鸭PPARs启动子扩增、序列比较及其转录因子表达模式的聚类分析

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是核激素受体超家族的一员,分α、β/δ、γ3个亚型,是调节细胞生长和分化的重要因子.为了解PPARs各成员在鸭(Anas platyrhynchos)骨骼肌发育中的不同作用,本研究克隆了鸭PPARα、PPARβ和PPARγ基因启动子区,预测其共同转录因子结合位点,用qRT-PCR检测PPARs及共同转录因子在鸭胚及出生后骨骼肌发育过程中的表达,比较表达模式并进行聚类分析.结果表明,扩增出鸭PPARα、PPAEβ和PPARγ启动子序列分别为2 526、1 631和2 942 bp,GenBank登录号分别为KX845431、KX845432和KX845433.鸭PPARs启动子区存在典型的CAAT-box、TATA-box顺式作用元件,预测存在共同的特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein alpha,C/EBP-α)转录因子结合位点.PPARs成员在鸭胸肌、腿肌组织中均有表达.在胸肌中,转录因子NF-κB与PPARβ基因的表达模式一致;在腿肌中,Sp1、NF-κB、PPARβ和PPARγ的表达模式一致.PPARs各成员均参与了骨骼肌的发育调控,PPARβ作用可能更大;PPAPβ、PPARγ在鸭骨骼肌发育过程中的功能可能相似;此外,NF-κB可能调控PPARβ在骨骼肌中的表达.研究结果为PPARs基因的表达和功能鉴定提供理论依据.     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.     

猪肥胖基因ob近端启动子的生物信息学分析

通过检索网上数据库资料,获得ob的转录本信息;利用F irstEF等预测程序分析并获得ob的启动子序列,并使用M atlspector程序对启动子序列的转录因子结合位点进行预测。结果表明,目前已知的ob转录本中,5′UTR区最长的序列为AF 492499(G enB ank登录号);利用F irstEF等预测程序分析成功获得了长度为529 bp的猪ob的启动子序列,M atlspector程序分析该启动子中含有24个转录因子结合位点,包括TATA盒、SP 1、C/EBP等多种顺式反应元件。通过分析获得了猪ob启动子序列及其转录调控信息。     

猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)启动子克隆及其分析

本研究旨在对猪黑素皮质激素受体-4基因(MC4R)的转录调控机制进行初步探讨.首先通过PCR方法扩增MC4R基因5’上游启动区l 234 bp(-1 264～-31 bp)的片段,再利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,最后采用步移缺失获得了11段长度不等的启动子片段,并分别克隆到荧光素酶(LUC)报告基因表达质粒(pGL3-Basic)中.同时,通过双荧光素酶报告活性分析检测MC4R基因启动子区不同长度片段在猪上皮型肾细胞(PK15)中瞬时转染后的活性.结果表明,猪MC4R 5’端-682 bp处存在1个潜在的转录起始位点(TSS),细胞检测结果显示-514～-486bp区域内存在控制MC4R基础转录活性的顺式调控元件,推测该序列内的热休克转录因子(HSF)结合位点可能对MC4R基因的表达调控及功能行使具有重要作用.     

巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)与脂蛋白酯酶(LPL)基因在不同尾型绵羊品种尾部脂肪组织中的表达

本研究旨在发现CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)基因的表达对绵羊尾部脂肪含量的影响。本研究根据NCBI上牛(Bos taurus)C/EBPα基因(GenBank登录号:NM_176784.2)全长设计引物,克隆C/EBPα基因CDs序列,并用生物信息学方法分析序列和蛋白的特征;分别采用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测C/EBPα和LPL基因在9月龄陕北细毛羊(长瘦尾型)、同羊(长脂尾型、短脂尾型)、西藏羊(短瘦尾型)、滩羊(长脂尾型)和哈萨克羊(肥臀型)5个品种绵羊(Ovis aries)共计18个个体的尾部脂肪组织中mRNA与蛋白的表达水平。结果表明,绵羊C/EBPα基因(GenBank登陆号:KF830871)编码区序列全长1 062 bp,编码353个氨基酸,理论等电点为7.25,相对分子量为37.15 kD,与牛C/EBPα基因的相似性达99%,其编码的蛋白含一个典型的亮氨酸拉链结构;C/EBPα和LPL蛋白与mRNA表达趋势大致相同,均在脂尾型(同羊和滩羊)和肥臀型(哈萨克羊)绵羊尾部脂肪组织中具有较高的表达水平,而在瘦尾型(陕北细毛羊和西藏羊)绵羊尾部脂肪中具有相对较低的表达水平,且在同一品种内,同羊长脂尾型尾部脂肪中C/EBPα和LPL mRNA与蛋白表达水平均显著高于短脂尾型(P0.05)。本研究成功克隆绵羊C/EBPα基因编码区序列全长,证明C/EBPα和LPL基因表达水平与绵羊尾部脂肪的沉积有显著相关性,为进一步探寻阻断尾部脂肪过度沉积的机制,实现既能节约饲养成本又能充分发挥本品种的优良生产性能这一目的提供基础资料。     

参与逆境应答的小麦RBCS11基因启动子功能分析

光合作用相关的核基因(photosynthesis-associated nuclear genes,PhANGs)可以响应包括光照、干旱、糖以及脱落酸(abscisic acid,ABA)等多种环境信号,目前己发现并报道了多种PhANGs启动子上关于光调控的顺式作用元件,但是关于干旱以及ABA等响应元件仍然缺乏系统性研究.本研究主要对核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit,RBCS)启动子区域响应逆境胁迫的顺式作用元件进行分析.首先从中国春小麦(Triticum aestivum)基因组中分离得到TaRBCS11基因上游1 839 bp的核苷酸序列,对该启动子进行结构分析的结果表明,转录起始位点位于起始密码子上游59 bp;经PlantCARE数据库分析,发现该启动子序列上除大量保守光调控元件外(如Box Ⅰ、G-Box、I-box和GATA-motif等),还包含多种应答干旱、盐及激素等逆境因子的保守顺式作用元件(如MYB结合位点(MYB binding site,MBS)、CCAAT-box、乙烯响应元件(ethylene-responsive element,ERE)和赤霉素应答元件(gibberellin-responsive element,GARE-motif)等);从小麦基因组数据库分离得到TaRBCS11、TaRBCS13、TaRBCS10和TaRBCS14启动子序列,序列比对显示,其具有极高的同源性,同时还发现多个保守光调控元件(如MNF1、GATA-motif、I-box、G-Box和Spl)位于这4段启动子近侧区(-200bp～ATG);根据TaRBCS11启动子结构特征及调控元件分布情况,设计5条上游引物及1条下游引物用于启动子缺失片段扩增,长度分别为1 656、1 258、866、533和277 bp;随后对该启动子5’端进行缺失并构建了5个不同长度片段融合报告基因β-葡萄糖醛酸酶基因(β-glucuronidase,GUS)的缺失表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的烟草(Nicotiana tabacum)叶片瞬时表达体系研究酶活变化情况.组织化学染色与酶活分析表明,光能明显提高GUS酶活,进一步分析表明,随启动子片段的缩短,启动子片段上光调控元件缺失,启动子活性依次下降;此外,对不同启动子缺失材料进行干旱、高盐、ABA、黑暗及恢复光照处理,发现干旱、高盐、ABA和黑暗均对全长启动子(P1656)有显著的抑制作用,-804～-474 bp的区域对该段启动子响应干旱及高盐胁迫具有重要作用,而参与ABA响应的核心调控区域位于-1 597～-1 198bp.本研究验证了TaRBCS11基因的表达受干旱、高盐、ABA和光调控影响,并鉴定出其启动子上参与响应非生物胁迫的重要调控区域,研究结果为今后深入研究PhANGs表达调控机制提供了重要参考.     

北极狐PMEL基因启动子活性及转录调控区域研究

前黑素小体蛋白基因(premelanosome protein gene,PMEL)可以直接启动黑素小体内纤维的形成,促进黑素小体合成,是调控动物毛色的主要候选基因之一。目前关于北极狐(Vulpes lagopus)毛色差异表达基因的相关研究相对较少,本研究旨在筛选调控北极狐毛色的PMEL基因的启动子核心区域及转录因子。研究通过基因组测序技术,获得了北极狐PMEL基因启动子序列,利用生物信息学方法对其核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,扩增出该基因不同长度的启动子缺失片段,并连接至p GL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了8个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐PMEL基因的-1 162/+8区域为核心启动子区域;生物信息学预测分析发现在北极狐PMEL基因的-1 162/-655区域存在5个转录因子结合位点,分别为Sp1(-966/-952)、Sp1(-912/-900)、Sp1(-750/-736)、NF-1(-712/-699)和NF-1(-682/-673);利用重叠延伸PCR技术成功构建了5个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现该5个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这5个转录因子是北极狐PMEL基因转录调控的正调控元件。本研究为探究该基因的表达调控机制提供了科学依据,并为北极狐毛皮品质分子育种和彩色毛皮材料的创制提供了思路。     

拟南芥AtEXP1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了研究拟南芥扩张蛋白AtEXPA1基因启动子上与转录调控有关的元件,我们通过PCR技术克隆了AtEXPA1基因上游897bp具有启动子活性的序列,再将启动子作不同程度截短,所有片段与GUS基因融合,构建植物表达载体,采用基因枪轰击拟南芥叶片和PEG介导转化烟草原生质体,通过定性和定量检测GUS的活性,发现在靠近翻译起始密码子的上游144bp之间存在增强转录活性的元件。将PEG介导转化的烟草原生质体,分别进行光诱导,冷诱导, 脱落酸（ABA）,盐处理,根据GUS定量检测的结果,推测（1）在AtEXPA1基因启动子上广泛存在与光调控有关的元件,（2） -897～-626 bp之间存在冷负调控元件, （3）-626～-444 bp之间存在与ABA负调控有关的元件,（4）-626～-282 bp之间存在与盐负调控有关的元件。     

鸡C/EBPα基因的多态性与生长和体组成性状的相关研究

CCAAT增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα）在脂肪细胞分化过程中起重要作用,是生长和体组成性状的重要候选基因。以东北农业大学肉鸡（Gallusgallus）高、低腹脂双向选择品系的第9、10世代肉仔鸡为材料,采用测序方法对鸡C/EBPα基因的部分5′侧翼区、编码区和部分3′侧翼区序列进行多态性检测,研究该基因多态性与鸡生长和体组成性状之间的关系。研究发现在C/EBPα基因编码区552bp位置存在一个沉默突变c.＊552G〉A。统计分析结果表明,该突变对肉鸡的腹脂重、腹脂率、肝脏重、肝脏率、胫围、胫骨重等性状具有显著影响（P〈0.05）。相对于GG基因型个体,AA基因型个体具有较高的腹脂重和腹脂率（P〈0.05）;对于肝脏重、肝脏率、胫围、胫骨重等性状,GG基因型个体则显著高于AA基因型个体（P〈0.05）。初步推断C/EBPα基因可能是控制腹脂沉积、骨骼生长发育的主效基因或与主效基因紧密连锁。     

奶牛SREBP1蛋白对FASN基因启动子的转录调控分析

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是动物组织合成脂肪酸的关键酶,为研究奶牛(Bos taurus)FASN基因的调控机制,本研究从奶牛基因组DNA中克隆构建了3个不同片段长度的FASN基因启动子并分析其结构,在L02肝脏细胞中转染固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein1,SREBP1)真核表达载体和FASN启动子,Western blot检测SREBP1核蛋白的表达,双荧光素酶系统和q RT-PCR技术研究对FASN基因启动子活性的调控作用,结果发现,构建的pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子片段长度分别为177、255和399 bp,其中pGL3-FASN2和pGL3-FASN3包含SREBP1转录因子结合位点。在人(Homo sapiens)源L02肝脏细胞中转染SREBP1质粒后检测发现,SREBP1核蛋白表达升高。肝脏细胞中转染pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子并用SREBP1质粒处理后,pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子活性极显著增加(P0.01)。与对照组相比,SREBP1处理后细胞FASN基因m RNA的表达显著增加1.67倍(P0.05)。本研究揭示奶牛SREBP1蛋白可以促进对FASN基因的转录激活。这一结果为研究奶牛FASN基因的转录调控机制提供了基础资料。     

IGF-Ⅰ、GH和CLA对脂肪前体细胞增殖、分化和基因表达的影响

为探讨类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生长激素(GH)和共轭亚油酸(CLA)对不同部位来源脂肪前体细胞的增殖和分化程度的影响,以大鼠(Rattus norveaicus)为实验模型,分别从附睾及皮下脂肪组织分离得到脂肪前体细胞,并在不同浓度的IGF-Ⅰ、GH和CLA处理后,用MTT法检测脂肪前体细胞的增殖,用油红O染色法检测脂肪前体细胞的分化聚脂程度。实验结果表明,各剂量IGF-Ⅰ和CLA均能够显著地促进大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化,但GH对大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化均无明显作用。为进一步观察IGF-Ⅰ和CLA对皮下脂肪组织的作用机制,实验采用半定量RT-PCR法检测细胞中PPARγ和C/EBPα基因表达水平,结果发现,100ng/mL IGF-I可显著上调大鼠脂肪前体细胞中PPARγ与C/EBPα基因表达水平;48ng/m LGH和100μmol/L CLA可显著促进PPARγ基因表达,但对C/EBPα mRNA表达无显著影响。结果示IGF-I可能主要通过上调PPARγ与C/EBPα基因的高水平表达进而促进大鼠脂肪前体细胞的分化,而CLA对脂肪前体细胞的作用在上调PPARγ的表达的同时,还作为PPARγ的配体激活该受体而发挥作用。     

IGF-I、GH和CLA调控脂肪细胞增殖分化和基因表达

为探讨IGF-I、GH、CLA对不同部位来源脂肪前体细胞的增殖和分化程度的影响，本研究以大鼠为试验模型，分别从附睾及皮下脂肪组织分离得到脂肪前体细胞，并在不同浓度的IGF-I、GH、 CLA处理后，用MTT法检测脂肪前体细胞的增殖，用油红O染色法检测脂肪前体细胞的分化聚脂程度结果表明：各剂量IGF-I和CLA均能够显著促进大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化，但GH对大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化均无明显作用。为进一步观察IGF-I和CLA对皮下脂肪组织的作用机制，试验还采用相对定量RT-PCR法检测细胞中PPARγ和C/EBPα的基因表达水平。研究发现，100ng/ml IGF-I可显著上调大鼠脂肪前体细胞中PPARγ 与C/EBPα的基因表达水平； 48ng/ml GH和100μM CLA可显著促进PPARγ的基因表达，但对C/EBPα mRNA表达无显著影响。上述结果提示IGF-I可能主要通过上调PPARγ 与C/EBPα基因的高水平表达进而促进大鼠脂肪前体细胞的分化，而CLA对脂肪前体细胞的作用在上调PPARγ的表达的同时，还作为PPARγ的配体激活该受体而发挥作用     

小麦TaDEP1基因启动子区转录增强序列的鉴定

RNAi干涉小麦TaDEP1基因导致小穗密度下降以及小穗数减少,表明该基因转录水平的降低会引起基因功能的丧失。为挖掘影响TaDEP1转录水平的作用元件,通过特异扩增D组TaDEP1基因启动子并进行测序,发现不同品种间存在132 bp序列差异,该序列位于TaDEP1基因起始密码子上游1 529~1 660 bp处。利用小麦微核心种质材料,鉴定到132 bp序列与TaDEP1基因的转录水平呈正相关,即启动子序列中含有132 bp序列的TaDEP1基因转录水平明显高于不含该序列的转录水平。启动子顺式作用元件分析结果显示,该132 bp序列未包含特殊的顺式作用元件。结合荧光素酶(LUC)活性试验,在小麦原生质体中证明该序列能够显著提高LUC的转录活性,表明该序列可作为小麦基因转录增强序列。本研究鉴定到新的小麦基因转录增强序列,为小麦分子标记辅助选择育种提供了基因资源与技术支持。     

光诱导转录因子MdMYB1对苹果果皮花青苷合成调控的表达分析

MdMYB1是调控苹果(Malus domestica)果皮着色的重要转录因子。黄绿色苹果脱袋后果面现红色,为了研究其花青苷合成表达调控机制,本研究采用Real-time PCR方法分析了光照对4种不同颜色苹果黄绿色品种金冠和陆奥、红色品种富士、深红色品种红星果皮转录因子MdMYB1表达的影响。研究表明,不同颜色苹果品种着色速度、面积和MdMYB1转录表达速度及累积量有关。通过金冠、红星苹果果实套袋处理,研究了果皮着色过程中结构基因苯丙氨酸解氨酶(MdPAL)、花青素合成酶(MdANS)、查尔酮异构酶(MdCHI)和类黄酮糖基转移酶(MdUFGT)的相对表达变化,结果表明,红星处理和对照转录因子MdMYB1及结构基因在着色过程中是持续表达的,而黄绿色品种金冠则没有出现持续表达的态势。金冠苹果转录因子MdMYB1与结构基因MdCHI表达模式相同,与MdPAL相似,经分析MdMYB1和结构基因MdCHI和MdPAL启动子序列,金冠苹果携带等位基因MdMYB1-2,其启动子区域有多个G-box光结合位点,据此推测,光照调控的光敏色素通过结合其启动子区域的G-box位点来调控转录因子MdMYB1-2;MdCHI在启动子区域含有顺式作用元件MBS,MdPAL含有顺式作用元件MBS和MBSⅡ,说明转录因子MdMYB1-2调控结构基因MdCHI表达,并有可能调控基因MdPAL或有密切相关性。结果表明,红星果皮全面着色可能与着色期转录因子及结构基因的持续表达和基因间协调表达有关;而金冠果皮在着红色过程中光诱导的转录因子MdMYB1调控的结构基因起决定性作用。     

京海黄鸡IL-6基因启动子区多态性的生物信息学分析

前炎性细胞因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)在许多慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制中起着至关重要的作用,尤其是炎症性肠病。为了从分子水平上探讨IL-6基因的表达调控,本研究以京海黄鸡(Gallus gallus)为素材,通过基因组DNA测序技术,检测IL-6基因上游-2 200 bp至下游500 bp区域中的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP),同时运用生物信息学软件预测IL-6基因核心启动子区转录因子以及CpG岛(CpG islands),分析所测SNPs以及该基因启动子区SNP突变前后转录因子和CpG岛的变化。测序结果表明,京海黄鸡中共检测到28个SNPs位点,其中位于5'调控区有19个,外显子区2个(均为同义突变),内含子区2个,3'区5个;在28个突变位点中,发现有4个为Gen Bank中未标注的SNPs,其中3个(G-357 A、C-447 G和A-663 G)位于5'调控区,1个位于3'区(C3177T)。生物信息学分析表明,有11个SNPs位于IL-6基因核心启动子区,并导致转录因子发生了改变;同时由于启动子区C-939G的突变,导致CpG岛区域由原来的3个变为2个,由此推测上述SNPs可能通过影响IL-6基因的启动子区转录因子以及甲基化区域的改变影响IL-6基因的表达调控。研究结果对进一步探讨IL-6基因的功能和作用,以及这些SNPs与鸡肠道炎症的抗性及生产性能的关系具有十分重要的意义。     

miR-196a-1在3T3-L1脂肪细胞分化中的表达及作用

为研究miR-196a-1在脂肪形成中的作用,从3T3-L1细胞基因组中扩增miR-196a-1前体序列,构建miR-196a-1的表达载体,获得稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株,成脂诱导后检测脂肪细胞分化关键转录因子的mRNA表达和脂滴累积情况。结果表明,miR-196a-1在3T3-L1细胞分化过程中表达上调,在诱导分化的第2天达到高峰,并在之后的分化过程中恢复到正常水平;稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株中miR-196a-1的持续高水平表达导致脂肪形成关键基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和脂蛋白脂酶(LPL)的mRNA水平及脂滴累积明显增加。这些结果指明,miR-196a-1促进3T3-L1脂肪细胞分化,利用所构建的稳定表达miR-196a-1的细胞株可进一步研究miR-196a-1调节脂肪形成的分子机制。     

猪FUT1基因启动子区的确定及活性分析

F18大肠杆菌(Escherichia coli F18,E.coli F18)是养猪(Susscrofa)业中发生最普遍、危害最大的病原菌之一,球系列鞘糖脂生物合成通路及通路中α-(1,2)岩藻糖转移酶1基因(alpha(1,2)fucose transferase 1,FUT1)对断奶仔猪F18抗性具有重要调控作用.本研究运用生物信息学技术挖掘课题组前期获得的断奶仔猪转录组测序结果,确定FUT1基因的转录起始位点和启动子区.同时对启动子区序列进行CpG岛分析;采用双荧光素酶报告基因以及AliBaba 2.0软件,分别分析启动子区活性和CpG岛序列潜在的转录结合位点.通过比对人类(Homo sapiens)和猪的基因序列信息数据库,结果表明,FUT1基因转录起始区域具有5种可变剪接(AS-1,AS-2,AS-3,AS-4和AS-5)和2个启动子区域(启动子1和启动子2);双荧光素酶报告基因检测结果进一步显示,FUT1基因启动子2的转录活性极显著高于启动子1的转录活性(P＜0.01),启动子2的活性是启动子1的2.75倍,根据结果可以推测启动子2在转录过程中起主导作用;CpG岛分析显示,猪FUT1基因启动子1和启动子2分别存在一个CpG岛.FUT1启动子1扩增片转录因子预测分析表明,FUT1基因启动子1存在20个潜在的转录因子结合位点,并且Sp1出现在多个转录结合位点处.本研究结果为猪FUT1基因的甲基化检测和调控机制分析提供一定的基础和依据.     

罗非鱼β-肌动蛋白基因启动子的分离及其启动子活性的初步检测

采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段（GenBank登录号：EF026001）。序列分析显示该片段包括长为1643bpβ-actin基因5＇端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bpβ-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第1个外显子和第1个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT box,TATA box和CArG box,分别位于转录起始位点上游的-92、-29和-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼（Tanichthys albonubes）的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明,在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。     

罗非鱼β-肌动蛋白基因启动子的分离及其转录启动功能检测

采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段。序列分析显示该片段包括长为1643bp的β-肌动蛋白（β-actin）基因5,端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bp的β-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT Box,TATA Box和CArG Box,分别位于转录起始位点上游的-92,-29,-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。该实验为下一步进行转自源基因尼罗罗非鱼的研究奠定了基础。