贵州竹乡乌骨鸡Ghrelin基因的克隆及原核表达

采用特异性引物自贵州黑羽乌骨鸡胃部组织克隆了Ghrelin的基因,基因全长2330bp,含有4个外显子,3个内含子.采用RT-PCR技术,获得了Ghrelin cDNA片段(563 bp),序列分析推测,通过可变剪切可产生两段mKNA,cDNA编码区与基因组中的编码区完全一致.黑羽乌骨鸡Ghrelin基因与已知鸡种比较有13～18个碱基不同,相似性为99.1%～99.3%,但其氨基酸序列完全一样,表明禽类的Ghrelin多肽高度保守.将其中Ghrelin编码区亚克隆到原核表达载体pTYB11中,经序列测定碱基序列正确,获得重组质粒pTYB11/G.在IPTG的诱导下,重组质粒在大肠杆菌ER2566中获得表达.当OD600=0.5,IPTG为浓度1 mmol/L,诱导5小时的表达量最高,融合蛋白占细胞总蛋白的40%.采用几丁质结合的预装柱对表达产物进行纯化,产率约为5 mg/L培养液.     

绵羊Klf4编码区的克隆、序列分析与原核表达

参照GenBank上牛和猪的Klf4 cDNA序列设计特异引物,采用RT-PCR方法从怀孕60d的胎绵羊皮肤总RNA中扩增绵羊Klf4基因编码区序列,利用生物学软件对其进行序列分析;将该编码区连接到原核表达载体pET-30b(+)上并转化BL21大肠杆菌,在IPTG诱导下进行表达。经测序,绵羊Klf4基因编码区序列包括终止密码子在内的1 434bp,编码477个氨基酸,已在GenBank上登录(登录号GQ280389),与牛、猪、马、人、猕猴、黑猩猩、鼠等物种相比,绵羊Klf4基因CDS区的核苷酸序列相应序列同源性分别为98.26%、93.81%、93.24%、90.24%、90.13%、90.37%和87.25%,其氨基酸序列同源性分别为99.58%、97.94%、96.02%、94.14%、93.51%、92.08%和92.66%;生物软件分析显示,绵羊Klf 4含有细胞核定位模体和锌指结构域。利用克隆获得的绵羊Klf4 cDNA所构建的表达载体pET-30-Klf4,经IPTG诱导在BL21大肠杆菌中成功表达相对分子质量约为57 000的融合蛋白His-Klf4。     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区.通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-V4中含有轮状病毒的VP4基因片段.经核苷酸序列分析,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区.     

轮状病毒VP4、VP7基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增816bp,916bp的VP4，VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5α中，提取质粒经PCR扩增，酶切鉴定，证明重组质粒pT-V4,PT-V7中含有轮状病毒的VP4，VP7基因片段。经核苷酸序列分析。表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4，VP7基因中抗原表位区。     

牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析

为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析.从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200 bp～1 000 bp之间.随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率.结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量.本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因.     

绵羊黏膜趋化因子CCL28基因的克隆、序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。     

应用RACE技术扩增鸭A-FABP基因及序列分析

为揭示鸭A-FABP基因的结构和功能,运用RACE方法克隆并鉴定了鸭A-FABP基因的全长cDNA序列。用1对含高度保守的DNA片段的兼并引物,从鸭腹部脂肪组织总RNA扩增部分A-FABP片段,测序结果与已知序列一致;根据已知的鸭A-FABP基因序列设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。经DNASTAR中的SeqMan软件拼接5′RACE产物和3′RACE产物以及已知序列而获得片段大小为652 bp的cDNA序列。该cDNA序列由64 bp的5′非编码区、399 bp的编码序列和189 bp的3′非编码区组成。鸭A-FABP基因399 bp的开放阅读框编码132个氨基酸。经Blastn和Blastx比对分析,鸭A-FABP基因的编码区核苷酸序列与人、猪、鸡和鹅分别有76%、78%、93%和93%的同源性。     

猪DECR1基因cDNA的克隆、序列分析及原核表达研究

旨在研究猪2,4-dienoyl-CoA reductase1(DECR1)基因的结构,揭示该基因的原核表达规律。试验以山西马身猪的肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术克隆了DECR1基因的cDNA全序列,并将其重组于pET32a+原核表达载体中,经酶切、序列鉴定正确后,重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。结果表明:猪DECR1基因的cDNA全长2352bp,包括987bp的开放阅读框(ORF),53bp的5′非翻译区(UTR)和1312bp的3′-UTR;编码区(CDS)编码328个氨基酸残基与猪(电子预测序列)、牛、人、猩猩、猴、马、犬、鼠相应序列的同源性分别为99%、88%、88%、87%、87%、87%、87%和83%;SDS-PAGE电泳结果显示,在IPTG诱导4h时,外源蛋白表达效率最高;Western blot检测发现经诱导表达的蛋白产物大小约为35ku,与预测的大小一致。猪DECR1基因的克隆和表达研究,为进一步探究该基因的生物学功能及其分子遗传机制提供了理论基础。     

新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因的克隆与表达

以表达新疆绵羊种布鲁氏菌外膜抗原蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b,探索其作为诊断抗原和分子疫苗的可能性。采用PCR扩增技术,从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组DNA中扩增出OMP2b基因片段,将该片段克隆于原核表达载体PE-28a(+),构建成重组质粒,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测有无蛋白的表达。结果表明,获得长约1 083bp的PCR片段,序列分析结果与已知绵羊种OMP2b同源性达89.72%;SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量39 ku获得了新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因片段,并在大肠杆菌中实现了表达。     

三黄鸡a干扰素的克隆、表达及抗病毒活性初步研究

采用PCR方法从三黄鸡血液基因组中扩增鸡α干扰素全基因,并克隆和测序.序列分析表明,基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp.将该片段与表达载体pET-28a连接克隆至大肠埃希菌DH5α菌株,经测序和酶切鉴定,选取正向插入、读码框正确的阳性克隆.构建重组质粒并转化BL21(DE3),经IPTG诱导,...     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区。通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5a中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定，证明重组质粒pT-4中含有轮状病毒的VP4基因片段。经核苷酸序列分析，表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区。     

鹅副黏病毒L基因片段的克隆及其主要抗原表位区的原核表达

利用PCR扩增鹅副黏病毒编码L蛋白的主要抗原表位区基因片段,并将该片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,通过诱导表达条件的摸索,实现了L蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效中的表达,SDS-PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,Western blot分析重组蛋白具有良好的抗原性,并利用亲和层析得到融合蛋白.     

军曹鱼MHC-Ⅱα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

本研究根据其他鱼类MHC-Ⅱα基因的保守序列设计兼并引物,运用同源克隆和末端快速扩增方法扩增了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的全长cDNA序列,并对cDNA及其氨基酸序列进行了分析,比较了军曹鱼和其他物种的MHC-Ⅱα氨基酸序列的差异,分析了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的组织分布及经LPS刺激后头肾组织中MHC-Ⅱα基因的表达变化。结果表明,军曹鱼MHC-Ⅱα cDNA全长998 bp,包括53 bp的5′末端非编码区（5′UTR）、234 bp的3′末端非编码区（3′UTR）及711 bp的开放阅读框（ORF）,编码236个氮基酸,其蛋白质分子质量约为25.94 ku,等电点为4.39;军曹鱼MHC-Ⅱα蛋白质序列具有一些重要的特征,包括前导肽、α1、α2、CP/TM/CYT区和保守的半胱氨酸等;军曹鱼MHC-Ⅱα与鼠、人及其它鱼类的氨基酸同源性在25.0%～69.5%之间。Real-time PCR检测结果显示,MHC-Ⅱα基因在正常军曹鱼组织中均有表达,但其表达量在各种组织中存在差异,其中较强表达于头肾、鳃,中等程度表达于脾脏、肠,在心脏、脑、肌肉中表达较弱;经LPS刺激后,头肾中MHC-Ⅱα基因表达下调。     

杜泊羊速激肽TAC1基因克隆及生物信息学分析

TAC1基因在哺乳动物神经系统中广泛表达,其编码蛋白参与季节性生殖活动的调节。该研究对杜泊羊速激肽(Tachykinin,TK)基因序列进行了克隆及生物信息学分析。结果表明:克隆出杜泊羊TAC1基因组序列,得到3个克隆片段。通过生物信息学分析,克隆片段一的长度为860 bp,经BLAST对比,与云南黑山羊第4号染色体相似度达93%,基因片段缺失4%;克隆片段二的长度为881 bp,经BLAST对比,与云南黑山羊第4号染色体相似度达100%,没有基因片段的缺失;克隆片段三的长度为846 bp,经BLAST对比,与云南黑山羊第4号染色体相似度达98%,没有基因片段的缺失,但有3个突变位点,分别为位于85 bp处的G/C突变、位于88 bp处和629 bp处的G/A突变、位于108 bp处和290 bp处的T/C突变。杜泊羊TAC1基因开放阅读框全长423 bp,共编码140个氨基酸。与Gen Bank已发表的其他动物TAC1基因参考序列进行比较,结果显示杜泊羊与绵羊、瘤牛、野猪、猕猴、人和大熊猫的TAC1基因同源性分别为98.9%、97.3%、88.1%、85.8%、85.0%、84.5%。通过蛋白质结构预测,发现杜泊羊TAC1基因编码蛋白没有跨膜结构域。     

真核表达载体构建表达ＰＲＶ闽Ａ株gE基因表位抗原编码区片段的重组质粒

根据伪狂犬病病毒闽Ａ株gE基因表位抗原编码区的序列与身份种真核表达载体pPICZaA、pAcGP67A序列与特性分别设计了两对ＰＣＲ引物。通过ＰＣＲ方法扩增到了两端具有不同酶切位点的gE基因表位抗原编码片段。将这２个片段分别克隆到pPICZaA与pAcGP67A载体，转化大肠杆菌ＴＯＰ１０菌档及ＸＬ１－Ｂlue菌株，获得了含伪狂犬病病毒闽Ａ株gE基因表位抗原编码区的重组质粒pICZaA-FS与pAcGP67A-FS。序测定结果显示两个重组质粒中插入片段的大小与方向均正确。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.     

新城疫病毒F蛋白抗原表位串联基因的构建及其原核表达

用自行设计的3对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因3段抗原表位区段,大小分别为81、108、105bp。应用添加互补性酶切位点的基因工程方法,将3段抗原表位基因片段拼接成多表位串联基因,大小为306bp。将此基因片段插入含组氨酸(His)基因的质粒pET-32-a中,构建了重组质粒pET-32-a-F306。经诱导表达,获得相对分子质量约为31000的融合蛋白,其中F蛋白抗原表位串联基因片段表达产物约为11000。经亲和层析,获得纯化His-F306融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗新城疫病毒F蛋白抗体。经过琼扩、ELISA及Western-blot检测,表明该融合蛋白中的抗原表位串联基因所表达的蛋白具有良好的抗原性。     

军曹鱼MHC-Ⅱα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

本研究根据其他鱼类MHC-Ⅱα基因的保守序列设计兼并引物,运用同源克隆和末端快速扩增方法扩增了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的全长cDNA序列,并对cDNA及其氨基酸序列进行了分析,比较了军曹鱼和其他物种的MHC-Ⅱα氨基酸序列的差异,分析了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的组织分布及经LPS刺激后头肾组织中MHC-Ⅱα基因的表达变化。结果表明,军曹鱼MHC-ⅡαcDNA全长998 bp,包括53 bp的5′末端非编码区(5′UTR)、234 bp的3′末端非编码区(3′UTR)及711 bp的开放阅读框(ORF),编码236个氮基酸,其蛋白质分子质量约为25.94 ku,等电点为4.39;军曹鱼MHC-Ⅱα蛋白质序列具有一些重要的特征,包括前导肽、α1、α2、CP/TM/CYT区和保守的半胱氨酸等;军曹鱼MHC-Ⅱα与鼠、人及其它鱼类的氨基酸同源性在25.0%~69.5%之间。Real-ti me PCR检测结果显示,MHC-Ⅱα基因在正常军曹鱼组织中均有表达,但其表达量在各种组织中存在差异,其中较强表达于头肾、鳃,中等程度表达于脾脏、肠,在心脏、脑、肌肉中表达较弱;经LPS刺激后,头肾中MHC-Ⅱα基因表达下调。     

新疆绵羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP2b的克隆与表达

表达新疆绵羊布鲁氏菌外膜抗原蛋白OMP3b的表达蛋白OMP2b，探索其作为诊断抗原和亚单位疫苗的可能性。采用PCR方法，从新疆绵羊布鲁氏菌基因组DNA中扩增出omp2b基因片段，将该片段克隆于原核表达载体PET-28a（＋），构建成重组质粒，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测。结果表明，获得长约1083bp的PCR片段，序列分析结果与已知绵羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP2b同源性达89.72％；SDS-PAGE检测表达产物，在相对分子质量39ku处有表达带。获得了新疆绵羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白omp2b基因片段，并在大肠杆菌中实现了表达。