高羊茅春化基因RNAi表达载体的构建

[目的]用RNAi干扰技术沉默高羊茅FaVRN1。[方法]将拟南芥内肌动蛋白含子（145bp）插入到表达载体pBI121已构建能形成发夹的中间载体。设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增高羊茅春化基因351bp长的外显子靶标序列,限制性酶切后以正向和反向插入到RNA干扰中间载体内含子两端,构建带发夹结构的RNA干扰表达载体。[结果]双酶切结果表明内含子（145bp）已成功连入表达载体。PCR和酶切验证证实目的基因（351bp）已连入中间表达载体。[结论]该研究为培育RNAi转基因开花抑制型高羊茅新品种奠定基础。     

绿色荧光蛋白基因银耳表达载体构建及表达

以银耳芽孢为材料,由载体pEGFP、pCAMBIA1300经过HindIII和EcoRⅠ双酶切、连接、转化,重组质粒酶切验证,成功构建了由双孢蘑菇gpd启动子调控EGFP基因的银耳真核表达载体,命名pCB-BEGFP。采用电击转化法将携带EGFP基因的银耳表达载体pCB-BEGFP转化到银耳芽孢。提取4个转化子基因组DNA,用EGFP基因特异引物PCR扩增,电泳结果表明有与EGFP基因大小一致的特异带出现;荧光显微镜观察在再生培养基上的转化子可看到很强的绿光;其中一个转化子蛋白SDS-PAGE电泳,结果发现在大约27kD处有一明显的蛋白条带出现,与预期的蛋白分子量相近。以上结果证明EGFP基因转入银耳芽孢中,双孢蘑菇启动子可以调控外源基因的在银耳芽孢中正确表达。     

番茄叶片液泡转化酶基因植物反义表达载体的构建与瞬时表达

在分析植物液泡转化酶基因保守区序列的基础上,设计1对PCR引物,以番茄(中蔬四号)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为668 bp的cDNA片段,并克隆入pMD-18 T simple载体。测序结果表明,所获得的片段为番茄液泡转化酶基因TIV1的片段;PCR和酶切分析表明,该片段已成功定向连入到双无载体pBinAR的CaMV 35S启动子和OCS终止子间,构建成反义植物表达载体pBinAR-aTIV1;菌落PCR表明质粒成功转化入农杆菌EHA105;瞬时表达证明该反义片段对番茄叶片液泡转化酶活性具有明显的抑制效果。     

伪狂犬病毒基因转移载体的快速构建及其瞬时表达

以含有伪狂犬病毒（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｕｓ,ＰＲＶ）蛋白激酶（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ,ＰＫ）基因的重组质粒为基础,利用非互补粘性经过部分补平后成为粘性末端,再进行连接的方法克隆了与载体分子大小相当的报告基因表达盒。用限制发现人切酶分析确证了伪狂现毒表达载体中报宽大圊窝囊斩主方向,并通过导入细胞后检测外源基因在体外的瞬时表达,直接鉴定一表达载体的生物学活性。     

绿色荧光蛋白标记穿梭表达载体构建及重组乳酸菌制备

以红霉素耐药性基因/thy A基因双筛选压力大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体pW425et为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pW425et-GFP.通过连续的荧光强度检测,验证gfp基因能否在重组菌中得到稳定表达.重组表达质粒pW425et-GFP酶切和PCR鉴定结果与预期片段大小相符,SDS-PAGE显示27 kD的绿色荧光蛋白获得表达,在蓝光的激发下,可见明显的绿色荧光,且荧光稳定性强,连续传代30次仍可见荧光.结果表明已成功构建了GFP标记穿梭表达载体pW425et-GFP,为乳酸菌作为益生生理菌载体进行体内定植规律研究和食品级、疫苗级乳酸菌产品的开发奠定了基础.     

水稻通用叶绿体表达载体的构建

本研究建立了以水稻叶绿体来源的trnA、trnI为同源重组片段,水稻叶绿体来源的Prrn为启动子,烟草叶绿体来源的Tps-bA为终止子,EPSP为筛选标记基因,GFP为外源基因,并含有两个多克隆位点(MCS)的"水稻通用叶绿体表达载体":pBAC823-NdeI-trnA-ApaI-XhoI-Prrn-AgeI-SalI-GFP-KpnI-SmaI-PacI-tpsba--HindIII-Prrn-EPSP-tpsba-EcoRI-trnI-NotI-pBAC823,并将其命名为pBAC8234。酶切试验结果证明,载体pBAC8234上GFP基因两侧设计的酶切位点为单克隆酶切位点,可用于后续实验。     

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.     

韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建

用PCR方法扩增得到了长度为966bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆人pUCm—T载体后,获得了新的重组质粒pUCm—PSP．分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMBIA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的新型植物表达载体pHZ03．利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中．     

猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达

参考GenBank登录的猪肺炎支原体(Mhp)P46基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成引物,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对猪肺炎支原体P46基因的3个位点进行定点突变,将此突变基因插入到表达载体pET-32a( )中,经IPTG诱导后成功地在大肠杆菌Rosetta(DE3)宿主菌中表达分子量约为63 500的融合蛋白.Western blotting分析表明,该融合蛋白具有较好的免疫原性.为猪肺炎支原体抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础.     

Production of Transgenic Tall Fescue Plants with Enhanced Stress Tolerances by Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation

In order to improve stress tolerances of turf-type tall fescue （Festuca arundinacea Schreb.）, Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 carrying plasmid pCMD containing stress tolerance-related CBF1 gene from Arabidopsis thaliana was used to transform mature seeds-derived embryogenic calli of four cultivars. A total of 112 transgenic plants were regenerated from 32 independent lines and verified by histochemical detection of GUS activity, PCR assay and Southern hybridization analysis. The transformation frequency ranged from 0.92 to 2.87% with apparent differences among the cultivars. Stress tolerances of transgenic plants were enhanced, which was shown by the facts that transgenic plants had distinct growth superiority and significantly higher survival rate than non-transformed ones under high salinity and high osmosis stresses, and that relative electronic conductivity of in vitro leaves treated with low and high temoeratures, dehvdration and high salinity stresses was 25-30% lower in transgenic plants than in control plants.In addition,it was observed that growth of transgenic plants was inhibited due to constitutive overexpression of CBF1 gene under normal environmental conditions.     

4个高羊茅品种响应植被砼干热生境的生理特征

以植被砼生境上的4个高羊茅(Festucaarundinacea)品种为试材,分别进行38℃和50℃的干热胁迫处理后,测定叶片的细胞膜透性、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的相对活性、游离脯氨酸和叶绿素的含量等指标,并比较各品种间的差异。结果表明,Pearl和MillenninmⅡ在干热胁迫下能产生较多的SOD、CAT和游离脯氨酸,但细胞膜受损较大,Barrington和Millenninm只能产生较少SOD、CAT和游离脯氨酸。综合评价表明,Pearl和MillenninmⅡ的抗干热性较强,Barrington和Millenninm的抗干热性相对较差。     

根癌农杆菌介导转化获得耐逆性增强的高羊茅转基因植株

 为改良草坪型高羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的耐逆性，以成熟种子来源的胚性愈伤组织为受体材料，通过农杆菌介导法将拟南芥（Arabidopsis thaliana）耐逆相关CBF1基因导入4个供试品种的基因组，经GUS染色、PCR检测和Southern杂交分析验证，获得了112株转基因植株，转化频率为0.92% ~2.87%，不同品种间存在差异。试验表明，在高盐与高渗胁迫下，转基因植株具有显著生长优势，存活率极显著高于非转化对照植株，经低温、高温、干旱和高盐等逆境胁迫处理后的叶片相对电导率平均较对照植株低25% ~ 30%，证明转基因植株的耐逆性有所增强。考察发现，非胁迫条件下CBF1基因的组成型超表达使转基因植株的生长受到抑制。     

植被砼上4个高羊茅品种在高温干旱胁迫下的伤害

对植被砼上的4个高羊茅(Festtuca arundinacea)品种Millenninm II、Pearl、Millenninm和Barrington进行了高温、抽湿和高温抽湿处理,通过测定其株高、分蘖数、伤害比率、叶宽、叶色、根长、根冠比等7项指标,比较了品种间耐干热性的差异。结果表明:高温干旱对植被砼上高羊茅各品种生长发育造成了不同程度的影响;高温干旱双因子胁迫较之干旱或高温单因子更严重;Millenninm II耐干热性最强,Millenninm最弱。     

草坪草高羊茅高温诱导抑制差减杂交文库的构建及其表达

为了深入研究草坪草对抗高温逆境的分子遗传机制,构建高羊茅在高温胁迫下相关的基因文库。研究以冷季型草坪草高羊茅为研究对象,在长期生理试验的基础上,通过构建高羊茅在高温胁迫下的SSH文库,挑选部分阳性克隆进行测序,并对所获得的差异基因序列进行分析,研究了在38℃/30℃(昼/夜)培养箱中进行高温胁迫6 h的高羊茅叶片和对照组高羊茅叶片的RNA差异。结果表明:试验得到的差减文库中大量组成型表达的基因已经被有效去除,使某些特有的差异基因得到了富集;两个文库的基因片段的长度分布在200~900 bp,平均片段长度约500 bp左右;在构建的高羊茅耐热cDNA文库中随机挑选了123个大小约500 bp左右的EST测序,共得到100个有效序列,其中38个是未知序列,其余62个为已报道序列,但是序列功能全部未知,这些EST中有25个与叶绿体染色体有关,其中9个与已提交的羊茅属植物叶绿体内的基因同源。本试验最终得到了合格的差减文库并对部分基因进行了测序,可为高羊茅耐热基因的研究提供依据,同时也为提高草坪草水肥调控措施提供了理论基础。     

甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体构建

[目的]为研究质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转化叶绿体奠定基础。[方法]根据GeneBank上的甘蓝型油菜的叶绿体DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增获得与甘蓝型油菜叶绿体基因组可发生同源重组的DNA片段,构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹对所构建载体上的表达盒进行功能鉴定。[结果]以甘蓝型油菜的叶片叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得4 357 bp的DNA片段,包含2个开放阅读框RbcL和β-CT。成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体pHBM720,而且同一多顺反子的3个基因均在大肠杆菌中得到表达。[结论]该叶绿体多顺反子单交换表达载体具有较强的通用性与安全性,比双交换表达载体更具优越性。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因植物表达载体的构建及瞬时表达

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特点,被认为是肿瘤凋亡疗法较有希望的候选药物。植物生物反应器在药用蛋白质生产方面具备较大优势。构建了可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的植物表达载体,进行本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,并对目的蛋白的体外活性进行检测。结果显示,本氏烟叶片中目的蛋白平均表达量为68.60 pg/mg TSP;在浓度为200 pg/m L时,对NCI-H460细胞株的抑制率为28.75%。研究表明,经密码子优化的编码基因能够在受体植物中表达出有活性的目的蛋白,为开展目的基因的稳定转化工作奠定了基础。     

植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及GFP表达

[目的]研究了植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及用pClYVV／CP／W表达绿色荧光蛋白（GFP）,为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pCIYVV基因组的NIb／CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pCIYVV／CP／W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pCIYVV／CP／W中构建pCIYVV／CP／W／GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pCIYVV／CP／W／GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型CIYVV相同的症状,发病率达100％,表明重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP．有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pCIYVV／CP／W的开放阅读框;以感染叶总RNA为模板,对pCIYVV／CP／W／GFP表达GFP外源基因的稳定性进行了检测,从F0（重组病毒质粒最初转录出的病毒）一直检测到Fd子代病毒。检测结果表明,外源基因在L子代病毒基因组中稳定存在;以从感染叶中提取的总蛋白为抗原,以GFP抗体为第1抗体,以碱性磷酸酶标记抗体为第2抗体,用Western杂交对重组病毒克隆pCVYVV／CP／W／GFP表达外源蛋白进行了定性检测。从F0一直检测到F4子代病毒。检测结果表明,重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP至少到F4子代病毒能稳定表达GFP。