黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达

白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。     

芽胞杆菌FJAT-28592抗真菌脂肽的研究

为研究产表面活性剂芽胞杆菌(Bacillus)的生防作用,本研究筛选了一株能够抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的芽胞杆菌FJAT-28592,经16S rRNA鉴定为暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis.菌株FJAT-28592的生长温度范围为25～50℃,最佳生长温度为35℃;pH 5.0～9.0,最佳pH 6.0～8.0;可在NaC1浓度为0～6％的条件下生长,最佳生长盐浓度为2％.透射电镜显示,菌株呈杆状,具有鞭毛,宽度为0.76～0.94 μm,长度为1.76～2.94 μm.暹罗芽胞杆菌FJAT-28592发酵液和提取的发酵液粗产物对尖孢镰刀菌有很好的抑菌效果.通过血平板和排油圈实验,初步认定暹罗芽胞杆菌FJAT-28592能分泌表面活性剂至发酵液.通过酸沉淀处理,甲醇和丙酮抽提,分离和收集发酵液中表面活性剂.高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)对初步纯化的粗品与iturin A的标准品进行分析,粗品与标准品iturin A的主峰保留时间均为10.687 min,初步判断粗品含有iturinA.克隆iturinA类脂肽合成的相关基因,获得丙二酰辅酶a转酰酶(malonyl-CoA-transacylase,ituD)和4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(4’-phosphate generic acyl cysteamine transferase,lpa-14)基因序列,得出此表面活性剂为iturinA类的脂肽.本研究为芽胞杆菌生防菌的开发,分析获得抑菌物质提供基础资料.     

玉米根际土壤芽胞杆菌的多样性

为了解玉米(Zea mays)不同品种根际芽胞杆菌种群多样性信息,本研究采用稀释平板法,对10个玉米品种根际的芽胞杆菌进行了分离,并对其进行16S r RNA序列分析。结果表明,从10个玉米品种根际共分离到69个形态差异的芽胞杆菌菌株;16S r RNA序列分析表明,69个菌株鉴定为23个种,归属于3个属,芽胞杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)和嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillus),其中芽胞杆菌属的种类和数量最多。玉米不同品种根际的芽胞杆菌的种类数量不同,QB662×QB2219和QB1013×QB446根际分离到的芽胞杆菌种类最多,均为8种;J106×QB572的芽胞杆菌菌落含量最高。玉米根际的优势种群主要为嗜气芽胞杆菌(B.aerophilus)、阿氏芽胞杆菌(B.aryabhattai)、简单芽胞杆菌(B.simplex)和苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis),其他芽胞杆菌种类仅在一种或少数的玉米品种出现。QB662×QB2219根际的芽胞杆菌种类香农-威纳(Shannon-Wiener)指数(H)最大;QB948×QB48根际的芽胞杆菌种群香农-威纳多样性指数次之,但均匀度指数最高;J106×QB572的多样性指数和均匀度指数皆最低。菌株FJAT-17411、FJAT-17472、FJAT-17430和FJAT-17442与Gen Bank中已报道16S r RNA基因序列的相似性为97%~98%,可能为芽胞杆菌的新种。本研究结果表明,玉米根际具有较为丰富的芽胞杆菌种群多样性,并存在一些潜在的新的微生物菌种资源。本研究对芽胞杆菌资源的开发和利用提供良好的实验材料和理论基础。     

高效纤维素降解菌的筛选及复合菌系的构建

本研究旨在筛选高效纤维素降解菌,组建复合菌系,用于堆肥接种剂的开发。通过纤维素刚果红选择性培养基,从腐殖土、堆肥样品中分离高效纤维素降解常温菌和耐高温菌。经过羧甲基纤维素酶活(carboxymethyl cellulase,CMCase)、滤纸条崩解能力、对稻杆及苦参(Sophora flavescens Ait.)残渣在液态和固态发酵条件下的降解能力测定逐级淘汰,筛选高效菌株组建复合菌系。研究结果表明,通过拮抗作用、单一菌株在复合菌系中作用测定,最终构建了由3株细菌(弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminensis)、微杆菌(Microbacterium sp.)和芽胞杆菌(Bacillus sp.)),1株链霉菌(Streptomyces sp.)和1株毛壳菌(Chaetomium sp.)组成的木质纤维素降解高效复合菌系。供试菌株在液态发酵条件下对稻杆和苦参残渣的降解效果明显强于固态发酵,稻杆比苦参残渣更容易被大多数微生物降解,供试真菌在稻杆和苦参残渣的降解中普遍表现出较高的降解效果。筛选得到弗留明拜叶林克氏菌XM-3可以在48 h内将滤纸条完全崩解,复合菌系在固态发酵20 d后对苦参残渣和稻秆的降解率分别达到31.4%和63.1%。本研究对堆肥接种剂的开发具有参考和借鉴意义。     

高效纤维素优势分解菌的筛选和鉴定

本试验基于获得高效纤维素优势分解菌的目的,通过分离纯化初步得到30株菌株,利用刚果红染色法初筛共得到14株纤维素分解菌,并通过滤纸条崩解实验进一步进行筛选得到5株效果较好的纤维素分解菌,通过发酵产酶利用DNS显色法测定CMC酶活力和FPA酶活力最终确定了4株优势纤维素分解菌,通过测定4株菌株的羧甲基纤维素酶(CMCase)、滤纸酶(FPA)以及β-葡萄糖苷酶(β-Gase)活,验证4株纤维素优势分解菌的产酶能力,并分别命名为X-1、X-6、X-7和X-11,并将该4株优势纤维素分解菌应用于秸秆的液态发酵,其对秸秆的降解率较自然降解相比,降解率分别提高了31.92%、40.15%、35.29%和39.98%。对4株优势菌株进行了分子鉴定,根据16S r DNA序列比对结果表明,菌株X-1、X-7和X-11均为粪产碱杆菌;菌株X-6属于解糖假苍白杆菌。     

稻草秸秆纤维素分解菌的分离筛选

本研究基于获得高效木质纤维素分解菌的目的,以刚果红纤维素琼脂和滤纸条培养基为初筛培养基,从分离获得的124株真菌中筛选出透明圈与菌落直径比值较大、滤纸条分解能力较强的11个菌株。经液体发酵,测定其酶活力,复筛得到羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活均较高的4个菌株;并进行了不同碳源和不同pH对筛选菌株产酶能力的影响试验,发现不同菌株对不同纤维素物质的分解能力不一样,同一菌株对不同纤维素碳源的利用能力也不相同。     

玉溪醇化烟叶表面细菌酶制剂对烟叶中淀粉和纤维素的降解作用

合理降解烤后烟叶中的淀粉和纤维素含量已成为提高烟叶质量的关键工艺之一。本研究对分离自烤烟叶面的产淀粉酶细菌菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens A1)和产纤维素酶细菌菌株短小芽孢杆菌(B.pumilus C1)进行发酵培养,提取粗酶液,检测酶活性并应用于初烤烟叶上。通过设计不同酶量、作用时间、相对湿度和温度的方法考察这两种酶制剂对烟叶(Nicotiana tabacum K326)中淀粉和纤维素的降解效果。结果表明,菌株A1主要产α-淀粉酶,酶活力为7×105U/mL,菌株C1以产内切酶为主,酶活力为6×103U/mL;在温度40℃、湿度70%条件下作用96h,用菌株A1所产淀粉酶制剂4×107U/kg处理后的烟叶总糖增加率为12.78%,还原糖增加率为12.03%,菌株C1所产纤维素酶制剂4×105U/kg处理后的烟叶总糖增加率为13.87%,还原糖增加率为18.07%。研究结果提示,利用从烟叶表面分离的产酶菌株进行发酵生产的酶制剂可降解初烤烟叶中淀粉和纤维素,提高还原糖含量,可望在烟叶加工过程中得到应用。     

一株从金钱树上分离的产纤维素降解酶的菌株的分离及特性鉴定

本研究从金钱树（Zamioculcas zamiifolia）白绢病（Southern blight）病株上分离到一株产纤维素酶菌株SM,经形态观察和rDNA—ITS序列分析鉴定为齐整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc）,经以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基培养和刚果红染色测定,证明SM菌株可产生高活性纤维素降解酶。本文对SM菌株产纤维素降解酶的液态发酵条件进行了研究,结果表明：在起始pH6．0,无机氮：有机氮：纤维素碳源之比为0．07g：1．4g：1．6g,温度为30℃,摇床转速为160r／min,发酵培养时间为5d的条件下,该菌株发酵液的CMC酶活性达到11．7U／mL,滤纸酶活性达到2．156U／mL,β-葡萄糖苷酶活性达到3．911U／mL。     

芽胞杆菌高产纤维素酶菌株的诱变选育与培养基优化

为获得高产纤维素酶菌株,采用紫外(UV)诱变和紫外-亚硝基胍(UV-NTG)复合诱变方法对新疆吐鲁番地区土壤中分离得到的产纤维素酶菌株芽胞杆菌C-8进行诱变筛选,并通过二次正交旋转组合试验和响应面试验对诱变筛选得到的菌株进行培养基的优化。结果表明,UV诱变菌株UV-5和UV-NTG比出发菌株C-8纤维素酶活分别提高了1.15倍和3.23倍;当发酵培养基中碳源浓度为3%、氮源浓度为1.5%、吐温-80的浓度为0.15%时,纤维素酶活达到453.20 U·m L-1,是出发菌株C-8的5.49倍和复合诱变菌株UV-NTG-10的1.7倍。本研究结果为纤维素酶的扩大发酵以及后期工业化生产提供了理论依据。     

堆肥中纤维素降解菌的筛选及复配菌降解性能研究

为加快堆肥过程中秸秆纤维素的降解速率,本研究从玉米秸秆堆肥中分离纤维素分解菌,并通过测定羧甲基纤维素酶(CMCase)活力、滤纸条崩解能力及兼容性,筛选出优良菌株,进而构建复合菌系,并对降解性能进行评价。结果共获得29株纤维素分解菌,对其中的高效菌株进行配伍,构建了6组复合菌系。除复合菌系F外,其他复合菌系的滤纸酶活力均显著高于单一菌株(P<0.05),尤以复合菌系B(xw1、xw3、xw8)、D(xw16、xw21、xw31)的酶活力最高,分别为22.8、20.4 U·mL^-1,比其中的最强单菌株xw3、xw21高出58.3%、68.6%,且所产酶具有耐高温(40～55℃)性。复合菌系B、D培养5 d可将滤纸条崩解为糊状,10 d内对秸秆的降解率达24.5%、21.9%,较单菌株xw8、xw31增加9.4和4.7个百分点。经16S rDNA分子鉴定,复合菌系B由微杆菌属(Microbacterium sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)组成,复合菌系D由芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillu ...     

玉米秸秆低温降解菌的分离筛选及鉴定

利用从渭源县山地采集的30份样品,采用刚果红染色法和液体摇瓶发酵法筛选出了1株能够在15℃条件下降解羧甲基纤维素、玉米秸秆纤维素和高产纤维素酶的真菌菌株D5,同时测定了该菌株纤维素酶活力和对玉米秸秆的降解能力,并通过ITS r DNA序列分析对该真菌进行了初步鉴定。结果表明,菌株D5液体培养7 d的木聚糖酶活为52.7 U·m L~(-1),CMCase酶活为31.5 U·m L~(-1),滤纸酶活为29.6 U·m L~(-1);菌株D5在玉米秸秆为唯一碳源的培养基里发酵10 d,玉米秸秆的失重率为29.8%。菌株D5经ITS r DNA序列分析初步鉴定为Penicillium sp.,在玉米秸秆降解方面具有较大的应用潜力。     

纤维素降解菌CMC-4的分离鉴定、诱变和酶学特性研究

从秸秆还田土壤中初筛获得一株高效纤维素降解菌CMC-4,根据菌株形态、理化性质及16S rDNA序列分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。以此为出发菌株,经亚硝酸钠诱变获得一株稳定高产纤维素酶突变株CMC-4-3。对CMC-4和CMC-4-3的产酶条件和酶学性质进行比较分析,结果表明:CMC-4-3纤维素酶活力较CMC-4提高67.5%;其最适产酶条件是:37℃、pH 6.0、葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、接种量2.0%、装液量60 ml/250 ml。该菌株所产纤维素酶的最适反应pH为6.0,且在4.0~7.0酶活力较稳定;最适反应温度为50℃,在20~80℃范围内均保持稳定;金属离子Fe~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、K~+对酶有激活作用,其余离子均有不同程度抑制作用,而Cu~(2+)和Ca~(2+)抑制作用最强,酶活力减弱近50%,是该酶的强效抑制因子。诱变前后菌株产酶条件和酶学性质等部分表型发生了变化,而突变菌株显示出了更宽泛的环境适应范围。据此,获得一株高效产纤维素酶、耐受范围广的具纤维素降解能力的地衣芽孢杆菌,而CMC-4-3和CMC-4的表型可作为深入探讨基因型变化的线索。     

高产中性纤维素酶的巨大芽胞杆菌基因工程菌发酵工艺条件优化

为了加快纤维素酶工业化应用的步伐,解决纤维素酶发酵工业产量低、生产成本高等问题,本研究采用正交设计法对高产中性纤维素酶的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)基因工程菌的培养基和发酵条件进行优化.结果表明,最佳发酵培养基成分为:麦麸2.5%、玉米浆1.5%、磷酸二氢钾0.75%、硫酸镁0.04%、氯化钠0.25%;最佳发酵条件为:温度37℃,pH 7.0,罐压0.03～0.05 Mpa,转速600 r/min,装液量3 L,接种量10%,培养4 h后以0.25 g/L/h的流速流加木糖10 h,发酵16 h后,以恒溶氧方式流加补料8 h,共补加料320mL,发酵过程控制溶氧浓度≥30%.该工程菌在此最佳发酵条件下培养,纤维素酶活力可达3846.48 U/mL,是优化前摇瓶发酵的4.3倍.本研究可为工业化生产纤维素酶提供依据.     

苏云金芽胞杆菌类ABC transporter基因zwa-FEG能提高双效菌素的抗性

双效菌素(zwittermicin A,ZwA)是一种氨基多元醇类新型广谱抗生素,zmaR为其抗性基因。在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520菌株ZwA合成基因簇末端存在一个类似ABC transporter的序列(命名为zwa-FEG)。将zwa-FEG基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,大肠杆菌能获得ZwA的抗性;将zwa-FEG转移到产ZwA的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株UW85中,能使其ZwA产量显著提高。推测zwa-FEG是一种ZwA专一性的ABC transporter,它能将ZwA分泌到胞外,从而增强ZwA的合成和ZwA的抗性。     

一株产常温葡甘聚糖酶的芽孢杆菌的分离、鉴定及产酶发酵条件的研究

以魔芋生粉为唯一碳源的筛选培养基,从魔芋废渣中分离筛选出一株可以降解魔芋生粉的细菌菌株,编号为LS-6。根据16SrDNA序列和生理生化特性,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。胞内外葡甘露聚糖酶酶活分析结果表明,LS-6产生的葡甘聚糖酶为胞外酶。LS-6产生葡甘聚糖酶的最佳培养基组分和条件是：1%魔芋生粉,0.5%酵母粉,0.5%NaCl,培养基初始pH为6.0,最佳发酵条件是25℃,摇床转速200r/min,培养48h。酶解产物的高效液相色谱分析结果表明,LS-6粗酶液的酶解产物主要为葡萄糖和甘露糖。LS-6的分离为进一步克隆常温葡甘聚糖酶基因和产酶工程菌的构建奠定了基础。     

秸秆纤维素降解真菌QSH3-3的筛选及其特性研究

为了获得高效降解秸秆纤维素的微生物菌株,采用滤纸降解法和刚果红染色法从含纤维素类物质的土壤中筛选到一株产纤维素酶菌株QSH3-3,通过形态观察和ITS序列分析,鉴定为草酸青霉Penicillium oxalicum QSH3-3。摇瓶产酶试验结果表明,该菌株的最佳产酶条件为:碳源为0.5%的碱处理过的玉米秸秆粉,氮源为0.2% 硫酸铵,起始pH为7,接种量为5%,产酶温度为30℃,培养时间为4 d。最佳产酶条件下,滤纸酶（FPase）、内切酶（CMCase）和木聚糖酶（Xylanase）分别为12 U、33 U、605 U（U为酶活性单位）;在15℃,其残余酶活力可达70%～80%;在pH 4～9 范围内,其残余酶活力可达70%以上。酶学稳定性研究表明,FPase、CMCase和Xylanase在pH 4～9范围残余酶活力达85%以上,具有较强的酸碱适应能力;FPase、CMCase和Xylanase在45℃以上酶活力迅速下降,耐热性较差。该菌株具有较高的木聚糖酶活力以及较强的低温、pH的耐受力,因而该菌株在田间温差大、土壤偏碱性等复杂条件下对秸秆纤维素类物质的降解具有较高的应用潜力。     

枯草芽胞杆菌重组木聚糖酶基因高效表达系统的构建

以木聚糖酶基因为研究对象,构建了枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)稳定的高效表达系统。采用PCR方法从芽胞杆菌(Bacillus sp.)基因组DNA中分别扩增出完整和不带启动子的木聚糖酶(xynA)基因;利用芽胞杆菌的强启动子,即S-层蛋白的启动子,通过SOE(splicing by overlapping extension)法连接到xynA基因上得到重组基因S-xynA,将xynA和S-xynA分别装载到整合载体pDG1730上,转化α-淀粉酶高产菌株枯草芽胞杆菌B47,将重组基因整合到α-淀粉酶基因上,以期目标基因像淀粉酶基因一样高效表达。结果表明,2个重组菌的产酶活性均得到提高,其中S-层蛋白启动子表达的木聚糖酶活是自身启动子表达的酶活的1.69倍。重组表达的木聚糖酶在pH5~8和40~60℃范围内均具有较高活性。     

黑叶猴肠道纤维素降解菌筛选鉴定及对鸡饲料粗纤维降解效率的影响

利用选择性培养基筛选获得目标菌株,并鉴定其分类属性;采用单因素试验设计,筛选最适产酶条件;再将该菌株作为饲料添加剂饲养鸡群,探明其对鸡饲料粗纤维降解效率及鸡群体重的影响,旨在筛选黑叶猴(Trachypithecus francoisi)肠道高效纤维素降解菌,为人体肠道益生菌群或畜牧业饲料添加剂扩大菌谱.结果:鉴定出黑叶...     

几株硅酸盐细菌的系统发育分析

实验应用ARDRA、全细胞脂肪酸分析、16S rDNA系统发育分析、DNA G+C mol%含量和DNA同源性分析等方法对几株硅酸盐细菌进行系统发育分析,根据结果,部分菌株划分为胶质芽胞杆菌(Bacillus mucilagi-nosus),并建议成立新的芽胞杆菌类型.     

酰基高丝氨酸内酯酶在蜡状芽胞杆菌中可增强双效菌素抗软腐病

双效菌素(zwittermicin A,ZwA)是一种广谱、新型的抗生素,对很多植物病原菌具有抑制作用;酰基高丝氨酸内酯酶(AHL)通过降解植物病原菌群体感应(quorum-sensing)系统的信号分子,减弱致病基因的表达从而达到抗病的效果。结合这两种物质的不同抗病机理,将来自苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)中的AHL基因导入到蜡状芽胞杆菌(B.cereus)中,得到相应的重组菌株。实验表明,AHL基因在重组菌中可正常表达,并且不影响受体菌ZwA的表达和产量;感病实验证明,同时表达ZwA和AHL的重组菌对于胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)感染马铃薯(Solanum tuberosum)所引起的病害的抗病效果比单独含产ZwA或AHL的蜡状芽胞杆菌的抗病效果有明显增强。说明结合ZwA和AHL的不同抗病机理来提高抗病效果是可行的。