苏云金芽胞杆菌Cry1Ab毒素domainⅡ内3个loop对其毒性作用的影响

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Cry毒素domainⅡβ-折叠顶端的3个loop在靶标昆虫中肠受体识别中有重要作用,这3个loop在影响Cry毒性中起到的重要性有所不同。本研究利用能够与Cry毒素非靶标的豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)中肠氨肽酶N(amino peptidase N,APN)受体结合的短肽GBP3.1对Cry1Ab蛋白domainⅡ内3个loop分别进行替换,通过检测loop替换后3株改造蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫的毒性变化来分析3个loop在Cry1Ab毒性功能中的重要性差异。生物测定结果显示,与野生型Cry1Ab的LC50=0.88μg/m L相比,loop 1、2和3分别被替换后的Cry1Ab的LC50为12.17、32.25和23.00μg/m L。由此可见,loop 2在Cry1Ab杀虫活性中起到的作用最大,loop 3次之,loop 1对Cry1Ab毒素的毒性作用影响最小。该结论与Cry1A蛋白的三维空间结构分析相吻合,并为进一步了解Bt Cry1A毒素作用机制及其三维结构中功能域的研究提供了依据。     

利用dsRNA体外饲喂和转基因水稻饲喂抑制褐飞虱相关基因的研究

RNA干涉技术是研究昆虫基因功能的一种有效的方法.通过人工饲料喂养dsRNA(doublestranded RNA)介导RNAi(RNA interference)在包括半翅目在内的许多目昆虫中取得了成功.而通过转基因植株产生dsRNA沉默昆虫基因仅在鳞翅目和鞘翅目中有报道.本研究通过体外合成褐飞虱(Nilaparvata lugens)两个基因(α-1链微管蛋白-ds1和微管蛋白特异的伴侣分子c-ds10)部分区段的同源dsRNA,体外喂食褐飞虱若虫后导致褐飞虱体内目标基因的下降表达和死亡率的增加.本研究同时构建这两个基因的干涉载体转化水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Zhonghua 11),转基因苗喂食褐飞虱若虫后只有食用了个别转基因家系植株的褐飞虱体内目标基因的表达量有所下降,但是均没有导致虫体死亡.本研究中虽然转基因水稻未能导致褐飞虱的死亡,但是利用体外dsRNA喂食能够降低目标基因的表达量甚至导致褐飞虱的死亡,这预示着可以通过技术改进而达到培育抗褐飞虱转基因水稻的可行性,为后续转基因抗褐飞虱水稻的培育提供了依据.     

苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry3A结构域编码区的融合

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)毒素蛋白由3个不连续的结构域（domains)组成，其中结构域I为膜跨越区，与膜孔道形成有关，结构域Ⅱ，Ⅲ与受体结合有关。利用基因重组技术以鳞翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry1Aa与专一性有关的结构域编码区与对鞘翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry3A编码基因融合，构建成融合表达载体，为进一步构建Bt工程菌和Bt转基因植物奠定基础。     

棉铃虫中肠.Bt 毒素受体蛋白(APN )的分离与纯化

用Mg／EGTA方法，以不同的速度进行离心，成功地分离了棉铃虫(Bacillus thuringiensis)中肠刷状缘膜囊泡（BBMVO，BBMV中保留了大部分氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)活性，BBMV中APN的特异活性较粗匀浆液相比提高了3．29倍；CHAPS3-[(3-chlor-amidopropyl)dimethylammonio]-1-propane sulphonate可以增加BBMV的溶解，加入1％(CHAPS)之后APN特异活性增加至5．21倍；利用磷酸酰肌醇特异性的磷脂酶(PI-PLC)能将APN从膜上解离下来，BBMV经PI-PLC处理后，SDS-PAGE电泳结果仅有120kD的1条带；Mono-Q和FPLC结合的方法可以纯化部分APN，SDS-PAGE电泳结果显示，经Mono-Q柱处理后的BBMV中分子量约100kD的蛋白条带加粗；棉铃虫3个抗性品系与敏感品系相比，APN特异活性差异不显著，说明棉铃虫对Bt产生抗性与APN活性的变化无关，抗性的产生可能与Bt毒素和APN结合能力的改变有关。     

转基因水稻B2A68中抗虫蛋白Cry2Aa的表达特征和抗性分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)基因的高效表达和稳定遗传对抗虫转基因水稻(Oryza sativa)的培育和商业化生产至关重要。转基因水稻B2A68是通过农杆菌介导法把双丙氨酰磷抗性基因(biplaphos resistance gene,Bar)和Bt杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal proteins gene)Cry2Aa同时转入到恢复系D68中,培育出的抗除草剂、抗螟虫的两系早稻恢复系。本研究运用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测法研究了B2A68纯杂合基因型、不同组织及不同发育时期叶片中Cry2Aa蛋白的时空表达特征,并结合室内生测实验,揭示抗虫蛋白的表达水平、时期、部位与抗虫性的相关性。研究表明,转基因抗虫水稻B2A68纯合植株叶片中Cry2Aa蛋白表达量极显著高于杂合植株。乳熟期各器官中Cry2Aa蛋白含量为:叶片颖壳和脱壳籽粒茎秆和叶鞘(P0.05);腊熟期各器官中Cry2Aa蛋白含量为:叶片脱壳籽粒茎秆和颖壳(P0.05),但脱壳籽粒和叶鞘之间、叶鞘和茎秆之间、茎秆和颖壳之间的Cry2Aa蛋白含量差异不显著。从秧苗期到腊熟期的叶片中Cry2Aa蛋白含量表现为先升后降再升高的波动,且T_3、T_4两代波动趋势一致。二化螟幼虫(Chilo suppressalis)死亡率与乳熟期各器官中的Cry2Aa蛋白含量高度相关(r=0.837),稻纵卷叶螟幼虫(Cnaphalocrocis medinali)死亡率与各发育时期叶片中的Cry2Aa蛋白含量高度相关(r=0.988)。Cry2Aa蛋白含量较低的杂合植株叶片对稻纵卷叶螟幼虫的全部致死时间稍长,但不超过5 d。本研究结果对田间害虫的防治以及转基因水稻的育种都具有参考价值。     

小菜蛾类钙粘蛋白cDNA片段的克隆和序列分析

鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）有两类能与Cryl毒素结合的受体蛋白，一类是氨基肽酶N（APN），另一类是类钙粘蛋白（cadherin-like protein）。Gahan等（2001）报道了烟芽夜蛾中肠类钙粘蛋白基因失活导致了烟芽夜蛾（Heliothis viresce）对Bt毒素CrylA产生了高抗性，引起了各国科研人员的关注。近年来，先后有多种昆虫类钙粘蛋白基因被克隆和测序（Gahan et al．，2001：Morin et al．，2003）。     

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白

本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖 (G) 蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL株G蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9 细胞中, 分离出2 个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA) 从重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf9 细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL株感染NA 细胞的G蛋白的分子量一致。35 个抗RC HL株G蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞反应, 表明表达的G蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G蛋白主要分布在Sf 9 细胞的膜表面, 形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL株感染的NA 细胞的荧光相同。     

苏云金杆菌Cry2Ab可溶蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

苏云金杆菌Cry2Ab蛋白是一类对鳞翅目昆虫有特异性毒性作用的毒素蛋白,已广泛应用于针对鳞翅目害虫的防治之中。依据苏云金杆菌cry2Ab基因序列设计一对全长引物,从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)WB9菌株总DNA中克隆出cry2Ab基因全序列,构建Cry2Ab-PK表达载体,将获得的Cry2Ab-PK阳性克隆进行原核诱导表达,获得约90kD的Cry2Ab-GST融合蛋白,经批量纯化并切除GST标签后获得可溶Cry2Ab蛋白,约65kD。利用纯化Cry2Ab可溶蛋白免疫新西兰雄性大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备Cry2Ab兔源多克隆抗血清,通过间接ELISA法测定Cry2Ab抗血清效价超过1:150000。Western blot测定结果表明,制备的Cry2Ab兔源抗血清能特异性识别Cry2Aa及Cry2Ab抗原蛋白,不能识别Cry1Ab及Cry3Aa抗原蛋白。研究结果对深入研究Cry2A毒素蛋白作用机理及毒素与受体间互作关系提供了技术支持。     

双Bt基因提高青花菜对菜粉蝶和小菜蛾抗性

以青花菜（Brassica oleracea L.ssp.italica）下胚轴为外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）晶体毒蛋白基因Cry1Ac和Cry1C分别导入青花菜栽培品种绿彗星中,各获得35株卡那霉素抗性植株。分别以Cry1Ac和Cry1C特异引物对转基因植株进行PCR扩增,结果得到27株Cry1Ac阳性植株和13株Cry1C阳性植株。以目的基因Cry1Ac和Cry1C为探针,进行Southernblot分析,证明多数植株目的基因已经整合到青花菜基因组中。对含有单拷贝目的基因植株自交纯合后通过有性杂交获得带有Cry1Ac和Cry1C双价的转基因青花菜。利用RT-PCR检测Bt基因在转基因植株中的表达情况,发现不同株系间在RNA水平上存在显著的表达差异,部分株系中双价Bt同时得到表达。ELISA检测转基因植株Bt毒蛋白含量为0.12～0.82μg/gFW。结合室内和田间饲虫试验,证明抗虫效果与Bt毒蛋白表达水平正相关。通过多世代选择,获得高抗菜粉蝶（Pieris rapae L.）和小菜蛾（Plutella xylostella L.）的纯合转基因青花菜材料。双价抗虫基因共同作用,提高了青花菜的抗虫性。     

用合成多肽为半抗原制备Bt Cry1Ab的单克隆抗体

由于Bt Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac晶体蛋白之间具有很高的同源性(82%~90%),采用常规的单抗制备方法很难制取特异性强的Bt Cry1Ab单抗,为了制备抗Bt Cry1Ab蛋白的特异性单克隆抗体(MAB),本研究从NCBI获得了Bt Cry1Ab蛋白的氨基酸序列,根据ANTHEPORT和DNAStar软件对其抗原性、亲水性和表位性分析结果选定BtCry1Ab特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞22株。通过ELISA试验从中筛选出与Bt Cry1Ab天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株(3A10)。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1型;轻链属κ型;杂交瘤细胞株染色体数目为89~108条;用其制作的腹水对Bt Cry1Ab合成肽的反应效价为1∶1×107;对Bt Cry1Ab天然蛋白的反应效价为1∶1×104;纯化后的抗体对Bt Cry1Ab合成肽的效价为1∶1×108;对Bt Cry1Ab天然蛋白的效价为1∶2×104。抗体的相对亲和力为0.5μg/mL,对Bt Cry1Ab蛋白的最低可检测值为10ng/mL。ELISA结果显示,3A10杂交瘤细胞株所分泌的MAB能特异性识别合成肽和Bt Cry1Ab蛋白,而对同源的Cry1Ac和Cry1Aa蛋白无交叉反应;本研究所制备的Bt Cry1Ab单克隆抗体能够对常规棉和抗虫棉(Gossypium hirsutumL.)进行有效的区分,并且能特异性的识别其中的Bt Cry1Ab蛋白。     

地上和地下植食者互作对水稻氮分配及土壤活性氮的影响

植物茎叶和根系植食者虽然在空间上隔离,但二者的相互作用被认为是联系地上和地下部生态系统的基础。土壤氮素有效性通过植物影响植食者已得到大量研究的证实,但有关地上和地下部植食者互作对土壤氮素影响的研究却鲜有报道。以水稻褐飞虱和潜根线虫分别作为地上和地下的植食者,采用两因素交互试验设计,两个褐飞虱水平(未接种褐飞虱、接种褐飞虱),两个潜根线虫水平(未接种潜根线虫、接种潜根线虫),探讨二者的交互作用对水稻氮吸收和土壤活性氮(微生物生物量氮、可溶性有机氮以及铵态氮和硝态氮)的影响。结果表明,褐飞虱和潜根线虫相互抑制,二者的共存加剧了对水稻茎叶和根系生长的危害。褐飞虱未影响水稻茎叶和根系含氮量,而潜根线虫显著降低了水稻根系含氮量(p0.05)。褐飞虱和潜根线虫对土壤活性氮的影响表现出强烈的交互作用,在未接潜根线虫的处理中,褐飞虱显著提高了微生物生物量氮含量(p0.05),显著降低了硝态氮含量(p0.05);潜根线虫显著影响了微生物生物量氮含量和土壤活性氮总量。总之,褐飞虱和潜根线虫的相互抑制关系对土壤活性氮的影响格局较为复杂,相比褐飞虱,潜根线虫趋向于提高土壤活性氮水平,这可能影响与氮转化有关的土壤生态功能。     

南方水稻褐飞虱灾变分析与预警系统探讨

水稻是我国主要粮食作物,南方地区是水稻的主产区,而褐飞虱是威胁我国水稻生产的首要害虫。水稻褐飞虱灾变与很多因素有直接联系,包括气候条件、迁飞特性、水稻品种等等,建立科学的灾变预警系统具有重要的现实意义。基于此,阐述了褐飞虱的特征及其对水稻的为害情况,分析了褐飞虱灾变的原因,并对灾情预警系统进行初步探讨。     

转基因植物释放Bt毒素的土壤环境行为与生物学效应

Bt(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因是植物抗虫基因工程中应用最广泛的基因,随着大批转Bt基因作物的商品化,Bt毒素对土壤生态系统的影响已引起了人们的高度关注。本文对转基因植物释放Bt毒素的土壤环境行为与生物效应进行了综述,包括Bt毒素蛋白进入土壤的途径、在土壤中的运动、与土壤颗粒的结合与存留及其对土壤生物和土壤酶的影响。     

Cry1Ac蛋白降解菌株FJSB3的分离鉴定及降解特性

从转Cry1Ac基因水稻种植田土壤中,分离纯化得到1株能高效降解Cry1Ac蛋白的细菌FJSB3。通过表型特征、16S rDNA扩增和电镜观察,初步鉴定FJSB3为寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。FJSB3发酵液能降解粗Bt蛋白。通过单因素试验确定FJSB3降解水稻秸秆中Cry1Ac蛋白的最适条...     

煤矿中苏云金芽胞杆菌(Bt)菌株的分离及其鉴定

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种已被广泛用于农业害虫生物防治的昆虫病原细菌。本研究从永春天湖山矿区采集的159份样品中分离出1株Bt,光学显微镜检测发现菱形伴孢晶体。以cry1/7/9、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8、cry11和cry1I的通用引物对该Bt分离菌进行Cry毒素基因分析,利用SDS-PAGE和双向电泳-质谱法(2-dimensional electrophoresis/mass spectrometry,2-DE/MS)对Bt分离菌进行蛋白鉴定。结果表明,分离菌含有cry1基因型,经克隆、测序后可知,菌株中的cry1亚基因型与cry1Ac有极高的同源性。分离株表达的晶体蛋白约为130 k D,通过蛋白质谱分析表明,杀虫蛋白为Cry1Ac,与PCR-RFLP所得出的结果一致;通过质谱分析还鉴定出分子伴侣Gro EL、F0F1型ATP-β亚基合成酶、延伸因子Tu和丙酮酸脱氢酶。生物信息学分析结果表明,这些蛋白主要参与帮助新生肽的正确折叠、能源生产和转换,以及提高细胞的应激能力以抵御外界不良刺激。本研究从煤矿中分离鉴定出Bt菌,为发现新资源、新型杀虫蛋白基因以及利用微生物治理重金属污染提供基础资料。     

吡虫啉对褐飞虱DNA多态性的影响

吡虫啉在对抗水稻褐飞虱虫害中大量使用.本研究结合ISSR和AFLP分子标记技术检测吡虫啉对褐飞虱的遗传多样性影响.利用20个ISSR引物对连续施用吡虫啉的褐飞虱9个世代的19份材料扩增,共获得49个位点,其中只有1个位点出现特异性条带.利用25对AFLP引物对供试材料扩增,结果共有111个扩增位点,呈现多态性条带的位点11个.共获得59个多态性条带.其中多态性条带比例最高的是G8(10.2％),比例最低的是G1(1.69％).多态性条带比例变化趋势表明,在筛选的早期G1、G2和G3世代,褐飞虱对吡虫啉的应答较快;在筛选的中期G4、G5和G6世代,褐飞虱对吡虫啉的应答呈现较大幅度的波动,变化范围在1.69％ ～8.47％之间;在筛选的晚期G7,G8和G9世代,褐飞虱对吡虫啉的应答波动幅度较小,趋于一个相对稳定的水平,变化范围在6.78％～10.2％之间.本研究结果表明,吡虫啉的连续使用,可能会造成褐飞虱DNA的突变,从而使害虫产生抗药性.本研究结果为揭示褐飞虱抗药性产生的分子机理提供了重要信息.     

对Bt抗性和敏感亚洲玉米螟解毒酶和中肠蛋白酶的比较

比较了人工汰选的对Cry1Ab杀虫蛋白产生抗性的亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis(Guenée))种群和敏感种群幼虫解毒酶和中肠蛋白酶的变化。结果表明:抗、感种群的乙酰胆碱酯酶、中肠总蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活力差异不显著,而抗性种群的α-乙酰萘酯酶和类胰蛋白酶显著高于敏感种群。对类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和类弹性蛋白酶的活力杂交分析结果表明,抗性种群的类胰蛋白酶酶谱强于敏感种群,但抗、感种群中肠液在体外对Cry1Ab原毒素的酶解过程并不存在差异。推断强碱性类胰蛋白酶可能与亚洲玉米螟对Bt抗性产生机理有关。     

福建省转基因抗虫稻田节肢动物群落多样性研究

试验研究转MH86^CpTI基因抗虫水稻和转MH86^CpTI＋Bt双价基因抗虫水稻稻田节肢动物群落的多样性，结果表明：转基因稻田节肢动物群落可分为先锋群落、郁闭未稳定群落和郁闭稳定群落3个阶段；在水稻灌浆期到蜡熟期，转基因水稻稽田中每次采得的节肢动物的物种数为CK〉MH86^CpTI〉MH86^CpTI＋Bt，个体数量大小为CK〉MH86^CpTI〉MH86^CpTI＋Bt，总体多样性指数与均匀性指数均为CK〉MH86^CpTI〉MH86^CpT＋Bt；转基因水稻稻田节肢动物群落的多样性与常规稻相比未见明显差异。在水稻生育前期与后期，转基因抗虫水稻田害虫优势度最高的分别为电光叶蝉和褐飞虱。     

CrylAb敏感和抗性亚洲玉米螟氨肽酶N基因的克隆及序列差异分析

研究亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)对Cry1Ab产生抗性的分子机理,对今后制定和实施合理的抗性治理策略具有重要的意义。本研究通过PCR方法克隆和测序,鉴定了Cry1Ab敏感-抗性亚洲玉米螟幼虫中肠氨肽酶N(APN)基因家族的一个成员Ofapn3,其cDNA全序列长3591bp,开放阅读框包括3045bp,编码1014个氨基酸。预测蛋白质分子量为115.1kD,等电点(pI)为4.44。其推导的氨基酸序列中具有鳞翅目昆虫氨肽酶典型结构特征,即N-末端具有18个氨基酸的剪切信号肽,谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN,锌结合位点HEXXHX18E,C-末端具有22个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。系统分类归为第3支系。与欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的Onapn3(GenBank登录号:ABL01483)同源性为96.6%。与Cry1Ab敏感亚洲玉米螟cDNA相比,抗性品系的开放阅读框中有40个碱基发生了点突变,导致氨基酸序列中有10个氨基酸改变。其中Ser735在抗性品系中突变为Pro的现象在抗性棉铃虫APN3的氨基酸突变中也被检测到。鉴定的Cry1Ab敏感和抗...     

水稻品种资源抗稻褐飞虱不同生物型和稻瘿蚊核心样品的综合评价

应用灰色关联度分析法对水稻品种资源抗稻褐飞虱不同生物型和稻瘿蚊中国Ⅳ型的核心样品进行综合评价。研究结果表明,在抗稻褐飞虱生物型Ⅱ、中抗稻褐飞虱生物型Ⅱ、抗稻褐飞虱盂加拉型、抗稻瘿蚊中国Ⅳ型的核心样品中,分别以IR29692—99—3—2—1、IR36、RP1579—1862—72—31—52、DUO KANG No．1与标准品种(粤香占)的关联度最大,在抗虫育种亲本选择时,可以作为首选抗源。