复配粉中马铃薯成分实时荧光PCR检测方法的建立

为了对马铃薯食品进行有效的鉴别,本研究参照马铃薯龙葵素鼠李糖基转移酶基因的部分序列,设计了马铃薯的特异性引物Sgt3,建立了食品中马铃薯成分的PCR检测方法,并研究了加热过程中其基因的降解情况。通过对比4对引物StLs、scuF、UGPase、Sgt3在荧光定量PCR试验中的扩增效果,最终确定引物Sgt3可以特异性扩增马铃薯DNA,且能得到线性关系显著的标准曲线。结果表明,采用实时荧光PCR方法,马铃薯质量浓度低至2%时仍呈阳性反应;对于马铃薯熟全粉-小麦粉复配粉,得到R~2=0.9834的线性方程,马铃薯熟全粉含量为50%的待测样品检测结果为50.75%;对于马铃薯生全粉-小麦粉复配粉,得到R~2=0.9945的线性方程,马铃薯生全粉含量为45%的待测样品检测结果为44.42%;将马铃薯生粉100℃加热10 h以上,DNA会严重降解,不利于PCR检测。本研究通过荧光定量PCR技术可以实现马铃薯成分的鉴别,对于成分单一且已知的样品,可以实现量化分析,该方法的建立为马铃薯主食产品品质监管提供了一定的技术支持。     

进口饲料中牛、羊源成分的PCR同时检测方法

为防止疯牛病和痒病的传入，研究提供了一种利用Chelex-100快速提取动物基因组DNA的方法，并依据牛、羊线粒体基因的同源性序列片段，设计1对通用引物，通过PCR扩增，实现了对进境饲料中牛、羊源成分的同时检测。该方法简单、快捷，在口岸检疫部门中有一定的推广价值。     

三种对虾病毒多重实时荧光PCR检测方法的建立

根据基因库中白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）和桃拉综合征病毒（TSV）的基因序列,设计了WSSV 、IHHNV和TSV的三对特异性引物和三条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测WSSV 、IHHNV和TSV的三重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对WSSV 、IHHNV和TSV的检测敏感性分别达到20000、20和20000个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对WSSV 、IHHNV和TSV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这三个病毒。对保存的45份经常规PCR检测仅为WSSV 、IHHNV和TSV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中2份为WSSV和IHHNV混合感染。本研究建立的三重实时荧光PCR方法用于WSSV、IHHNV和TSV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。     

牛Toll样受体实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立检测牛Toll样受体(TLRs)mRNA表达水平的SYBR GreenI实时荧光定量PCR方法.根据GenBank中BoTLR-2、3、4、5、7、8和10的基因序列,在其保守区设计并合成各自特异性引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶基因(GAPDH)为内参,建立实时荧光定量PCR方法.结果表明,在1×102～1×109 copies/μL范围内,BoTLRs和GAPDH基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991.溶解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的灵敏度和特异性.重复性结果表明,TLRs和GAPDH基因阳性质粒,最小检出浓度达到100和10 copies/μL,组内、组间变异系数值均保持在3.5%以内.临床样品检测结果表明,TLR3和TLR8 mRNA水平在诱导培养早期较高,在4 h达到高峰,而TLR4和TLR7水平与之相反,在诱导培养后期较高,在24 h达到高峰,表明本研究所建立的检测方法成功用于临床样品的检测,为在mRNA水平对BoTLRs的定量分析提供技术平台.     

鲢微卫星标记的荧光多重PCR体系建立及其应用

为了提高鲢微卫星(SSR)分型效率,本研究从已开发 SSR 标记中筛选出 14 对具有高多态性和扩增稳定性的SSR 引物,并组成一个四重 PCR(A)和两个五重 PCR(B 和 C)。以单对引物 PCR 为对照,对多重 PCR 的条件进行优化,包括退火温度、Taq DNA 聚合酶浓度、dNTPs 浓度、Mg2+浓度、PCR Buffer 使用量等。优化结果为,各体系最佳退火温度时,25 μL体系中包括 2 U Taq DNA 聚合酶,0.4 mmol/LdNTPs,2.3 mmol/L Mg2+,以及 3 μL的 10×PCR Buffer。优化后的多重 PCR 扩增稳定,各对引物扩增良好,SSR分型效率显著提高。利用建立的多重 PCR 体系对采自石首老河四大家鱼原种场和监利老江河四大家鱼原种场各 100 尾鲢(Hypophthalmichthys molitrix)样本进行 SSR 分析。结果显示,石首和监利两个原种场的样本都保持有较高的遗传多样性,其中观测杂合度分别是 0.8479 和 0.9443,期望杂合度分别为0.7967 和 0.8134。群体间分子方差分析(AMOVA)FST=0.00613,说明两个原种场鲢群体间没有发生遗传分化。本研究最终建立了三个准确、稳定的荧光标记多重 PCR 体系,具有较大应用价值。运用建立好的 3 个荧光标记多重PCR 对 2 个鲢群体进行遗传多样性分析,结果为两处原种场的进一步科学管理提供了可靠依据。     

猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要: 根据GenBank已登录的猪附红细胞体（M.suis）推测的功能性蛋白基因ORF2序列设计引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含M.suis部分ORF2基因的T载体重组质粒（pGEX-T/M.suis）为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了M.suis的TaqMan荧光定量PCR检测方法（Taqman FQ-PCR）;对所建立的FQ-PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似M.suis感染临床抗凝全血样品进行了检测应用。结果显示：标准曲线的曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;所建立的FQ-PCR方法检测灵敏度可达10个拷贝/μL,比对照常规PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T/M.suis重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对8个对照细菌、病毒和寄生虫DNA扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEX-T/M.suis重组质粒分别重复扩增2次,重复结果良好;用该方法对24份临床疑似M.suis感染样品进行了应用检测,结果有20份样品为阳性,阳性检出率高于常规PCR方法。     

IGF2荧光定量PCR方法建立及其在中外猪胚胎骨骼肌中的表达

胰岛素样生长因子2（IGF2）基因对骨骼肌的生长发育起着非常重要的调控作用。实验建立了猪IGF2基因的SYBR-Green荧光定量PCR方法,并利用此方法分析该基因在通城猪（脂肪型）和长白猪（瘦肉型）妊娠33、65和90d胚胎骨骼肌中的表达。结果表明,建立的SYBR-Green荧光定量方法可以有效地用于IGF2的表达分析。IGF2基因在两品种中都以妊娠65d时表达水平最高,呈波浪式表达模式。在所研究的3个胚胎时期,IGF2的表达在通城猪中均高于长白猪。     

实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立

建立了一种检测Ⅱ型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2)的实时荧光PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)方法。用Primer Express2.0和Oligo6.0设计针对Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原基因簇中cps2I基因的引物和Taqman荧光探针。通过常规PCR方法扩增得到81 bp DNA片段，克隆到pMD18-T载体，测序表明得到的序列为目的基因片段。在Lightcycler荧光PCR仪上对Ⅱ型猪链球菌的扩增曲线表明，该实时荧光PCR具有良好的特异性，可成功地扩增Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌(S.suis)、大肠杆菌(Escherichia coli )、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、志贺氏菌(Shigella)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytoge)和空白对照都是阴性；该检测方法可达到检测10个细菌的灵敏度，反应过程仅需30 min完成；在两个不同时间检测同一浓度的菌液，每次做20个重复，2次检测所得的Ct (threshold，阈循环)值之间无统计学差异(P > 0.05)，方法稳定性好。该实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法可用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

狂犬病病毒为不分节段单链负股的RNA病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属。世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%。本研究根据GenBank中的狂犬病病毒M基因序列,选择保守区域设计引物,通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量PCR方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及初步应用

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)属单股DNA的圆环病毒科.根据致病性及基因组序列,PCV可分两种血清型,即PCV-1和PCV-2.     

乳制品中水牛乳成分的实时荧光PCR检测技术

水牛奶制品因其良好的营养功效备受国内外消费者的青睐,而在国内外,乳制品掺假行为,却常有发生.我国作为水牛奶酪等乳制品的进口国,迫切需要一种准确的水牛成分的检测方法,来避免这种掺假行为对我国的进出口贸易造成损失.根据水牛Bubalus bubalus)线粒体细胞色素b(Cytb)基因的保守序列,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了水牛乳成分的实时荧光PCR检测方法.运用实时荧光PCR方法对5种乳水牛样品和47种常见的非水牛动植物样品进行检测,5种水牛乳样品均产生荧光信号,其余非水牛样品均不产生荧光信号,表明该检测方法具有特异性.该检测方法的重量检测灵敏度为0.01％水牛奶(W/W),DNA浓度检测灵敏度为0.001 ng/μL水牛DNA.对市售的水牛奶制品进行实际样品检测,结果表明,该方法能很好地检出水牛乳成分.本研究表明,该方法具有特异性好、灵敏度高的优点,可作为乳制品中水牛乳成分鉴别检测的有效方法.     

柑桔黄龙病病原16S rDNA克隆、测序及实时荧光PCR检测方法的建立

克隆并测定了中国柑桔黄龙病病原16SrDNA基因序列，经同源性比较，表明属于柑桔黄龙病菌(Liberobacter asiaticum)亚洲种中一个新株系(中国厦门株系)。依据获得的16SrDNA特异序列，建立了柑桔黄龙病病菌检测的实时荧光PCR方法，并应用此方法对柑桔样品进行了检测。结果显示，该检测方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点。该方法为柑桔黄龙病的检测，特别是早期诊断、检疫和病害的综合治理奠定了基础。     

抗白粉病糯性小麦的多重PCR分子鉴定技术

为同时鉴定小麦糯性和白粉病抗性,本研究利用已知3对引物建立多重PCR体系,分别扩增WxA1、Wx-B1、Wx-D1和Pm21基因的分子标记,其目的片段大小分别为:230/265、854、204和1400 bp。经过对供试品种和部分F2分离群体的Wx蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,其结果与多重PCR结果一致,证明该多重PCR体系准确可靠,可提高小麦糯性兼抗白粉病的选育效率。     

乳制品中金黄色葡萄球菌PCR快速检测方法的建立

为快速检测乳制品中的金黄色葡萄球菌,本研究将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆固定在滤纸片上以去除PCR反应抑制因子,并以Nuc为靶基因,建立一种无需样品前增菌的PCR快速检测方法,同时确定该方法的特异性、灵敏度和实用性,并评估该方法所用试剂在冷冻保存条件下的稳定性与实用性。结果表明,该PCR快速检测方法在检测97株目标菌及83株非目标菌后未出现假阳性或假阴性结果;该方法无需增菌处理,可在4 h内完成检测,检测限为10¹ CFU·25 g^-1或10¹ CFU·25 mL^-1;该方法与传统检测方法在实际乳制品样品中金黄色葡萄球菌的检出率及活菌检测率均一致(符合率100%);此外,该检测方法所用试剂在-20℃冷冻条件下可稳定保存至少12个月。综上所述,本研究建立的PCR快速检测方法特异性强、灵敏度高,且实用性良好,能有效去除样品基质中的PCR反应抑制因子,为乳制品中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了参考依据。     

实时荧光定量PCR检测胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及应用

研究建立检测胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的实时荧光定量PCR方法,并运用建立的检测方法对临床病料进行应用检测.根据GenBank报道的胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因3'端391 bp核苷酸保守序列,设计1对特异引物扩增117 bp核苷酸片段,建立检测APP的实时荧光定量PCR方法和标准曲线,并利用该方法对收集肺脏组织和人工感染组织材料进行APP核酸定量检测.结果表明,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好敏感性、特异性、重复性和临床应用性.该方法的建立为APP的临床高效诊断和APP感染的发生、发展和转归研究提供了一种有效手段.     

肉鸡热休克蛋白70 mRNA荧光定量PCR方法的建立和优化

对适应性饲养到30日龄时的60只肉鸡进行热应激处理,通过热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)mRNA荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)方法检测热应激处理肉鸡组织中HSP70mRNA含量。虽然受试鸡肝脏和心脏的HSP70mRNA水平在热应激6h时略低于对照组(P>0.05),但随持续性高温应激时间的延长,HSP70mRNA水平逐渐升高,热应激18h时应激肉鸡肝脏和心脏HSP70mRNA水平达最高水平,明显高于对照组(P<0.01)。实验选用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)作为内参照,体外转录的RNA和阳性质粒作为两种标准品。结果显示,实验所建立和优化的FQ-PCR反应体系是理想的。     

洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系的建立

唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型(Burkholderia gladioli pv.alliicola),是重要的植物病原细菌检疫性有害生物.本研究的目的是建立特异、灵敏、快速的TaqMan探针荧光定量PCR方法用于检测洋葱腐烂病菌(B.gladioli pv.alliicola).利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计和筛选特异性引物和TaqMan探针,优化PCR反应体系和反应条件.荧光定量PCR菌液检测灵敏度达到1.02×102 CFU/mL,DNA检测灵敏度达到1.73×10-4 ng/μL,反应时间仅需1h左右,对14种伯克氏菌属Burkholderia)参比菌种的特异性检测结果显示,洋葱腐烂病菌具有明显的扩增曲线生长,表明建立的荧光定量PCR体系具有非常高的特异性.同时对洋葱(Allium cepa)种子进行了模拟带菌检测,结果表明,建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够检出模拟样品中的洋葱腐烂病菌,验证了检测体系的实用性.本研究建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够有效用于洋葱腐烂病菌的鉴定,为进出口口岸和基层检验检疫部门提供了一种简便、快速、准确的洋葱腐烂病菌分子检测手段.     

蜂蜜中转基因成分的PCR检测

我国是蜂蜜生产大国,棉花是主要蜜源植物之一。近些年来,我国种植的棉花大多为转基因抗虫棉,棉花蜜中是否含有转基因成分,引起国内外广大消费者的密切关注。本文以抗虫棉种植地采取的棉花蜜为原料,采用改良CTAB法,在DNA提取过程中,用PBS缓冲液除去其中大部分的可溶性多糖,并提高CTAB提取缓冲液中NaCl浓度以去除残余多糖,从蜂蜜中成功提取出片段完整、纯度较高的DNA,DNA得率为486ng/mL,OD260/OD280为2.01,能够满足后续PCR定性检测的需求。从以转基因棉花为蜜源的蜂蜜中检测出外源DNA片段,建立了蜂蜜中转基因成分的PCR检测技术。本研究对转基因食品标识制度的完善、转基因食品监管、减少贸易摩擦以及保证消费者权益等具有重要意义。     

稻瘟病菌交配型PCR鉴定体系的建立

交配型分析可以用来评价真菌的群体遗传多样性。根据稻瘟病菌(Magnaporthe grisea）交配型基因MAT1-1和MAT1-2全序列设计2对特异引物，并摸索了适宜的PCR反应条件，即95℃变性5min，接着94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸7min，建立了稻瘟病菌交配型PCR鉴定体系。以10个已知交配型的标准菌株基因组DNA为模板，结果PCR测得的交配型与其已知的交配型一致。进一步用采自福建田间的150个稻瘟病菌菌株与GUY11／KA3对峙培养，并以PCR方法测定其交配型，结果123个可育菌株中用两种方法所测交配型95．1％相吻合，而27个不育菌株经PCR检测交配型为MAT1-1的菌株有7个，交配型为MAT1-2的菌株有20个。说明PCR方法可较准确地检测稻瘟病菌菌株的交配型，特别是可以测不育菌株的交配型。