甘蔗叶片宿根矮化病的PCR检测

采用PCR方法对甘蔗植株不同生长时期(幼苗期、分蘖期、拔节期、成熟期)、同一植株的不同叶片及同一叶片的不同部位(叶尖、叶中、叶基)分别取样进行宿根矮化病检测。结果表明:在不同甘蔗生长时期常规PCR方法都可以检测出宿根矮化病阳性植株;对呈阳性植株的不同叶片及同一叶片的不同部位检测均呈阳性,说明被检测甘蔗品种植株不同位置叶片对甘蔗宿根矮化病检测效率影响差异不明显。     

甘蔗宿根矮化病巢式PCR检测体系

利用LG和Cxx两对引物,通过实验优化设计,建立了比较可靠的甘蔗宿根矮化病巢式PCR检测体系.     

甘蔗不同部位宿根矮化病分子检测研究

运用PCR检测技术对粤糖93-159和ROC25的不同部位进行了RSD检测,结果表明,在同一个样品的5次重复检测中,两个品种叶片的平均检出率为20％,叶鞘的平均检出率为90％,茎尖的平均检出率为40％,茎部组织和蔗汁的平均检出率均为100％.本研究表明今后可以使用甘蔗茎部组织或叶鞘代替蔗汁进行RSD的检测.     

甘蔗宿根矮化病的I-ELISA快速检测

利用从澳大利亚引进的RSD标准抗原抗体,研究建立了I-ELISA检测甘蔗宿根矮化病（RSD）的方法。通过对田间采集的样本进行检测,同时以电镜负染检测法印证,检测结果一致,表明I-ELISA能简便、快速、准确、有效地检测出RSD,为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种／材料交换检疫检测提供了技术支撑。     

广西甘蔗宿根矮化病的发生及病原检测

通过对广西各蔗区采集的样本进行检测,结果表明甘蔗宿根矮化病在广西普遍发生,其发生情况各地差别不大,与品种和宿根性有关。利用电视相差显微镜和PCR技术结合能快速诊断甘蔗宿根矮化病。     

广西甘蔗宿根矮化病研究初报

甘蔗宿根矮化病在广西蔗区普遍发生，目前栽培品种(品系)RSD检出率达100％。发生没有区域差别，各蔗区均有发生，但发生程度与品种和宿根性有关。各品种间带菌量有差异，新植、宿根蔗带菌量也不同，一般新植蔗带菌量比宿根蔗少，宿根蔗比新植蔗发生严重。利用电视相差显微镜、电子显微镜和PCR等检测技术能诊断RSB。     

广西宜州蔗区甘蔗宿根矮化病的调查及病原检测

对广西宜州蔗区甘蔗宿根矮化病(RSD)的发生和分布进行了调查和田间采样,采用PCR和I-ELISA法,对田间采集的52个样本进行RSD检测。结果表明:37个样本为阳性,阳性检出率71.15%,15个样本为阴性,确认宜州蔗区存在RSD;通过系统分析,明确了不同品种、不同植期、不同蔗区RSD发生状况,为宜州蔗区推广应用温水脱毒健康种苗、有效防控甘蔗宿根矮化病提供了科学依据。     

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用

利用细菌16S-23S r DNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后,设计1对特异性引物Rs F/Rs R,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验证了其准确性;将引物Rs F/Rs R与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。     

茶尺蠖核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus, EoNPV）基因序列设计一对引物,并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA,进行PCR扩增,将该基因片段与载体pMD18-T连接,转化入大肠杆菌TG1中,经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒,以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.989,检测范围为10³~10⁸拷贝/µL,特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数,为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。     

转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法的建立

为了防止国外商业化生产的转基因番木瓜流入国内市场,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法,对于保护国内消费者知情权意义重大。本研究以转基因抗环斑病毒番木瓜 55-1 为研究材料,利用外源基因和番木瓜基因组序列设计了 9 对特异性检测引物,通过特异性引物筛选、熔解曲线分析、退火温度优化、特异性验证、灵敏度分析及检测限验证,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法。结果表明：本研究筛选出的检测引物,可特异的检出转基因番木瓜 55-1 转化事件,引物的检测灵敏度达到了 0.1%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求,完全可满足转基因检测标识制度的顺利实施。     

稻曲病菌分生孢子实时PCR定量检测方法的建立及初步应用

 根据稻曲病菌核糖体转录间隔区（ITS）序列的特异性,设计了2对引物及相应TaqMan探针用于建立稻曲病菌实时PCR定量检测技术。结果表明,uvr292rf/uvr397rr/uvrp333组合建立的体系可特异性检测出稻曲病菌,扩增基线平整,指数扩增期明显,重现性好,最低可检出24 fg的稻曲病菌基因组DNA模板量;以梯度稀释分生孢子液提取的基因组DNA为模板,建立孢子数量常用对数值与Ct值的线性关系,理论上最低可检测出0.67个分生孢子。对3个时间点的田间孢子捕捉样品进行检测,结果显示不同月份间稻曲病菌孢子数量存在差异。     

Development of a qPCR for Leifsonia xyli subsp. xyli and quantification of the effects of heat treatment of sugarcane cuttings on Lxx

The main control practice of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) in sugarcane is to heat-treat cane cuttings used as planting material in an attempt to eradicate the bacterium. A real time quantitative PCR (qPCR) protocol specific for Lxx was developed to assess the effectiveness of this practice. Primers were designed from the sequence of an Lxx-specific gene and detected as few as 10⁻⁵ ng of Lxx DNA in 100 ng of plant DNA. Two experiments were conducted to quantify Lxx titers in plants of the varieties SP80-3280 and SP70-3370 originated from cuttings treated or not by immersion in hot water at 52 °C for 30 min. In the first experiment, cuttings were collected from plant canes with low Lxx titers whereas in the second they were collected from first-ratoon canes with higher titers. Lxx was quantified in leaves by qPCR 90 days after planting and was detected in 50–90% of the plants at variable titers, indicating that the 52 °C hot water treatment for 30 min was not effective in eradicating Lxx from all plants. However, in the second experiment the bacterial population was reduced, as the median number of Lxx cells was lower compared to the non-treated control. In the case of SP70-3370, the treatment also reduced the number of Lxx-infected plants considering the pooled data of the two experiments. The results indicated that although the 52 °C hot water treatment for 30 min did not completely eliminate Lxx, it can be used to reduce the pathogen population in plants propagated from canes with high Lxx titers     

辣椒环斑病毒分子检测方法的建立及应用

辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus, ChiRSV）是2007年在辣椒上发现的病毒新种,是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的确定种。笔者于2009年首次在海南黄灯笼辣椒上检测发现ChiRSV。根据ChiRSV保守区域设计和筛选PCR特异引物,优化退火温度,对PCR产物进行序列测定,建立了ChiRSV的RT-PCR检测方法。通过灵敏度测定,结果表明该方法最低可检出12.5 pg病毒RNA,灵敏度高。通过对来自海南田间的疑似辣椒病样的RT-PCR检测,证实了该方法有良好的反应特异性,亦表明ChiRSV可能已在海南扩散。     

水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用

采用实时荧光定量PCR技术,通过使用特异引物,对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1;3进行了转录水平上的定量分析,成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量PCR扩增曲线,基线平整,指数区明显,斜率大且固定;线性范围广,17～36个循环都能测出;稳定性、重复性好,变异系数仅为0.47%;标准曲线表明,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,可对基因表达进行相对定量;缺氮条件下OsAMT1;3 与纯NH4+处理相比表达量增加4倍以上。     

橡胶树红根病病原菌LAMP检测方法的建立及应用

由灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)引起的红根病是橡胶上危害面积最广、影响最大的世界性根部传染性病害.本研究利用环介导等温扩增技术(LAMP),以G.pseudoferreum线粒体Large rDNA特异片段为靶标序列,设计出G.pseudoferreum特异性LAMP引物,以SYBR Gree...     

龙眼体胚发生过程中两个乙烯受体基因的定量表达分析

以龙眼体细胞胚胎发生8个不同发育阶段同步化胚性培养物为材料,采用荧光定量PCR方法,分析两个乙烯受体基因(DL-ETR1和DL-ERS1)的mRNA动态变化水平。试验结果表明:DL-ETR1表达量整体的变化趋势呈近似"W"状,松散型的胚性愈伤组织(Stage 1)的表达量最高,心形胚(Stage 6)阶段的表达量最低;龙眼体胚发生过程的8个阶段均有DL-ERS1基因的表达,子叶形胚(Stage 8)的表达量最高,其它7个阶段的表达量都很低,鱼雷形胚(Stage 7)的表达量极低,几乎不表达。DL-ETR1与DL-ERS1有着不同时期的表达模式,并且可能起到结合乙烯,调节龙眼体胚对乙烯敏感性的综合作用。     

茉莉花茶主要品质成分定量近红外光谱分析模型的建立

选择有代表性的112个茉莉花茶茶样为实验材料,采用近红外光谱分析技术结合化学计量学方法对茶多酚总量(TP)、游离氨基酸总量(AA)、咖啡碱(CAFF)、水浸出物(water extract)、没食子酸(GA)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素没食子酸酯(CG)这13种品质成分的含量建立定量分析模型。结果显示,除CG的模型综合评价指标Q值为0.7702以外,其余的Q值为0.8～0.9。经外部检验,CAFF和GCG的真实值与预测值的相关系数R为0.7～0.8,GC、EGCG、ECG、CG为0.8～0.9,其余均达0.9以上,模型效果较好,为简便快速地测定茉莉花茶品质成分的含量提供了新思路。     

新疆小麦1BL/1RS易位和 Dx5基因的多重PCR检测及其面筋品质分析

为了给新疆小麦面筋品质改良提供参考依据,利用多重PCR体系对267份新疆冬、春小麦品种中1BL/1RS易位和 Dx5基因的分布进行了检测,并测定了其中181份小麦品种的面粉蛋白质含量、湿面筋含量、Zeleny沉淀值以及面团特性等品质性状。结果表明,新疆小麦品种中,1BL/1RS易位品种有55份,占20.6%,含有 Dx5基因的品种有76份,占28.5%。冬小麦品种中1BL/1RS易位系分布频率（26.6%）显著高于春小麦（9.6%）,而春小麦品种中 Dx5基因的分布频率（31.9%）高于冬小麦（26.6%）。在新疆小麦农家品种、引进品种和自育成品种中,1BL/1RS易位和 Dx5基因的分布频率也存在明显差异。分析表明,1BL/1RS和非1BL/1RS小麦品种的主要面筋品质性状（如Zeleny沉淀值、峰值高度、8 min宽度等）达到显著性差异（P＜0.05）,1BL/1RS小麦中含 Dx5和不含 Dx5基因品种的面筋指数、Zeleny沉淀值、峰值时间和8 min面积等5个参数差异达到显著水平（P＜0.05）。多重PCR体系检测结果可靠稳定,节省实验经费和时间,提高了效率,可用于小麦分子辅助育种。