鹅FSHβ基因克隆及序列分析

促卵泡激素β亚基(FSHβ)基因是动物繁殖性状的一个重要候选基因,对鹅产蛋量具有重要的调节作用。本研究以鹅垂体组织总RNA反转录的cDNA为模板,分别采用RT-PCR和RACE技术扩增鹅FSHβcDNA序列,包含:16 bp 5′UTR,396 bp开放阅读框(ORF)和3′端非翻译区2个不同的剪接体,其大小分别为518 bp和780 bp。经生物信息学软件分析,发现鹅FSHβ基因编码的蛋白为亲水蛋白,且存在信号肽序列切割位点,则推测其为分泌蛋白。本研究首次成功获得了鹅FSHβ基因的cDNA全长序列并进行了分析,可为全面解析鹅FSHβ基因的分子结构及功能提供一定的参考。     

红嘴鸥TLR7基因克隆与生物信息学分析

【目的】克隆野生鸟类红嘴鸥Toll样受体7(TLR7)基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析,为后期TLR7蛋白的抗病毒活性研究做准备。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)扩增红嘴鸥TLR7基因全序列,通过生物信息学软件分析TLR7基因序列、稀有密码子、相似性及其编码蛋白的理化性质、跨膜区域、信号肽、N-糖基化位点、磷酸化位点和亚细胞定位,分别利用SOPMA和SWISS-MODEL软件预测TLR7蛋白的二级结构和三级结构。【结果】试验成功克隆红嘴鸥TLR7基因(GenBank登录号:MZ668652),全长1 720 bp,开放阅读框(ORF)大小为1 182 bp,存在39个稀有密码子,其中含8个连续稀有密码子,编码393个氨基酸;红嘴鸥TLR7基因与GenBank中原鸡、红腹角雉、鹌鹑、绿头鸭、黑天鹅、山雀、白鹭、帝企鹅、红喉潜鸟和巴布亚企鹅的TLR7基因相似性分别为85.7%、84.9%、85.4%、87.0%、87.8%、86.8%、91.0%、93.1%、93.1%和93.1%。系统进化树结果显示...     

牛源CCR7基因克隆、生物信息学及表达分析

【目的】 探究CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7,CCR7)基因编码蛋白的生物学特性及其mRNA在健康和炎性奶牛乳腺组织中的表达量。【方法】 使用PCR扩增并克隆中国荷斯坦奶牛CCR7基因CDS区,测序后进行相似性比对及系统进化树构建;使用多种生物信息学软件分析CCR7蛋白的组成、理化性质及结构等;使用实时荧光定量PCR技术检测CCR7基因在健康和炎性奶牛乳腺组织中的表达差异。【结果】 中国荷斯坦奶牛CCR7基因CDS区全长1 325 bp,与绵羊的相似性较高(95.2%),亲缘关系较近;与鸡的相似性较低(56.4%),亲缘关系较远。CCR7基因编码379个氨基酸,其中亮氨酸含量最多,缬氨酸含量次之,组氨酸和色氨酸含量最低;CCR7蛋白分子质量为14.56 ku,理论等电点为8.89,平均亲水系数为0.640,是一种跨膜疏水性蛋白。CCR7蛋白信号肽切割位点可能存在于第24和25位氨基酸之间。CCR7蛋白二级结构中α-螺旋占比最大,高达51.72%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。CCR7基因在炎性奶牛乳腺组织中的表达量极显著高于健康乳腺组织(P<0.01),其可能在奶牛乳腺炎的免疫调控中有着重要的作用。【结论】 试验成功克隆出牛CCR7基因CDS区序列,并进行了相应的生物信息学分析及组织定量表达,为进一步研究CCR7基因的具体功能提供材料,对于探究CCR7基因在奶牛乳腺炎中的调控功能具有重要的意义。     

鹅α和γ干扰素基因的克隆及序列分析

从植物血凝素(PHA)刺激的鹅外周血白细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增鹅IFN基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析.克隆到的鹅IFN-α和IFN-γ基因与GeneBank上已公布的鸭IFN核苷酸序列进行比较,其同源性分别为IFN-α96.70%、IFN-γ94.95%;氨基酸序列同源性分别为IFN-α93.72%、IFN-γ93.29%.这为进一步研究鹅干扰素的生物学特性和应用奠定了基础.     

鸭CYP7_α1基因克隆、序列分析及组织表达研究

旨在克隆鸭胆固醇7α羟化酶1(CYP7α1)基因,并进一步探讨该基因的结构与功能,揭示其组织特异性表达规律。本研究以樱桃谷鸭为材料,运用同源序列克隆结合RACE技术,对鸭CYP7α1基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析及组织表达的研究。结果表明:鸭CYP7α1基因cDNA全长2 351bp,最大开放阅读框(ORF)1 539bp(114～1 652bp),共编码512个氨基酸;鸭CYP7α1氨基酸与鹅的同源性最高(97.5%),其次是鸡(92.8%)、人(67.3%)、猪(66.5%)、兔(65.7%)、大鼠(65.5%)、小鼠(65.5%)和牛(65.1%);经预测鸭CYP7α1蛋白可能含有1个P450超家族结构域;鸭CYP7α1基因在肝脏中呈高丰度表达,在其他9个组织中均未检测到或检测到少量表达,表明该基因的表达具有组织特异性。     

鹅GnRH基因CDS区克隆、序列分析及原核表达

本研究旨在了解鹅GnRH基因的CDS区序列及其蛋白表达情况,研究鹅GnRH蛋白的生理功能,为进一步阐明GnRH蛋白影响鹅繁殖性能的调控机制提供理论基础。采用RT-PCR方法从溆浦鹅下丘脑扩增获得GnRH基因的CDS区序列,将测序正确的DNA序列定向克隆到pET28a(+),构建表达载体pET28a-GnRH,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western blot分析。结果显示:获得的溆浦鹅GnRH基因CDS区部分序列,含有270个核苷酸,编码前体蛋白中的90个氨基酸;溆浦鹅GnRH基因CDS区在大肠杆菌中得到高效表达,GnRH基因CDS区的目的蛋白为9 900,最终测得菌体湿重为0.6g/L,纯化后得到的蛋白为20~30mg/L;清晰检测到GnRH基因表达的蛋白特异带,试验获得的抗体对原核表达的GnRH蛋白具有特异性反应;鹅GnRH基因在动物进化中高度保守,研究得到的鹅GnRH前体蛋白可为进一步研究GnRH基因的生物功能以及其对鹅就巢、产蛋等繁殖性状的影响奠定基础。     

鹅ACSL6基因编码区克隆、序列分析及组织表达

为研究长链酯酰辅酶A合成酶6(ACSL6)在鹅中的功能,采用RT-PCR方法对其扩增,并采用荧光定量PCR方法检测其在四川白鹅不同组织中的差异表达。结果表明:实验成功获得了鹅ACSL6基因的编码区序列(GQ449255),序列全长2 097 bp,编码698个氨基酸;鹅ACSL6与鸡该基因在核苷酸和氨基酸水平上都有较高的同源性;鹅ACSL6氨基酸与哺乳动物一样,也存在2个保守功能区(跨膜区和luxE保守区),且在这些区域物种间变异较少;鹅ACSL6在脑组织中有较高表达,在肝脏中表达较少,仍与其在哺乳动物中的表达特性一致。以上研究结果表明,ACSL6基因在物种间比较保守,ACSL6与鹅大脑的发育关系密切,可能与鹅肥肝形成的关系较少。     

普陀山苔草植物络合素合成酶CpPCS基因克隆及其在叶中的表达分析

以超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshan)为材料,克隆其植物络合素合酶基因CpPCS的cDNA全长序列。同时,对其进行重金属胁迫处理,研究该基因在叶中的表达特点。结果表明,该基因cDNA序列全长1 461bp,可编码486个氨基酸;与其它植物同源基因对比显示,它们的氨基酸序列相似性在63%左右;通过构建进化树发现,普陀山苔草CpPCS与小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)及芦苇(Phragmites australis)等单子叶植物亲缘关系最近;荧光定量RT-PCR分析结果显示,CpPCS基因及CePCS基因受重金属铅锌胁迫上调表达,其中在叶中的表达量显著增加(P0.05)。通过普陀山苔草植物络合素合酶蛋白基因进行了克隆鉴定,探讨该基因的结构、进化关系及其参与普陀山苔草重金属胁迫的应答模式,为进一步培育重金属污染土壤修复的植物奠定基础。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199 bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185 bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

奶水牛固醇携带蛋白2基因克隆、生物信息学分析及其组织表达检测

本研究旨在对水牛固醇携带蛋白2（sterol carrier protein 2,SCP2）基因进行克隆及生物信息学分析,并检测其在水牛不同组织中的表达。以黄牛SCP2基因（登录号：NM_001033990.3）为种子序列成功克隆了水牛SCP2基因完整CDS区,该序列长1 632 bp,可编码543个氨基酸;其与黄牛、绵羊、山羊、白鲸、人、家犬和家猫的同源性分别为95.9%、93.4%、92.4%、89.4%、88.3%、86.3%和86.9%,说明SCP2基因CDS区在不同物种间具有较高的保守性。聚类分析则表明水牛与黄牛的分子进化关系最近;氨基酸序列分析表明,SCP2蛋白的分子式为C₂₆₀₂H₄₁₃₁N₇₀₉O₇₇₄S₂₉₈,分子质量为58.66 ku,理论等电点（pI）为8.59,不稳定系数为27.94,平均亲水性为-0.215,属于碱性、稳定、亲水蛋白质;二级结构分析表明水牛SCP2蛋白由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链构成,其中α-螺旋占35.54%,无规则卷曲占48.99%,延伸链占15.47%,与三级结构预测结果一致;亚细胞定位分析表明,水牛SCP2蛋白分布在细胞质（43.5%）、过氧化物酶体（21.7%）、线粒体（17.4%）、细胞核（13.0%）和细胞骨架（4.4%）;跨膜结构和信号肽预测分析表明,水牛SCP2蛋白不含跨膜结构和信号肽;磷酸化位点分析发现,水牛SCP2蛋白有13个Ser、3个Thr和2个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化位点;蛋白质结合位点预测结果显示,水牛SCP2蛋白含有12个蛋白质结合位点和1个多核苷酸结合位点;实时荧光定量PCR结果表明,水牛SCP2基因在肝脏中表达量最高,其他组织中表达量从高到低依次为乳腺、淋巴、肾脏、大肠、胃、肺脏、脾脏、卵巢、垂体、大脑和心脏。本试验为今后进一步探讨SCP2基因的功能奠定了基础。     

卵巢肿瘤去泛素化酶7A基因与鹅肥肝形成关系的研究

【目的】 研究卵巢肿瘤去泛素化酶7A(OTUD7A)基因与鹅肥肝形成的关系。【方法】 选取健康、体重一致的70日龄朗德鹅公鹅40只,随机分为2组,对照组自由采食,试验组进行填饲试验,其中填饲第1~5天每日采食量为500 g,第6~12天每日采食量为800 g,第13~19天每日采食量为1 200 g。在填饲第7、14和19天时,每组随机选取6只鹅屠宰,取肝脏,采用实时荧光定量PCR测定不同填饲阶段肝脏中OTUD7A基因的表达水平。采用Ⅳ型胶原酶消化法分离23胚龄的鹅原代肝细胞,分别用浓度为0(空白组)、125、250 mmol/L的葡萄糖,0(空白组)、50、100、200 nmol/L的胰岛素,0(空白组)、0.125、0.250 mmol/L的油酸、亚油酸及0(空白组)、0.25、0.50 mmol/L棕榈酸处理鹅原代肝细胞,并用实时荧光定量PCR检测这些脂肪肝形成相关因子对OTUD7A基因表达水平的影响。构建过表达OTUD7A基因的载体pcDNA3.1-OTUD7A,并将构建好的过表达重组质粒转染鹅原代肝细胞,通过转录组学测序(RNA-Seq)进行差异表达基因的筛选,并对获得的差异表达基因进行GO功能富集分析。【结果】 在填饲第7、14天时,鹅肝脏中的OTUD7A基因表达显著高于对照组(P<0.05)。与空白组相比,250 mmol/L葡萄糖处理以及0.125 mmol/L和0.250 mmol/L棕榈酸处理均显著提高鹅原代肝细胞中OTUD7A基因的表达水平(P<0.05)。转录组学测序结果表明,OTUD7A基因过表达后共筛选到34个差异表达基因,其中有19个基因表达上调、15个基因表达下调。GO功能富集分析发现,差异表达基因注释到对微生物的防御反应、对外界生物刺激的反应、T细胞分化、细胞外外泌体等条目,其中CLMP、PROCR、SH3BP1、ARHGAP28、ACE、OTUD7A、LOC106045877、LOC106048002基因的表达上调,TNFSF8、DDX60、PLAC8、RSAD2、MX1、RSAD2、GBP1基因的表达下调。【结论】 鹅肥肝形成过程中OTUD7A基因的表达水平升高,OTUD7A基因可能通过调控TNFSF8、RSAD2、MX1、GBP1、CLMP和PROCR等基因的表达参与鹅肥肝的形成。     

卵泡抑素样蛋白5基因在鹅肥肝形成中表达调控的研究

试验旨在探讨卵泡抑素样蛋白5(FSTL5)基因与鹅(Anser Cygnoides)肥肝形成的关系。试验选取30只健康、体重基本一致的70日龄朗德鹅,随机分为填饲组(15只)和对照组(15只)。在填饲到82日龄(填饲12 d)和94日龄(填饲24 d)时屠宰取样。此外,分离培养鹅原代肝细胞,并用葡萄糖、胰岛素和不同脂肪酸进行处理。结果显示:填饲后期肝脏和腹脂中FSTL5基因的表达量显著低于对照组(P<0.05),而胸肌中的表达量显著高于对照组(P<0.05)。在鹅原代肝细胞中,100 nmol/L胰岛素或0.25 mmol/L亚油酸能诱导FSTL5的表达(P<0.05)。综上所述,肝脏、脂肪与肌肉组织中的FSTL5表达在鹅肥肝形成后期受到显著影响,脂肪肝形成相关因子特别是胰岛素和亚油酸可诱导FSTL5的表达。研究结果为进一步研究FSTL5基因在鹅肥肝形成过程中的作用奠定了基础。     

鹅胆固醇7α-羟化酶基因克隆及原核表达

为进一步研究胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)在胆汁酸合成和胆固醇代谢过程中的调节机制,采用RT-PCR和RACE方法从鹅(Anser anser)肝组织克隆CYP7A1基因全长cDNA序列,亚克隆其CDS区并构建原核表达载体pET-28a-cyp7α1.重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导表达.经His-Bind纯化试剂盒纯化的His-CYP7A1免疫Bal b/c小鼠,制备小鼠抗鹅CYP7A1多克隆抗体,Western blotting验证His-CYP7A1免疫原性和抗体的特异性.序列分析结果表明,该蛋白与鸡、大鼠、人、短尾猊、小鼠的CYP7A1蛋白氨基酸序列同源性分别为93 ％、66％、67％、68％、66％.SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白His-CYP7A1得到正确高效表达,该His0CYP7A1分子质量约为59 ku,经纯化获得高纯度重组His-CYP7A1蛋白.制备了小鼠抗鹅CYP7A1多克隆抗体,效价达1∶104.Western blotting检测表明,该蛋白能够被小鼠抗His抗体和小鼠抗CYP7A1抗体所识别,小鼠抗CYP7A1多克隆抗体具有较好的特异性.试验结果为进一步研究CYP7A1基因结构和CYP7A1在鹅肝脏脂类代谢中的作用提供了基础和技术手段.     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

鹅肥肝产业面临的困境与解决方案

1981年,我国鹅肥肝试验首次成功,经过20多年的不懈努力,我国的鹅肥肝生产无论从产量和销量方面,都迈上了一个新的台阶.目前,全球鹅肥肝的年总产量约3000吨,2006年我国的鹅肥肝产量已达500余吨,居世界第三位;到2010年前后,我国的鹅肥肝产量预计将达到1 500吨,超过匈牙利而位居世界首位[1].随着我国肥肝产业的快速发展,也暴露出不少问题,制约我国鹅肥肝产业的可持续发展.本文就我国鹅肥肝产业中存在的问题,提出个人之浅见,期望对同行有所裨益.……     

不同品种鹅及其杂交后代产肝性能比较的研究

1材料与方法 1.1时间与地点 试验于2007年1月～12月在黑龙江省鹅育种中心进行. 1.2试验方法 1.2.1 种鹅群的组建与生产管理 于2007年2月,在种鹅群随机选择朗德鹅、莱菌鹅、籽鹅和豁眼鹅分成两个试验群,七个试验小组.纯繁群为四组:朗德鹅、莱菌鹅、籽鹅和豁眼鹅,杂交群为三组:朗德鹅×莱菌鹅、朗德鹅×籽鹅和朗德鹅×豁眼鹅.种鹅饲喂全价配合饲料,自由采食与饮水,光照时间增至16 h.舍内密度为2～3只/m2.舍外设有运动场和洗浴池.     

草原红牛FABP7基因克隆、生物信息学及组织表达差异分析

本研究旨在克隆草原红牛脂肪酸结合蛋白7基因(FABP7)的CDS区序列并对其进行生物信息学分析,同时检测其在牛各个组织中的mRNA表达水平。利用RT-PCR技术克隆草原红牛FABP7基因CDS区序列,并使用多种生物软件和在线工具进行生物信息学分析,通过qPCR技术检测FABP7基因在各组织间mRNA的表达水平。结果表明:草原红牛FABP7基因CDS区全长399 bp,编码132个氨基酸,蛋白分子量为14.96 ku,理论等电点为5.38,属于亲水性蛋白;通过NCBI-BLAST对比发现,草原红牛与普通牛、羊、猪、人、鼠、鸡的核苷酸序列同源性分别为99%、98%、94%、92%、85%、85%,系统进化树结果发现,草原红牛与普通牛亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;FABP7蛋白序列有1个二硫键,14个磷酸化位点,1个N-糖基化位点,不存在信号肽和跨膜区;在蛋白的二级结构和三级结构中发现,FABP7蛋白主要存在2个α-螺旋结构和10条β-折叠,为混合型蛋白。FABP7基因在小肠组织表达量最高,在心脏、脂肪和胃中中度表达。     

鹅固醇调节元件结合蛋白1基因的克隆及生物信息学分析

从16周龄朗德鹅肝脏组织提取总RNA,采用反转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）方法扩增出1条长约280 bp的cDNA片段。序列分析结果表明,扩增出的cDNA片段与固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）基因有较高的同源性,并且该片段包含着1个bHLH功能区。同时该片段包含1个明显的亲水区和1个明显的疏水区,二级结构富含α-螺旋,这与其功能相符。     

鹅ACSL4基因克隆及其与肝脂质沉积的关系研究

本研究旨在克隆鹅长链酯酰辅酶A合成酶4(ACSL4)基因,探讨其与鹅肝脂质沉积的关系和品种间的表达差异。本实验通过RT-PCR、实时定量等技术扩增鹅ACSL4基因CDS、检测了该基因在皮脂、腹脂、肝脏等10个组织中的表达情况及填饲对其在肝脏中表达的影响,并探讨其表达量与血浆胰岛素、鹅肝脏甘油三酯(TG)、肝重等指标间的相关性。结果表明:鹅ACSL4基因CDS全长2 013 bp,编码670个氨基酸。保守结构预测发现,其蛋白质与哺乳动物一样,也存在2个保守功能区(ATP/AMP motif和FACS motif),它与鸡、人、猪、小鼠、大鼠的同源性分别为96.9%、80.4%、80.1%、78.5%、78.4%;组织表达结果显示,该基因主要于大脑、腹脂、心肌、睾丸等组织中表达,而在肝脏中表达相对较低;填饲引起ACSL4 mRNA在鹅肝脏的表达丰度极显著增加(P<0.01);且与肝脏脂质沉积相关指标呈显著正相关(P<0.05),暗示其在鹅肝脂肪变性中可能扮演着重要的角色。