烟草染色体倍性快速鉴定方法

摘要: 对两个杂交组合(G28 × NC2326和K326 × Coker176) F1烟草 (Nicotiana tabacum) 花药培养诱导出763个不同倍性植株。基于植株的花和种子结实率常规鉴定倍性水平比较，用气孔保卫细胞叶绿体数目预测植株倍性准确率达93.52%。表明采用气孔保卫细胞叶绿体计数法可以在苗期快速、准确地确定植株染色体倍性。同时, 在移栽前间接地鉴定、筛选出叶绿体数<14的单倍体苗，作进一步秋水仙碱加倍处理，以减少对单倍体材料的浪费，加快DH群体构建速度。     

快速测定猕猴桃属倍性水平的流式细胞计数法

本项研究旨在采用流式细胞计数法测定猕猴桃属的倍性水平，与其他方法（染色体计数法和气孔长度鉴别法）相比，流式细胞计数法测定倍性水平较快较简易，在从美味猕猴桃“结果雄”蔓上采集种子进行离体培养所获的植株中，用该法检测结果表明存在高倍性水平的单株，其倍数可高达９倍，一般而言，这些单株的特点是活力弱，幼年期特别长，过去并不知道会有如此高倍性水平的植株，在品种培育上，这种植株看来并无任何潜力。     

组培枣苗基因组DNA提取方法及其含量的比较

本文以组培二倍体木枣、四倍体变异苗和二倍体京枣苗为供试材料,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测技术,研究了不同提取方法对其叶片基因组DNA的提取效果。结果表明,CTAB法提取枣叶片DNA的效果优于SDS法,表现为蛋白质杂质干扰少,DNA结构完整、纯度与得率高;用不同方法提取的样液中DNA片段的大小和分布是不同的,以改进的CTAB法提取的样液中大片段的DNA分子较多,所以在其底部分布较多,而用SDS法提取的样液中小片段的DNA分子较多,故在其上部分布较多;电泳时不同的加样量获得的DNA带也有较大差异,试验选出CTAB法提取样液的适宜的加样量为5μL（7.485μg）,SDS法提取样液的适宜的加样量为4μL（5.988μg）;枣品种间DNA的含量明显不同,木枣四倍体的DNA含量（3.074μg/μL）相当于组培木枣二倍体（1.497μg/μL）的2倍,也明显地高于京枣二倍体（2.182μg/μL）。这些结果为枣树遗传种质资源的研究奠定了一定的科学与技术基础。     

60Coγ对春兰根状茎染色体倍性及相关酶活性的影响

本试验以春兰茎尖诱导的根状茎为材料,用60Coγ急性辐照后,研究比较了辐照对诱芽情况、染色体倍性及细胞色素氧化酶（COD）、过氧化物酶（POD）、淀粉酶（AMY）、酯酶（EST）酶活性的影响。结果显示：（1）大于10Gy的γ射线辐照抑制了根状茎的芽诱导及增殖;（2）低剂量辐照（≤7 Gy）处理的部分根状茎出现超二倍体现象,高剂量辐照（≥10 Gy）处理则均出现亚二倍体现象;（3）处理根状茎中的EST酶活性均高于对照,POD和AMY活性在低剂量（≤7 Gy）时高于对照,而COD酶活性在高剂量（≥10 Gy）时高于对照。研究表明,7-10 Gy为临界剂量,可作为春兰根状茎辐照诱变的适宜剂量。     

基于PCR-SSR的棉花外源染色体片段快速检测方法的建立与应用

外源染色体片段或基因的准确鉴定对作物遗传改良具有重要的作用。尽管分子标记已被广泛应用到外源染色体片段或基因的检测上,但是对于大群体中少数几个阳性植株的鉴定,逐个检测的效率极低。本研究以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)新陆早48号与海岛棉(G.barbadense)染色体片段置换系CSSL-122的BC2F1群体147单株DNA样本为材料,通过构建二维矩阵排列DNA样本材料,分别对待测样本按行、列进行混合,获得m个行的混合样本和n个列的混合样本;以m=n=8矩阵为例,对待检m×n=64个样本行列混合获得16个混合样本并进行检测,根据检测结果在矩阵中推断确定含有外源染色体片段的阳性样本。结果表明,利用基于PCR-SSR技术构建矩阵混合池的检测方法,可以快速检测陆地棉背景中外源海岛棉染色体片段,逐个样本检测验证了其方法的准确性;统计学分析表明,阳性样本出现频率低于7.81%时,检测样本的节本率可保持在50%以上。基于PCR-SSR技术构建矩阵混合池检测方法的建立,为棉花外源染色体片段快速高效鉴定提供了新方法。     

~(60)Co γ射线对春兰根状茎染色体倍性及相关酶活性的影响

以春兰茎尖诱导的根状茎为材料,用~(60)Co γ急性辐照后,研究比较了辐照对诱芽情况、染色体倍性及细胞色素氧化酶(COD)、过氧化物酶(POD)、淀粉酶(AMY)、酯酶(EST)酶活性的影响.结果显示:(1)大于10 Gy的γ射线辐照抑制了根状茎的芽诱导及增殖;(2)低剂量辐照(≤7 Gy)处理的部分根状茎出现超二倍体现象,高剂量辐照(≥10 Gy)处理则均出现亚二倍体现象;(3)处理根状茎中的EST酶活性均高于对照,POD和AMY活性在低剂量(≤7 Gy)时高于对照,而COD酶活性在高剂量(≥10 Gy)时高于对照.研究表明,7～10 Gy为临界剂量,可作为春兰根状茎辐照诱变的适宜剂量.     

簇毛麦5V染色体特异性ISSR标记的建立和应用*

摘要：为建立簇毛麦特定染色体上的特异性ISSR标记，以二倍体簇毛麦、小麦中国春等为材料，对96条ISSR引物进行PCR筛选，发现引物UBC848可在二倍体簇毛麦中扩出一条长388bp的特异性片段(命名为pDv848/388)，而中国春等小麦均未扩出该片段。进而利用UBC848对小麦近缘种偏凸山羊草等进行扩增，发现它们均未扩出该片段。用一套中国春-二倍体簇毛麦附加系CSDA1V~CSDA7V对目标片段进行染色体定位，将目标片段确定在二倍体簇毛麦5V染色体上。进一步用UBC848对多年生簇毛麦、小麦-簇毛麦双二倍体、部分双二倍体及其衍生后代进行扩增，发现它们均能扩出目标片段，这表明，在小麦染色体工程育种中， pDv848/388可作为簇毛麦5V染色体上的一个特异性ISSR标记，用于快速跟踪检测簇毛麦遗传物质向栽培小麦中的导入。     

小麦染色体显微切割和微克隆方法的建立及HMW—GS1Dx5亚基基因克隆

在Ｃ－分带识别普通小麦钢８２－１２２染色体长臂的基础上，通过染色体显微切割和微克隆技术切割１Ｄ染色体，并通过ＰＣＲ扩增得到高分子量麦谷蛋白１Ｄｘ５亚基基因片段，序列分析证明其正确性。这一方法的建立为获得新基因特异性探针打下基础。     

鉴定水稻花培再生植株倍性水平的方法

测量了水稻花培再生植株的花序长度，植株高度和颖长，发现只有颖长可以将再生植株明显分成３９在。细胞深安颖长划分的３类植株分别为单倍体、二倍体和三倍体。由辐照愈伤细胞再生的植株也获得相似结果。辐照虽会引起生理失调，但以颖长作为水稻植株倍性水平的指标较为可靠。     

区域生态平衡施肥模型建立方法和应用

本文根据生态平衡施肥模型和区域肥料田间试验数据确立了区域生态平衡施肥模型的建立方法 ,从而在现有施肥参数和生态平衡施肥参数之间架起了信息交换的桥梁 ;根据土壤有效养分测定值和地块属性建立了地块施肥模型 ,实现了区域施肥模型与地块施肥模型的转换 ,具有肥料效应函数模型和测土施肥模型双重功能。     

新发PDCoV和TGEV双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的冠状病毒,临床上主要引起感染仔猪出现水样腹泻、呕吐和脱水等症状,和猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染引起的临床症状极为类似,且临床上PDCoV和TGEV混合感染时有发生,单靠临床诊断很难区分两种疾病,因此建立同时检测且区分PDCoV和TGEV的检测方法具有重要的临床意义.本研究根据GenBank中收录的PDCoVN基因和TGEVN基因序列设计了2对引物,在同一反应体系中同时扩增PDCoV的N基因片段和TGEV的N基因片段,通过对RT-PCR反应条件的优化,建立了同时检测PDCoV和TGEV的双重RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、灵敏性和重复性研究.结果显示,所建立的双重RT-PCR对PDCoV和TGEV的最低检测量分别是3.14×102 copies/μL和3.68× 103 copies/μL,利用该双重RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪博卡病毒(Porcinebocavirus,PBoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病毒(P.pseudorabiesvirus,PRV)的扩增结果均为阴性,显示出较好的特异性.为了解所建立的双重RT-PCR方法的临床应用效果,对252份临床样品进行了检测.结果表明,双重RT-PCR检出PDCoV阳性样品31份(阳性率为12.30％),TGEV阳性样品12份(阳性率为4.76％),同时感染PDCoV和TGEV的阳性样品2份(阳性率为0.79％),且检测结果与单一PDCoV和TGEV RT-PCR相符.因此,本研究所建立的双重RT-PCR方法可用于PDCoV和TGEV的临床检测,为进一步研究PDCoV和TGEV的临床鉴别诊断和流行病学调查提供了理论依据和技术支持.     

文心兰体细胞无性系变异的倍性检测和CE-AFLP分析

为探讨文心兰体细胞无性系变异的特征,分别利用流式细胞术和毛细管电泳-AFLP(CE-AFLP)技术,对10份文心兰体细胞无性系条纹突变体(N1~N10)进行倍性分析和遗传多样性检测。结果表明,10份突变体均为二倍体,未发生染色体倍性的改变。28对引物组合在突变体(N1~N10)和正常植株(CK)中共扩增出596条大小为100~1 000 bp的条带,其中多态性条带192条,总多态性位点比率为32.2%,不同突变体相对于正常植株的变异频率在12.3%~19.9%之间;突变体与正常植株的遗传相似系数在0.8132~0.8838之间,相似系数为0.85时,突变体N1、N5、N7、N9、N4、N2与CK聚成Ⅰ类,突变体N3、N6、N8和N10聚成Ⅱ类。10份突变体与叶色正常植株相比存在遗传差异,说明其在DNA水平发生了不同程度的变异。本研究结果为创造基于体细胞无性系变异的兰花新种质提供了参考。     

猪Ⅱ型圆环病毒检测方法的建立及应用

根据GenBank上已发表的Ⅱ型猪圆环病毒（PCV-2）的基因序列，设计并合成1对能特异性扩增Ⅱ型猪圆环病毒（Porcine circovims）的引物，建立了PCR方法检测PCV-2并研制出试剂盒。然后对试剂盒的敏感性、特异性和有效期进行了研究。结果表明，该试剂盒只能扩增出PCV-2，具有很好的特异性。PCR方法可检测出0．5pg的模板DNA。试剂盒经过反复冻融后，不影响其检测效果。有效期在一20℃至少可以保存1年。     

不同保存方法和提取方法对扁桃基因组DNA质量的影响

以扁桃（Amygdalus conmmuis L.）幼叶为试材,通过7种保存方法并采用改良2×CTAB法、3×CTAB法和SDS法对其DNA进行提取,用琼脂糖凝胶电泳检测其DNA完整性,分光光度计测其产量和纯度,以探讨不同保存方法和不同提取方法对扁桃DNA提取质量的影响。结果表明,扁桃新鲜幼叶、压干幼叶后在-75℃保存、45℃烘干幼叶后在-75℃保存以及硅胶干燥幼叶后在-75℃保存三个月均可以用三种提取方法可获得完整的DNA,纯度和产量均高,其保存和提取方法简便易行且获得高质量DNA。扁桃鲜叶直接放在-20℃保存比-75℃保存更易获得DNA,而压干后的扁桃叶片-20℃保存三个月并采用SDS法提取,获得高产量、高纯度的DNA,不影响提取效果。SDS法和改良3×CTAB法均可获得扁桃DNA,但SDS法优于3×CTAB法,其操作简单、耗时少;改良2×CTAB法提取扁桃成功率较低,不稳定,产量比其它两种方法低。     

黑籽南瓜基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建及分析

黑籽南瓜(Cucurb ita ficifolia)具有很强的抗逆能力,对低温、干旱、贫瘠土壤以及瓜类枯萎病等逆境均具有较强的抗性,这些优良的抗性基因很难通过有性杂交转移到其它瓜类作物上,但可通过可转化人工染色体(TAC)以大片段的形式转化到其它瓜类作物中.本研究利用TAC载体构建了黑籽南瓜基因组DNA文库,该文库包含57 560个克隆,保存在150块384孔板中,其库容量相当于黑籽南瓜基因组的7倍.TAC文库克隆插入片段大小分布范围为20～100 kb,超过40 kb插入片段克隆占40％以上,插入片段平均大小为45kb.在挑取的15个TAC克隆中无空克隆;细菌继代培养30、60和100代后质粒的酶切鉴定表明,TAC克隆可以在大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10B中稳定复制和保存,说明本研究构建的文库质量较高.该研究结果表明,TAC文库为黑籽南瓜抗性基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和基因组测序等有关研究提供了基础资料.     

不同倍性小麦材料对水分和密度条件的响应

以栽培一粒(2n)、栽培二粒(4n)和长武134(6n)为材料在大型活动防雨棚条件下研究不同倍性小麦材料在不同密度和水分条件下的产量适应性变化.结果发现,在两种水分条件下随着染色体倍性从2n→6n的增加,产量、千粒重、水分利用效率(WUE)和收获指数均呈增加趋势,在水分胁迫下各材料穗粒数和穗数则呈降低趋势,而在正常供水下穗粒数则呈增加趋势.在水分胁迫下栽培一粒、栽培二粒和长武134最高产量分别出现在中、低、高密度群体,而同一材料不同密度群体间变异系数分别为6.73%,1.98%,9.07%;不同倍性材料千粒重均随着密度增加而减小,而穗数则逐渐增加,二倍体的穗粒数以中密度最高,四倍体的穗粒数随着群体密度的增加而减小,六倍体则相反;三种材料WUE和收获指数分别以低、高、低密度最高.正常供水下随着染色体倍性从2n→6n的增加,三个倍性材料最高产量分别出现在高、低、低密度群体,而同一材料不同密度群体间变异系数分别为6.01%,17.12%,2.46%;千粒重表现为中密度>低密度>高密度,而穗粒数均以低密度群体最高,二倍体和四倍体以高密度群体最低,六倍体则以中密度群体最低,穗数则随着密度群体增加而增加;二倍体WUE以高密度群体最大,中密度最小,四倍体和六倍体随着群体密度的增加而逐渐减小,二倍体收获指数以低密度最高,中密度最低,四倍体和六倍体表现为低密度>中密度>高密度.上述研究结果为干旱半干旱地区小麦节水高产栽培和育种提供了理论依据.     

兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

摘要:按照GenBank上公布的兔出血症病毒（RHDV）基因序列设计一对引物，以RHDV发病兔的新鲜肝为材料，提取总RNA，进行cDNA的合成和PCR扩增，结果能扩增出与预期的269bp大小一致的片段，该产物序列与公布的RHDV基因序列有95.8%～98.5%的同源性，表明已成功建立了RHDV RT-PCR检测方法。用该方法和血凝实验（HA）对兔出血症发病兔各组织脏器进行检测，结果表明，发病死亡兔各脏器中，HA检测阳性的病料为肝脏、肾脏、脾脏、血液、肺；RT-PCR检测除粪便外，其它均为阳性，其敏感性是HA的4×104倍。RT-PCR方法检测RHDV敏感度高、特异性强、重复性好，不仅可用于RHD临床诊断和流行病学调查，而且在兔肉等兔类产品的检疫方面具有很好的应用前景。     

CPA-核酸试纸条检测鸭肉源性成分方法的建立和优化

为建立简单、有效的动物源性成分定性检测方法,根据交叉引物恒温扩增技术(CPA)原理,以鸭属线粒体D-loop基因序列设计引物和探针,优化反应体系与恒温扩增条件,并配合核酸试纸条显色,建立鸭肉源性成分的快速检测方法。结果表明,建立的鸭D-loop基因CPA扩增体系中交叉引物、内引物、外引物分别为0.6、0.3、0.1μmol·L-1,Mg SO4为8 mmol·L-1。在63℃、60min恒温扩增条件下,单一鸭源性DNA成分检出限为0.1 ng·μL-1,对混合肉制品中鸭肉成分的检出比例为1%(相当于1ng·μL-1)。本研究建立的鸭源性成分检测方法为肉制品掺假鉴定提供了有效的手段。     

菜苔小孢子培养及再生植株的倍性鉴定*

以早熟菜苔(Brassica rapa ssp．parachinensis)品种油青四九为供体材料，研究了更新培养液和秋水仙碱分别直接处理分离的菜苔小孢子对胚发生频率的影响。分离小孢子先用NLN-17培养液32℃热激培养2d，换成NLN-10培养液后在24℃继续培养，比不换培养液直接用NLN-10培养液处理的胚状体产量明显提高，更新培养液并能改善胚状体质量。用秋水仙碱0．8mg／L直接处理分离小孢子能明显增加胚状体产量，秋水仙碱浓度过高不利出胚和胚状体萌发。流式细胞仪(FCM)鉴定菜苔小孢子再生植株的染色体倍性表明，有较高的自发二倍体率(70％)和四倍体率(8％)，而其它多倍体和混倍体比率相对较少。