实验结果表明，用改良的CTAB法提纯得到的大豆加工产品中的DNA完全可以满足PCR等分子生物学分析，而且定性PCR法能有效检测大豆及其加工产品中转基因成分。     

玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因家族成员在盐胁迫条件下的差异表达

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶,催化甲基供体和化合物前体S-腺苷甲硫氨酸的合成.为研究S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在盐胁迫条件下的响应和功能,以玉米甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为内参基因,通过半定量RT-PCR法分析玉米SAMS基因在盐胁迫条件下的表达模式.结果表明,玉米SAM...     

源于Cupriavidus campinensis BJ71的cctfdA基因的遗传转化提高烟草2,4-D抗性

高浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)是一种选择性除草剂,被广泛应用于防除阔叶杂草。为了避免2,4-D喷施过程中的喷雾和蒸发漂移,有必要提高敏感植物的2,4-D抗性。来源于微生物的2,4-D降解基因编码蛋白可以将其代谢而解除毒性。本研究以前期从2,4-D降解菌Cupriavidus campinensis BJ71菌株中克隆得到的2,4-D降解基因cctfdA为模板进行适合于烟草(Nicotiana tabacum)表达的密码子优化,利用改造后的基因Nt-cctfdA构建植物表达载体pSH737-Nt-cctfdA遗传转化烟草。结果表明,与野生型烟草及转化空载体的烟草相比,转Nt-cctfdA基因烟草的离体叶片及丛生芽的2,4-D抗性明显高于对照;转基因烟草植株可以抗10 000 mg/L浓度的2,4-D,而对照植株经350 mg/L浓度处理后死亡,表明转基因烟草的2,4-D抗性显著高于对照烟草30倍以上,且可以对抗10倍的2,4-D田间使用剂量。转基因烟草在2,4-D喷施前后,叶绿素含量基本无变化,而对照烟草的叶绿素含量明显降低。研究结果表明转基因烟草的2,4-D抗性显著提高,为进一步阐明转基因烟草的2,4-D抗性机理及2,4-D抗性转基因烟草的研发提供了基础资料。