利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术快速鉴定两个马铃薯晚疫病抗性相关EST片段EL732276和EL732318的功能

马铃薯晚疫病是由致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)deBary]引起的第一大作物病害,目前已严重限制了全球马铃薯的生产和发展。马铃薯晚疫病抗性分子机理的研究一直是抗病育种中的热点问题。本研究利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,在本氏烟草(Nicotina benthamiana)中沉默两个马铃薯晚疫病水平抗性相关的基因片段EL732276和EL732318。目的基因沉默后的烟草接种晚疫病菌P.infestans,根据病斑生长速率LGR(length grow rate)来了解这两个基因是否参与烟草对晚疫病的抗性反应。结果表明,目的基因片段EL732276和EL732318被成功地插入烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体中。利用携带八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturae,PDS)的TRV重组载体病毒接种烟草,感染病毒的烟草植株表现光漂白现象,说明VIGS体系有效。用携带目的片段的重组载体病毒TRV:EL732276和TRV:EL732318感染烟草植株,一个月后,烟草叶片接种晚疫病菌P.infestans,从接种P.infestans的烟草叶片上可以看出,感染TRV空载体的对照烟草叶片上病斑扩展速率非常缓慢,而目的片段EL732276和EL732318沉默后的烟草叶片可见明显的水浸状病斑和少量白色的晚疫病菌菌丝。进一步的分析表明TRV:EL732276重组载体病毒侵染的烟草接种P.infestans后LGR值极显著上升,TRV:EL732318病毒侵染的烟草接种P.infestans后LGR值显著上升,表明EL732276和EL732318同源基因在烟草中沉默后,烟草对P.infestans的抗性显著降低。研究结果认为,病毒诱导的基因沉默技术可在本氏烟草中初步快速鉴定马铃薯抗病相关基因的功能。     

AtDREB1A基因过量表达对马铃薯盛花期生理生化指标的影响

以马铃薯品种陇薯3号及其转AtDREB1A基因株系T1为研究对象,在干旱胁迫条件下,研究了AtDREB1A基因过量表达对盛花期生理生化指标的影响。分析表明,在不同程度的干旱胁迫下,转基因株系T1盛花期叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性及脯氨酸(Pro)含量均高于同期非转基因陇薯3号对照,而丙二醛(MDA)含量和相对电导率均低于陇薯3号。以上结果初步表明,AtDREB1A基因的过量表达明显提高了马铃薯对干旱的抗性。     

低温胁迫下转RdreB1BI草莓逆境相关基因表达及抗性评价

为研究低温胁迫处理后,草莓逆境相关基因的表达及生理指标的变化,并对转RdreB1BI草莓进行抗性评价,本研究以已经通过分子鉴定的红颜草莓转RdreB1BI基因株系为试验材料,分析了零上冷害(4、2和0℃)、零下冻害(-2、-4和-6℃)以及常温(25℃),共7个温度梯度处理下草莓叶片丙二醛(MDA)含量、渗透调节物含量(可溶性糖、可溶性蛋白)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化物酶(POD)活性,并采用RT-qPCR法分析了在常温、-2℃和-4℃处理下草莓叶片外源RdreB1BI基因及内源逆境相关基因的表达情况。结果表明,株系7、株系8和株系10叶片在-4℃和-6℃处理无明显黄叶褐化现象,叶片SOD活性显著高于对照、株系1和株系9;株系10在-4℃和-6℃处理下叶片可溶性糖含量显著高于对照、株系1和株系7;-6℃处理下株系8叶片CAT活性保持较高水平。在-4℃处理下,ZAT10在株系7和株系8中的表达量显著高于株系1、株系9、株系10和对照,NAC在株系8和株系10中的表达量显著高于株系1、株系7、株系9和对照,表明转基因株系中,株系7、株系8和株系10具有较强的抗寒性。此外,在-4℃处理下,转RdreB1BI草莓中IDD4、PP2C25、HSFC1a及MYBR等转录因子的表达量显著高于对照,能协同RdreB1BI基因参与逆境胁迫响应,提高保护酶活性及渗透调节物质的含量,调控草莓对低温的耐性。外源RdreB1BI基因转入后能明显提高草莓的抗寒性。本研究结果为红颜草莓低温调控机理、北移栽培及抗性育种研究提供了理论基础。     

马铃薯晚疫病抗性相关StRIN4基因的克隆及表达模式分析

马铃薯晚疫病是马铃薯生产上的一种毁灭性病害。本研究克隆了马铃薯RIN4基因的全长ORF序列,对RIN4基因在马铃薯整个生长周期的组织特异性表达特性,及其在感染晚疫病前后马铃薯叶片中的差异表达进行了检测。结果表明,StRIN4受马铃薯晚疫病致病菌诱导表达,在不同生长时期的马铃薯各组织器官中具有不同的表达模式。该结果将有助于进一步揭示RIN4基因介导的马铃薯产生抗性机制的信号转导途径及其调控机制。     

转G10eve基因高抗草甘膦棉花的农艺性状分析

为培育高抗草甘膦棉花,本研究以转G10eve基因棉花为试验材料,通过室内鉴定结合大田试验,筛选高抗、稳定遗传的转基因株系。结果表明,幼苗期喷施不同浓度草甘膦,转基因株系L91抗性水平高于L152,抗性表现稳定,且根、茎、叶间莽草酸积累量差异明显,在叶片中相对含量最高。不同浓度草甘膦处理后,内源EPSPS基因相对表达量呈先升高后降低的趋势,在受体Coker 312中基因相对表达量显著高于转基因株系,表明转G10eve基因可以提高棉花的草甘膦抗性水平。大田试验表明,L91和商业化品种AuR可耐受20 mL·L~(-1)草甘膦。幼苗期喷施草甘膦后,L91株系的株高、果枝数、有效铃数相对于未喷施条件下(对照组)有所增加;AuR的各农艺性状指标与对照组差异不显著;花期喷施不高于20mL·L~(-1)草甘膦,L91和AuR棉花的株高、果枝数、有效铃数均未受抑制,表明,L91株系能够满足生产要求。本研究鉴定筛选得到高抗草甘膦L91转基因株系,为培育抗除草剂棉花新品种提供了种质资源。     

抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育

5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,epsps)是一个高抗草甘膦的基因,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因(Bt基因)cry1Ac M是一个能在单子叶植物中高效表达的抗亚洲玉米螟基因。为了获得具有抗虫、抗除草剂优良复合性状的转基因玉米,本研究构建出质粒p CAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1Ac M-Tnos,通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的玉米(Zea mays)茎尖遗传转化法将目标基因转入玉米。通过分子检测、草甘膦抗性筛选和田间接种亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis(Guenée))试验筛选出转基因株系,在此基础上进行了转基因植株室内抗亚洲玉米螟试验和田间草甘膦抗性分析,并采用RT-PCR检测和Western blot方法确定了抗虫蛋白在转基因植株中稳定表达。从大量转基因株系中优选出6个遗传稳定且抗亚洲玉米螟、抗除草剂草甘膦的转基因玉米株系,这些株系的抗亚洲玉米螟、抗草甘膦特性完全满足大田应用的需求。综上所述,将改造后的Bt抗虫基因cry1Ac M和抗草甘膦基因epsps一同转入玉米,赋予两种玉米骨干自交系植株抗玉米螟、抗草甘膦特性,为我国抗亚洲玉米螟抗草甘膦转基因玉米的大面积推广培育出了优良自交系。     

过表达野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因GsSAMS提高水稻耐盐碱性

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是生化反应中合成甲基供体的关键酶,在植物逆境响应中具有重要的作用。为了鉴定野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶GsSAMS基因对水稻盐碱胁迫耐性的影响,本研究采用USER克隆技术构建植物过表达载体,以农杆菌介导法侵染水稻愈伤组织,经过PCR、半定量PCR(RT-PCR)等分子检测获得GsSAMS转基因水稻株系;通过对比野生型和转基因水稻盐碱胁迫处理后的表型、存活率及过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性等指标,发现GsSAMS转基因株系耐盐碱性显著优于野生型。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现盐碱胁迫处理后,OsM6PR1、OsNAC5、OsPOX1基因在转基因株系中的表达显著高于野生型,说明GsSAMS可通过提高抗氧化物酶POD和CAT活性及相关基因的表达,增强转基因水稻盐碱胁迫耐受性。本研究获得的耐盐碱水稻新株系对盐碱地的开发利用具有重要意义。     

高粱5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)叶绿体转运肽(CTP)的克隆及其在转基因玉米中的功能验证

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化莽草酸-3-磷酸(S3P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP),具有与草甘膦结合的活性位点,且结合后会抑制EPSPS的活性,在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值.为了培育抗草甘膦玉米(Zea mays),本研究通过对高粱(Sorghum bicolor)EPSPS基因的结构分析,克隆了该基因5'端的叶绿体转运肽(chloroplast transit peptide,CTP).将该转运肽与来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4 EPSPS基因整合,以Ubiquitin为启动子,35S polyA为终止子,构建表达载体,同时以不含有转运肽的CP4 EPSPS基因为对照,遗传转化玉米得到稳定转基因株系;用PCR、Southern blot、ELISA等方法检测转基因玉米CP4 EPSPS基因的表达量并对其进行草甘膦抗性检测,研究发现,不含转运肽的转化事件虽然CP4 EPSPS基因表达量与含有转运肽的基本一致但却不具有草甘膦抗性,而含有转运肽的转化事件则抗性明显.说明转运肽并不影响CP4 EPSPS基因的表达,但对转基因植株草甘膦抗性起着重要作用,说明本研究克隆的叶绿体转运肽能够正常行使其生物学功能.研究结果为利用EPSPS基因培育抗草甘膦作物提供了重要参考资料.     

LRR-RLKs亚家族基因RLK6在拟南芥开花过程中的作用

为研究LRR-RLKs亚家族基因RLK6(AT2G26730)在拟南芥生长发育过程中的作用,本研究构建了植物过表达载体p Super1300-RLK6,获得5个过表达突变体,其中2个独立株系(OE8,OE9)用于表型分析。通过对野生型(WT)、RLK6基因缺失突变体(rlk6-2、rlk6-3和rlk6-6)、过表达株系OE8和OE9生长发育过程的详细观察和分析发现,RLK6基因缺失突变体在整个生长发育过程中的表型与WT差异不明显,而过表达株系OE8和OE9比WT开花早。此外,利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测各基因型植株中开花相关基因的表达情况,结果表明,相对于WT,OE8和OE9中的开花促进基因CO、SOC1和LFY的表达量显著升高,而开花抑制基因FLC的表达量显著下降。研究结果说明RLK6过表达促进了拟南芥的开花,这为后续深入研究RLK6的作用机制奠定了基础。     

可诱导剔除选择标记基因的pBLCK载体构建

为了剔除冗余且有潜在安全问题的选择标记基因,本研究通过PCR扩增出ubiquitin启动子序列、lox P序列、Cre-GR融合基因和NPTⅡ抗性基因的编码区序列,采用酶切连接的方法将其引入载体p BRACT806,从而构建一个新的可诱导剔除选择标记基因及重组酶基因的表达载体p BLCK,测序结果显示其构建成功。该载体含有Gateway组件,可进行外源目标基因的高效重组整合;具有NPTⅡ基因,利于转基因植株的筛选;具有可诱导剔除外源基因的Cre-GR组件,诱导处于lox P位点之间的抗性标记基因NPTⅡ和Cre-GR融合基因的剔除,保留目标基因表达元件。此外,目标基因、Cre-GR融合基因和NPTⅡ基因都由ubiquitin强启动子控制,可在农作物中组成型超量表达外源基因。本研究为农作物转基因安全性研究提供了新的载体系统,具有一定的育种价值。     

转OsbHLH1和Bar基因水稻及相关特性分析

OsbHLH1基因编码bHLH(basic helix-loop-helix,碱性螺旋-环-螺旋)类转录因子,与水稻耐低温相关。草铵膦是一种高效低毒灭生性除草剂,Bar基因表达产物能解除草铵膦的毒性。本实验对通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浸染法获得的以粳型水稻(Oryza sativaL.subsp.japonica Kato)恢复系淮C17为受体的转OsbHLH1和Bar基因水稻进行研究,鉴定其除草剂抗性和耐低温能力,考查其农艺性状。草铵膦筛选发现Bar基因正常表达;对草铵膦筛选获得的转基因植株进行PCR、Southern、RT-PCR和实时荧光定量PCR检测,发现OsbHLH1基因已经整合到水稻基因组中并且在水稻中表达。转基因T3代株系芽期(萌发芽长0.5mm)在2℃条件下处理6d,第6号转基因株系死苗率为17.8%,对照死苗率为61.1%。T3代苗期(一叶一心)在8～10℃下处理7d,第5、6、9、11号株系的根长显著长于对照,第3、5、11号株系的根数显著多于对照,第3号株系的平均鲜重显著重于对照。芽期、苗期耐冷性试验表明,OsbHLH1基因在水稻中过量表达显著提高了水稻芽期、苗期的耐低温能力。对转基因T2代的农艺性状进行考查,株高、千粒重、结实率、理论产量等农艺性状与对照相比较均出现了显著的变化,外源基因的导入对水稻的农艺性状有明显影响。研究结果将为选育抗除草剂、耐低温杂交粳稻新组合提供新种质。     

异源表达EgrNAC1提高拟南芥抗寒性和对干旱、高盐的敏感性

桉树是我国南方重要用材树种,但其栽培种对低温、干旱和高盐等非生物逆境抗性弱,限制了其栽培范围的扩大和栽培效益的提高。EgrNAC1(Eucgr.I00058)是巨桉中受低温、干旱和高盐诱导表达的NAC类转录因子。为进一步研究EgrNAC1的功能,通过异源转化拟南芥,获得了超表达EgrNAC1的转基因纯合株系,并对其进行低温(-6℃)、干旱、高盐(NaCl 300 mmol·L^-1 )和脱落酸(0.5 μmol·L^-1)处理,分析转基因株系对非生物逆境的响应。结果表明,超表达EgrNAC1能提高拟南芥植株对低温的抗性。-6℃处理12 h,恢复5 d后,转基因株系EgrNAC1-OE1和EgrNAC1-OE8的存活率分别达到88.9%和81.5%,而野生型仅有29.6%。低温处理下,转基因株系中3个低温信号传导(CBF)途径相关的基因,AtCBF1、AtCBF2和AtRD29A的表达量相对于野生型显著上调;超表达EgrNAC1提高了转基因植株对干旱和高盐的敏感程度。同时,转基因植株相对于野生型表现出对ABA敏感性的下降。综上,EgrNAC1在巨桉低温响应中可能作为一个正向调控因子,通过参与调控CBF途径中低温响应相关基因的表达,提高植物在低温逆境下的适应性。但在干旱和高盐逆境下,EgrNAC1可能发挥负调控作用,且这种作用可能与ABA的影响有关。本研究结果为深入了解桉树EgrNAC1的功能以及开展桉树抗逆分子辅助育种提供了一定的理论参考。     

RPW2表达载体构建及对烟草的遗传转化

将RPW2基因插入表达载体pBI121的表达盒中,构建了RPW2组成型表达载体。通过农杆菌叶盘转化法转化烟草叶片,经卡那霉素筛选、PCR扩增和Southern杂交鉴定证明,RPW2基因已成功转入烟草细胞中,获得6个转基因株系。RT-PCR半定量分析表明,转基因烟草株系的叶片中有RPW2基因的表达。不同转基因株系表达量不同,转基因株系T-R2和T-R4表达量较高。转基因植株叶片上人工接种烟草赤星病菌液检测转基因植株的抗病性,结果表明,与对照植株相比转RPW2基因植株对烟草赤星病抗性显著增强,说明RPW2基因在烟草中也具有抗病能力。另外,转基因株系间RPW2基因表达量虽有差异,但抗病性没有显著差异。     

水稻OsGPDH1的克隆与功能鉴定

为了解水稻甘油-3-磷酸脱氢酶基因在水稻抗逆性中的作用,本研究从水稻品种日本晴中克隆了1个编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因,命名为OsGPDH1,该基因编码的蛋白酶具有NAD(P)+结合域和脱氢酶域,且这2个结构域在植物中高度保守。构建过表达OsGPDH1基因载体转化水稻得到转基因植株,RT-qPCR分析表明,OsGPDH1基因在水稻孕穗期的叶、幼穗、茎、节、叶鞘中均有表达,说明该基因参与了水稻的生长发育过程。OsGPDH1基因也受到PEG6000、高盐、双氧水等逆境和甲基茉莉酸(mJA)、水杨酸(SA)等激素诱导表达,且诱导12h后,OsGPDH1的表达量达到最高水平,但对脱落酸(ABA)不敏感。盐胁迫下的发芽试验表明,过表达转基因水稻的发芽率高于野生型,说明OsGPDH1基因表达量的提高可增强转基因植株对盐胁迫的耐受性。对过表达OsGPDH1的转基因水稻进行苗期20%PEG6000胁迫处理后,转基因水稻的成活率显著高于野生型,说明OsGPDH1基因过表达可提高水稻苗期抗旱能力。本研究初步证明了OsGPDH1水稻抗盐胁迫和渗透胁迫的重要作用,为培育抗性转基因水稻新品种提供了新的基因资源。     

大麦赤霉病抗性不同突变体的创制及其相关基因表达

为了快速创制大麦赤霉病抗性存在差异的加倍单倍体(DH)株系,采用单花滴注法和喷雾法对诱变结合小孢子培养的379份大麦DH株系和原始品种花30的赤霉病抗扩展性和抗侵染性进行评价,同时对获得的抗性突变体材料和花30进行赤霉菌诱导下的大麦病程相关基因非表达子(NPR1、NPR2、NPR3)、茉莉酸介导的植物防御的调控因子(JAV1)以及乙烯响应因子(ERF1)的基因表达分析。结果表明,通过连续2年大田人工接种鉴定,从中获得了5份抗扩展性和抗侵染性均优于花30的候选株系,9份抗扩展性和抗侵染性均劣于花30的候选株系;赤霉病抗性突变体A1-190与原始品种花30在上述基因表达上存在明显差异,推测这些基因的表达与其抗病性的变化相关。研究结果表明诱变结合小孢子培养可以创制的DH株系在大麦赤霉病抗性存在差异。本研究结果为大麦抗赤霉病基因定位克隆及分子育种奠定了材料基础。     

烟草NAC4基因的克隆及其抗旱功能分析

NAC(NAM-ATAF-CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答过程中发挥着十分重要的作用。本研究克隆了烟草(Nicotiana tabacum)的NAC4基因,c DNA编码区全长1 422 bp,编码473个氨基酸;进化树分析表明,烟草NAC4基因编码的氨基酸序列与辣椒(Capsicum baccatum)和榴莲(Durio zibethinus)都有极高的相似性。构建表达载体pSH-NAC4,遗传转化烟草,获得32株转基因植株。选取6株不同的转基因株系和3株野生型(wild type,WT)在20%聚乙二醇6000胁迫的条件下,观察植株生长并进行抗旱性分析;选取T_1代3个转基因株系(TP_4,TP_6,TP_7)和野生型烟草种子,用3个不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫,对其种子的发芽率和苗期根进行耐旱性相关分析。结果发现,300 mmol/L甘露醇处理15 d,种子发芽率比野生型高40%以上,通过观察苗期根的生长发现,野生型植株根的生长明显受到抑制。用20%PEG6000处理转基因植株和野生型植株7 d,结果显示,在干旱胁迫下,转基因植株的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性均显著高于野生型,丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量显著低于野生型植株(P0.05)。利用qRT-PCR方法分析相关基因,结果表明,在干旱胁迫时,NAC4,吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)和鸟氨酸-δ-氨基转移酶基因(ornithine-oxo-acid transaminase,δ-OAT)的相对表达量均上调;转NAC4基因的表达可能提高了植株的抗旱能力。本研究为进一步探讨NAC4基因的功能提供依据,以期为创制转基因耐旱植物提供基础资料。     

稻瘟病菌胁迫下水稻不同单基因系防卫相关基因表达分析

水稻(Oryza sativa)不同稻瘟病抗性基因抗性水平存在显著差异,为了解防卫基因在不同抗性单基因系中的表达模式,本研究利用qRT-PCR方法比较了4个水稻抗稻瘟病单基因系IRB LKh-K3(Pik-h)、IRBLKs-F5 (Pik-s)、IRBLta2-Re (Pita-2)和IRBLta-K1 (Pita)中抗稻瘟病防卫相关基因几丁质酶基因1(chitinase 1,Cht-1)、β-1,3葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase,Glu)、苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanine ammonia lyase,PAL)和过氧化物酶基因(peroxidase,POX22.3)表达的差异.结果表明,在稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)胁迫后的6、12、24、36、48、72和96 h时间点,Cht-1和Glu的表达量在4个单基因系中的差异无明显的规律性.PAL在IRB LKh-K3(Pik-h)基因系中以及POX22.3在IRBLta2-Re (Pita-2)基因系中的表达量均持续高于在其余3个基因系中;前者的最高表达量至少是对照、IRBLta2-Re(Pita-2)、IRBLta-K1(Pita)和IRBLKs-F5(Pik-s)基因系的3.35、3.05、3.85和4.32倍,后者是对照、IRBLta-Kl(Pita)、IRBLKh-K3(Pik-h)和IRBLKs-F5(Pik-s)基因系的24.86、2.12、2.85和2.60倍.研究结果表明,PAL基因与POX22.3基因的表达分别受抗性基因Pik-h和Pita-2的特异调控参与抗性反应,为进一步研究抗性基因的抗性调控机制提供了依据.     

中间锦鸡儿CiDREB1C基因增强转基因拟南芥抵抗非生物胁迫的能力

中间锦鸡儿(Caragana intermedia)是广泛分布于我国西北干旱、半干旱荒漠区的防风固沙先锋树种,具有极强的抗逆性和饲用价值。本课题组从前期建立的干旱处理的中间锦鸡儿转录组数据库中分离到1个脱水响应元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein, DREB)转录因子编码基因片段,为了检测CiDREB1C基因的抗旱和抗冷能力,本研究首先利用qRT-PCR技术检测中间锦鸡儿中CiDREB1C基因在冷和干旱胁迫下的表达水平,发现均有上升(P0.01)。为了验证该基因的功能,本研究利用PCR技术获得了CiDREB1C基因全长(GenBank No. MG748598),并将其构建入植物过表达载体pCanG-HA,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana),获得了超表达CiDREB1C的转基因拟南芥纯合体。不同胁迫处理结果显示:甘露醇处理下,转基因拟南芥丙二醛的含量显著低于野生型(P0.01),叶绿素含量明显高于野生型(P0.01),表现出明显的抗旱表型;冷胁迫处理后,过表达株系叶绿素含量明显高于野生型(P0.01);黑暗处理下,过表达株系叶片衰老延迟,细胞死亡较野生型少,叶绿素含量显著高于野生型(P0.01)。上述结果说明,CiDREB1C基因提高了转基因拟南芥对多种胁迫的耐受性。本研究结果为进一步研究CiDREB1C基因在抗逆中的功能及中间锦鸡儿的抗逆分子作用机理提供依据。     

过表达TwHMGR和TwDXR基因对雷公藤萜类次生代谢产物的影响

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)分别被认为是植物萜类合成途径:甲羟戊酸(mevalonate,MVA)和2-甲基赤藓醇4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径的关键酶,这两个酶的基因表达水平将会直接影响到植物萜类物质的合成。本研究通过构建TwHMGR(KU246037.1)和TwDXR(KJ174341.1)基因的过表达载体,借助发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)整合到雷公藤(Tripterygium wilfordii)基因组中,分别筛选得到三株转基因发状根系。qRT-PCR分析结果表明,转基因发状根系中目的基因TwHMGR和TwDXR的表达量均明显高于对照,最高可分别达到对照的4.73倍和5.81倍。高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)法测定结果显示,转TwHMGR基因和TwDXR基因的发状根雷公藤内酯醇、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量均明显高于对照,结果表明,提高雷公藤TwHMGR基因和TwDXR基因的表达量,可以提高雷公藤萜类次生代谢产物的产量。研究结果为进一步利用代谢工程手段调控雷公藤活性物质的生物合成以及为研究雷公藤萜类物质的生物合成途径奠定基础。     

小麦转基因株系中外源脂氧合酶抑制基因(Loxi)拷贝数分析

转基因植物中外源基因拷贝数是影响其遗传稳定性及自身表达水平的重要因素。本研究旨在对转外源种子脂氧合酶基因的RNAi序列(RNAi sequence of lipoxygenase gene,Loxi)的小麦(Triticum aestivum)转基因株系中外源基因拷贝数及其种子脂氧合酶活性进行测定分析,以期获得种子脂氧合酶活性显著降低而且外源Loxi能稳定遗传的转基因小麦新种质。采用TaqMan实时定量PCR技术,以小麦内源控制籽粒硬度的主效单拷贝基因Pinb(puroindoline b)为内参基因,对6个转基因小麦TF5代株系外源Loxi拷贝数进行检测;同时以亚油酸为底物对这6个转基因株系种子脂氧合酶活性进行测定。结果显示,内参基因和外源基因扩增的标准曲线相关系数都接近于1,而且都具有合适的扩增效率,其中内参基因Pinb的扩增效率为107.7%;外源Loxi基因的扩增效率为104.5%;6个不同转基因株系中外源Loxi拷贝数不同,最小的为1,最大的为8;亲本品种陕优225和西农889种子脂氧合酶活性分别为(860±28.20)和(1 132±59.80)U;与其亲本材料相比,不同转基因株系种子脂氧合酶活性降低程度也不同(约为其亲本的21%~95%),有5个转基因株系与其亲本相比,酶活显著降低;其中亲本为西农889的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为2、6和8,与其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为32.76%、26.39%和21.05%;亲本为陕优225的3个转基因株系,外源Loxi拷贝数分别为1、3和6,其对应的种子脂氧合酶活性与其亲本种子酶活性之比分别为95.47%、51.06%和37.73%;外源Loxi拷贝数与种子LOX活性呈负相关。说明转基因株系中脂氧合酶基因的RNAi可有效抑制其种子LOX活性。本研究成功获得种子低脂氧合酶活性的转基因小麦材料,并对其外源Loxi拷贝数进行了准确测定;鉴定得到的种子脂氧合酶LOX活性显著降低的转基因小麦株系可为小麦育种提供新的亲本或种质材料。