抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用

 应用PCR检测方法 ,以大豆凝集素 (lectin)基因为内置标准 ,检测了抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4 EPSPS成分 ,并通过Southern杂交进一步证实了PCR检测结果的可靠性 ,建立了基于PCR的抗草甘膦转基因大豆检测方法 ,最低检测限度为 0 .0 5 %。用此方法检测转基因情况未知 ,分别来自欧盟、美国、阿根廷、未知国别的进口大豆及未知国别的进口豆粕 ,除从欧盟进口的大豆无CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4 EPSPS基因成分外 ,其余样品均含有上述成分 ;而从国内非转基因大豆中未检出上述成分。用此方法检测抗草甘膦大豆京引D1×豫豆 12的F2 和F2∶5群体植株 ,PCR检测结果与大田施药 (草甘膦有效成分 1.0kg·ha-1)检测结果一致率分别达 10 0 %和 93.0 %。     

转基因耐除草剂大豆及产品中外源成分检测方法的建立

分别从DNA和蛋白质2个水平上对转基因耐除草剂大豆及其产品的检测方法进行了研究．设计合成引物检测大豆内参照基因Lectin（大豆凝集素）及转基因抗除草剂Roundup Ready大豆外源基因,包括来自土壤细菌Agrobacterium tumefaciens株系CP4的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3phosphate synthase,EPSPS）基因、花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaicvirus,CaMV）35S启动子、胭脂碱合酶3’端的转录终止子（nopaline synthase,NOS）．应用优化的常规PCR方法,对大豆及其加工产品进行了检测,检测灵敏度可达0．1％．通过PCR方法从转基因大豆中扩增出CP4-EPSPS基因,在大肠杆菌中表达,利用表达的外源蛋白质作为抗原免疫家免,得到该蛋白质的多克隆抗体,并建立了一套基于蛋白质印迹杂交（western hybridization）的检测转基因大豆及其粗加工品的方法,其检测极限达到1％以下．此两方法互相配合,互相印证,有助于规范化转基因检测方法的建立．     

抗草甘膦转基因大豆基因漂移的研究Ⅰ大豆风媒介传粉的基因漂移研究

田间生殖隔离状态下,将野生大豆和栽培大豆种植在抗草甘膦转基因大豆周围,按固定距离收获。每年对一部分实施喷施高剂量草甘膦进行鉴定筛查,另一部分收获留待下年继续鉴定筛查。对每年连续筛查中存活植株提取DNA,进行对目的基因CP4-EPSPS的PCR检测,结果为阴性。初步判断在监测的三年时间内没有发现抗草甘膦转基因大豆通过风媒介使花粉传播,对田间大豆及其近缘种野生大豆产生明显的基因漂移。     

复合PCR方法检测抗草甘膦大豆MON89788

根据抗草甘膦大豆MON89788分子特征,选择大豆内源参照基因(Lectin)、玄参花叶病毒启动子(P-FMV 35S)、豌豆终止子(T-E93')和目的基因(CP4-epsps)4个基因作为复合PCR检测基因,其特异性引物序列参照国家相关标准,对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。最终建立了可同时检测除内源基因在外的3种外源基因复合PCR检测体系。     

转基因大豆及其深加工产品的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了从大豆及其深加工产品中检测转基因成分的方法。大豆及其深加工产品采用改良的CTAB法进行DNA提取纯化,大豆色拉油DNA则用试剂盒方法进行了提取纯化。对提取的DNA用PCR方法对大豆特异性内源基因lectin进行扩增,设计CaMV35启动子和NOS终止子特异性引物对其是否含有转基因成份进行初步的定性PCR筛选,并用抗除草剂基因CP4EPSPS对阳性结果进行确证。实验结果表明,改良的CTAB法对大豆深加工产品的DNA有很好的提取效果,而试剂盒方法对色拉油的DNA有良好的提取效果;PCR检测转基因的方法快速高效,检测结果与标准相符。     

大豆及腐竹中转基因成分的多重PCR分析

采用CTAB法提取大豆干样、新鲜毛豆及腐竹中的总DNA,内源LECTIN基因扩增结果均为阳性,表明提取到的DNA中不存在抑制PCR的物质.应用花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(NOS)终止子的二重PCR分析,筛选到7个含转基因成分的样品.半嵌套式PCR检测结果表明阳性样品中的外源目的基因为来自根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS基因.最后成功进行了扩增内源LECTIN基因、CaMV35S启动子和NOS终止子的三重PCR分析,以及内源LECTIN基因和EPSPS基因的二重PCR分析,得到预期结果.多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,在植物产品的转基因成分检测上具有重要的应用价值.     

多重PCR分析方法应用于转基因农作物的检测

以转基因大豆、水稻等样品为材料,采用多重PCR技术对转基因作物中常见的启动子、终止子、筛选标记基因和转入的目的基因等多个外源转基因元件进行检测,以期建立一套快速、准确、高效的转基因农作物筛查鉴定技术。通过多重扩增实验,建立了关于转基因大豆检测的大豆内源Lectin基因,花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS终止子的三重PCR分析体系,及关于转基因水稻检测的CaMV35S、NPTII和HPT基因的三重PCR分析的技术体系。并以大豆、水稻等农作物样品为检测材料,采用单一PCR和多重PCR技术同时进行检测,结果表明多重PCR方法具有快速、高效、简便、准确等特点,在转基因成分的检测上具有非常重要的实际应用价值和潜力。     

转基因抗草甘膦棉花及其对草甘膦抗性的时空表达

草甘膦是一种非选择性除草剂,它通过竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干扰芳香族氨基酸的生物合成而发挥毒性作用。虽然获得抗草甘膦棉花的途径有多种,但当前用于生产的抗草甘膦棉花主要是以CP4-EPSPS基因转化棉花获得的。草甘膦对转CP4-EPSPS棉花的营养生长没有不利影响,但4叶期后喷施草甘膦会显著降低花粉粒的活性,抑制散粉、授粉和结实,导致转CP4-EPSPS棉花对草甘膦抗性呈现出一定程度的时空变化。草甘膦对抗草甘膦棉花(雄性)生殖器官的抑制效应一方面源于草甘膦在生殖器官内的大量积累,另一方面在于CP4-EPSPS基因在(雄性)生殖器官的低效表达。促进CP4-EPSPS基因在全株高效表达是提高棉花对草甘膦抗性的重要途径。     

抗草甘膦转基因大豆的获得

大豆[Glycine max(L.)Merrill]是我国主要的粮食和油料作物,但近年来由于大量进口美国的转基因大豆,使我国的大豆生产严重萎缩。生物技术方法应用于改良大豆的农艺性状和产品质量以及对除草剂的耐受性,特别是对草甘膦的耐受性这一个重要性状。本研究以东农50为受体,采用农杆菌介导法,将抗草甘膦基因G10-EPSPS基因转入到大豆中,先后获得了3株T0代植株,在T0代进行抗性鉴定后,1株得到种子。试验通过对转基因后代的PCR检测、Western检测以及草甘膦抗性鉴定,证明外源基因已整合到植物基因组中,并在T0、T1和T2代稳定表达。本研究为转基因大豆育种提供了材料和数据。     

玉米转基因成分的检测

基于实时荧光PCR技术,通过构建阳性质控,对一种玉米样品进行多种转基因成分分析。首先,筛选出玉米样品中常见的外源转基因片段,构建阳性质粒并对阳性质粒进行验证;然后,对样品中可能含有的调控元件、目的基因以及筛选基因进行检测分析。实时荧光PCR检测结果表明,转基因玉米样品中含有2种启动子(pCaMV35S和pRice-Actin)、2种终止子(tNOS和tCaMV35S)、3种目的基因[Cry1A(c)、CP4-EPSPS和CTP2-CP4-EPSPS]以及1种筛选基因(PMI)。因此所检测的玉米样品中含有多种转基因成分,推测其转基因玉米样品含有多种转基因玉米品系。