LeWRKY2基因的克隆及功能分析

【目的】克隆番茄WRKY2转录因子,为研究番茄抗病反应的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】根据克隆出的番茄LeWRKY2基因特异片段（GenBank登录号：EU755368.1）,运用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cNDA ends,RACE）技术克隆番茄LeWRKY2 cDNA全长,并用生物信息学的方法对其进行分析。用实时荧光定量PCR方法检测番茄经JA、番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、放线菌酮（cycloheximide）刺激时LeWRKY2基因的表达情况。【结果】①从番茄中克隆到一条全长为1 007 bp的cDNA序列,命名为LeWRKY2基因,阅读框471 bp,编码156个氨基酸。②LeWRKY2蛋白含有1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构,可能具有转录、转录调控、信号传导功能。③100 μmol•L-1 茉莉酸（jasmonic acid,JA）刺激番茄幼苗0-60 min时,LeWRKY2基因的相对含量与JA刺激时间成正比;而刺激60-150 min时,LeWRKY2基因的相对含量与JA刺激时间成反比;④番茄灰霉菌可以诱导LeWRKY2基因的的表达,且在4 h时表达量达到最高;⑤LeWRKY2基因的转录产物的合成不依赖于蛋白质的从头合成。【结论】LeWRKY2是一种参与番茄防御反应的早期快速反应基因。     

小麦TaGA20ox2基因的克隆及分析

 【目的】克隆小麦中的GA20-氧化酶基因并进行遗传定位,为深入研究小麦中的GA20-氧化酶基因作用机理奠定基础,同时为改良小麦的重要农艺性状提供理论依据。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,利用中国春缺失体以及国际作图群体对该基因进行遗传定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaGA20ox2的gDNA与cDNA序列,利用中国春缺失体材料将TaGA20ox2定位于3A、3B、3D染色体上,序列分析表明分别位于3A、3B、3D染色体上的TaGA20ox2-A1、TaGA20ox2-B1和TaGA20ox2-D1与水稻GA20ox2为直向同源基因,具有GA20ox2家族保守结构域;利用国际作图群体W7984×Opata85将位于3D上的基因TaGA20ox2-3定位于xfba330与xgwm664标记之间。【结论】分离获得小麦中分布于第三同源群的GA20ox2;分子标记结果结合QTL作图信息可以初步推测TaGA20ox2-3在小麦中可能是控制株高的基因。     

菊花CmETR2基因的克隆及功能分析

[目的]本文旨在通过克隆菊花中的乙烯受体基因(CmETR2),分析其表达特征并转入拟南芥中对其调控开花的功能进行研究。[方法]以菊花品种‘神马’为试验材料,克隆CmETR2全长序列,与其他物种进行同源性比对分析,利用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的相对表达量,以及其对外源乙烯处理后的响应变化。将CmETR2超表达转入拟南芥中,观察其对拟南芥开花时间和莲座叶片数的影响,分析转基因拟南芥中开花相关基因的表达量变化。[结果]克隆获得的CmETR2基因开放阅读框(ORF)全长为2 292 bp,编码氨基酸763个。系统进化分析表明,该基因编码的蛋白与向日葵的ETR3(XP_022030036.1)和刺菜蓟的ETR2-like(XP_024986908.1)亲缘关系最近。组织特异性定量表达分析结果表明,CmETR2在菊花营养生长期间茎和叶中表达量最高,生殖生长期间管状花和根中的表达量较高。亚细胞定位结果表明,CmETR2定位在细胞膜上。外源乙烯处理后3 h CmETR2基因表达量最高。CmETR2超表达植株的开花时间比野生型拟南芥晚3～4 d,开花时莲座叶片数比野生型拟南芥多3片左右。CmETR2超表达植株对乙烯的敏感性增强并表现出更明显的三重反应。在CmETR2超表达植株中,促进开花的基因AtGI、AtSPL3和AtFD在CmETR2超表达植株中的表达量较野生型下降,抑制开花的基因AtFLC和AtTFL在CmETR2超表达植株的表达量上调。[结论]本研究克隆得到菊花CmETR2基因具有延迟拟南芥开花的功能。     

百子莲赤霉素受体基因ApGID1全长的克隆及功能分析

为揭示赤霉素(gibberellin,GA)对根茎类花卉百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)生长发育的调控机制,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得百子莲GA受体基因GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1(GID1)全长cDNA,命名为ApGID1。该基因cDNA全长为1 629bp,其中5’非编码区(untranslated region,UTR)372bp,3’端UTR 213bp;编码区全长为1 044bp,共编码347个氨基酸;结构预测显示,ApGID1蛋白由8条β-折叠和7个α-螺旋组成袋状结构域,能够与GA分子结合。推导的ApGID1蛋白氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hisutum)具有较高的同源性,可达71.8%。系统进化表明,百子莲与单子叶植物小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)和玉米(Zea mays)聚为一类,与双子叶植物进化关系较远。ApGID1基因在根、茎和花药中表达量高。亚细胞定位显示ApGID1是核蛋白,是GA信号通路的重要组成部分。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达ApGID1可促进开花和株高建成。     

小麦PLT2基因的克隆及功能分析

盐胁迫是影响小麦产量的主要原因之一,通过筛选耐盐新基因培育耐盐新品种对保障我国粮食安全具有重要意义.本研究从青麦6号盐胁迫转录组中挖掘到TaPLT2基因,对其进行生物信息学分析,并以黄淮麦区72个冬小麦品系为材料,研究TaPLT2基因多态性与耐盐性的关系,挖掘优异等位变异,为耐盐分子育种储备基因资源.结果表明,TaPL...     

甜菜夜蛾双重氧化酶基因SeDuox的克隆、表达及功能分析

【目的】昆虫双重氧化酶（dual oxidase,Duox）介导产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）是调节昆虫肠道微生物动态平衡的重要免疫机制。本研究通过分析甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）双重氧化酶基因（SeDuox）的序列特征与表达模式,RNAi技术探究SeDuox基因沉默对甜菜夜蛾肠道细菌载量的影响,分析SeDuox对苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）的免疫响应,从而明确SeDuox在昆虫肠道免疫调控中的作用,为甜菜夜蛾的综合防控提供新的思路和作用靶标。【方法】利用反转录PCR（RT-PCR）技术克隆SeDuox,序列特征进行生物信息学分析,采用ClustalX和MEGA_X软件构建系统发育树;克隆SeDuox膜外91—1 767 bp编码基因SeDuox-OM,利用Bac to Bac表达系统构建Bacmid-SeDuox-OM,脂质体转染法转染昆虫细胞Sf9,表达SeDuox-OM膜外蛋白;采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法分析甜菜夜蛾不同组织（围食膜、血淋巴、脂肪体、马氏管、中肠和表皮）和不同发育时期（卵、1—5龄幼虫、雌蛹、雄蛹）SeDuox的表达水平;利用RNAi技术进行功能分析,向4龄幼虫注射SeDuox的dsRNA,以注射绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的dsRNA作为对照,注射48 h和72 h后检测基因沉默效果及肠道细菌载量的变化;向甜菜夜蛾幼虫饲喂Bt,RT-qPCR方法分析SeDuox及相关免疫基因的诱导表达情况。【结果】SeDuox序列全长为4 497 bp,编码1 498个氨基酸,预测蛋白质的相对分子量为171.62 kD。SMART分析结构域发现SeDuox含有过氧化物酶结构域（peroxidase）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结构域（NAD）、N-端钙离子结合域（EFH）、铁还原酶结构域（Ferric）和黄素腺嘌呤二核苷酸结构域（FAD）,与斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）等昆虫的Duox结构域类似。TMHMM分析显示有7个跨膜区,跨膜片段SeDuox-OM 在昆虫细胞中成功表达约80 kD的重组蛋白;RT-qPCR分析结果显示SeDuox在甜菜夜蛾4龄幼虫不同组织中均有表达,其中围食膜和中肠表达量较高;在不同发育时期均有表达,但在卵期表达量最高。与注射dsGFP相比,注射 dsSeDuox 的甜菜夜蛾幼虫在48 h和72 h时,SeDuox表达量分别下调了62.08%和74.94%,肠道微生物载量显著升高。甜菜夜蛾幼虫取食Bt GS36 48 h时,SeDuox表达量显著增加,随着侵染时间的延长,其表达量呈现出先升高后降低再趋于稳定的特点。【结论】甜菜夜蛾SeDuox具有保守的结构域,在中肠和围食膜中高表达,SeDuox在宿主肠道免疫调控中起重要作用,可能与抗菌肽基因协同作用抵御Bt的侵染。     

葡萄赤霉素合成关键基因VvGA20ox2的克隆、亚细胞定位和表达分析

本研究建立在对金手指葡萄果形转录组分析的基础上,通过分析样品间表达差异发现,与对照相比,GA20ox2基因的转录水平在GA3处理后有显著差异。为了进一步从分子水平阐述GA20ox2在赤霉素合成途径中的作用机理,本研究以金手指葡萄幼果为材料,克隆了GA20ox2基因,分析了此基因碱基序列特征,并通过构建融合表达载体对其进行亚细胞定位分析。研究结果表明,克隆了葡萄赤霉素合成途径中的VvGA20ox2基因,测序得CDS全长为1 134 bp,编码377个氨基酸。VvGA20ox2编码的氨基酸序列与NCBI上其他物种GA20ox序列相似性在51%～67%,其中该基因与可可(EOX92603.1)和杨树(PNT28192.1)的亲缘关系较近。该基因定位在细胞核和细胞膜中。外源GA3处理后的成熟葡萄果实与对照相比纵径显著伸长,且在幼果中该基因表达量在一段时间内明显上升,推测VvGA20ox2基因可能参与葡萄果形拉长的调控。     

苹果U6启动子的克隆及功能分析

【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果（Malus×domestica）上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA（E-value<3e ^-40）,分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作为候选U6启动子。序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件（Upstream sequence element,USE）和TATA-Like box。瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子（长度分别为1 500、959、275和116 bp）中275 bp的启动子活性最强。另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子。【结论】从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子。     

油菜FAD2 基因的克隆与功能分析

油酸去饱和酶FAD2基因催化C18∶1脂肪酸脱氢生成C18∶2脂肪酸,直接决定了油料作物的油脂品质,同时对植物的抗冻能力至关重要。通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种"中双9号"中克隆了Bn FAD2基因的全长c DNA序列,该基因编码一个长384aa的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子量44.2 ku,等电点p I值为8.54,对应的基因组序列无内含子。使用荧光定量RT-PCR发现它在种子发育到25 d时转录水平最高;使用生物信息学手段发现该蛋白具有6个跨膜区,定位在内质网膜上,不含信号肽。将该基因克隆到植物转基因载体p BILP2PTNap中,通过农杆菌LBA4404介导转化了拟南芥fad2基因突变体,使其在种子中超量表达,共获得20株转基因阳性植株。使用气相色谱法比较野生型植株、突变体植株、转基因阳性植株种子中脂肪酸的组成成分,结果发现转基因前后,种子中油酸(C18∶1)的含量从53.8%降低到12.4%~34.1%,亚油酸(C18∶2)含量从2.9%提高到11.5%~62.7%,说明这些转入的Bn FAD2基因在不同植株中均能不同程度地互补fad2突变体的表型,证明克隆得到的油菜Bn FAD2基因具有完整的催化功能。     

SbGA20ox1·SbGA20ox3和SbGA2ox3基因对高粱品种赤霉素表达水平的影响

[目的]研究SbGA20ox1、SbGA20ox3和SbGA2ox3基因对高粱品种赤霉素表达水平的影响。[方法]以不同高粱品种为试材(9544.7057为父本与不同母本进行杂交得到子代:辽夏梁1号、辽2297、辽2697、辽5397、01-26B;以及01-26A为母本与不同父本进行杂交得到子代:辽杂35、0-01、9544.7057、3550、辽2697),利用实时荧光定量PCR技术比较不同时期(拔节期、抽穗期、成熟期),不同品种的高粱之间SbGA20ox1基因、SbGA20ox3基因、SbGA2ox3基因表达含量规律。[结果]SbGA20ox1基因在同一父本不同母本高粱组的基因表达规律基本符合抽穗期>成熟期>拔节期;SbGA2ox3基因在同一父本不同母本高粱组的基因表达规律基本符合抽穗期>成熟期>拔节期,SbGA2ox3基因在同一母本不同父本高粱组的基因表达规律基本符合拔节期>成熟期>抽穗期。而SbGA20ox1基因在同一母本不同父本高粱组的基因表达以及SbGA20ox3基因在各品种高粱的基因表达并未发现明显规律,各时期基因的相对表达量大部分品种...     

‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆与功能分析

【目的】 对DkGAI2的亚细胞定位及表达特性进行分析,并将DkGAI2转化烟草,分析转基因烟草的生理和形态指标,为GAI的深入研究提供理论基础。【方法】 以‘南通小方柿’高通量转录组测序结果中标注的GAI2为原始序列（未发表）,利用RT-PCR,3′ RACE和5′ RACE技术从‘南通小方柿’中克隆得到DkGAI2的序列全长。利用生物信息学分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析DkGAI2在‘大方柿’及‘南通小方柿’5个不同物候期的表达特性以及DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中的表达特性,构建瞬时表达载体pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2,并瞬时侵染烟草分析DkGAI2的亚细胞定位,通过构建DkGAI2植物双元表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经过GUS染色、RT-PCR对转基因烟草株系进行鉴定;并将野生型和转基因烟草移栽,于第一朵花开放时测定转基因植株的株高、节间长度、叶片长宽比以及GA₁和GA₄含量。【结果】 从‘南通小方柿’中克隆得到了1 827 bp的DkGAI2,DkGAI2核苷酸序列与猕猴桃（KF588651.1）、光皮烨（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、苹果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的相似度达72%-80%,DkGAI2具有DELLA蛋白家族特有的DELLA结构域,属于DELLA蛋白基因家族。DkGAI2编码608个氨基酸,相对分子质量为66.5 kD,理论等电点为5.54,不稳定系数为50.41,无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽。序列系统进化分析结果显示,DkGAI2与葡萄亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量都高于‘大方柿’;DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中表现出组织表达特异性,其中,在老叶中表达量最高,其次为茎尖和幼叶,而在幼果中几乎不表达。pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白的绿色荧光信号位于细胞核中,表明DkGAI2编码蛋白位于细胞核。经过GUS染色和RT-PCR检测,共获得5个转DkGAI2烟草株系,转基因烟草叶片GA₁含量增加,GA₄含量降低,GA₁和GA₄总含量降低,且转基因烟草植株出现植株矮化、节间缩短、叶片长宽比降低及花期延迟的表型。【结论】 DkGAI2具有组织表达特异性,定位于细胞核,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量均高于‘大方柿’。推测DkGAI2可能通过降低GA₄的含量进而引起植株矮化。     

花生抗病基因的克隆及功能分析

课题目标、内容：利用基因芯片技术和构建cDNA差减杂交文库分离黄曲霉抗性相关基因,获得黄曲霉抗性相关的ESTs和干旱胁迫诱导差异表达的ESTs30～50条,并在GenBank注册。     

大豆水杨酸结合蛋白基因GmSABP2的克隆及功能分析

【目的】对大豆（Glycine max）水杨酸结合蛋白基因GmSABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为GmSABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因GmSABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在盐和干旱处理条件下GmSABP2的表达特性。利用Gateway技术构建植物表达载体pEarleyGate103-GmSABP2,转入根癌农杆菌EHA105,利用蘸花法侵染拟南芥,经抗性筛选得到转基因株系。对野生型植株和转基因植株进行盐和干旱胁迫处理,并统计在胁迫条件下两者的种子萌发率、主根长和成熟植株的存活率。【结果】克隆得到GmSABP2的cDNA序列,序列全长1 235 bp,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸,分子量为29.15 kD,等电点为5.58。氨基酸序列比对发现大豆和毛白杨、可可以及烟草相似度较高。利用NCBI的CD-search发现大豆SABP2序列中存在一个Abhydrolase_6（pfam：12697）水解酶保守结构域。大豆SABP2蛋白属于α/β水解酶超家族。应用MEGA程序构建多物种的系统发生树,发现大豆和毛白杨及可可亲缘关系较近,而与拟南芥亲缘关系较远。对大豆幼苗胁迫后的表型分析发现,在盐和干旱条件下大豆幼苗均受到明显的胁迫效应。Real time-PCR分析表明大豆幼苗叶子中的GmSABP2在盐和干旱处理条件下均上调表达。拟南芥耐逆性分析发现,在正常培养条件下,野生型植株和转基因株系均能正常萌发、生长。在高盐（150 mmol·L^-1 NaCl）处理条件下,野生型植株的种子萌发率为38%,12 d大小幼苗主根长为0.4 cm,成熟植株的存活率为49%;转基因株系的种子萌发率为67%,12 d大小幼苗主根长为1.1 cm,成熟植株的存活率为78%。在模拟干旱（20% PEG6000）处理条件下,野生型植株的种子萌发率为31%,12 d大小幼苗主根长为0.5 cm,成熟植株的存活率为36%;转基因株系的种子萌发率为57%,12 d大小幼苗主根长为1.0 cm,成熟植株的存活率为66%。【结论】GmSABP2在拟南芥植株对盐和干旱的抗性中有一定的作用。     

茶树CsAS1和CsAS2基因的克隆及功能分析

叶片是植物进行光合作用等代谢过程的重要场所,所以对其形态建成及发育过程的研究非常重要. AS蛋白能够参与叶片极性建立的调控,但关于茶树AS蛋白的研究还较少.本研究从“福鼎大白茶”茶树中克隆获得了2个AS蛋白基因：CsAS1和CsAS2,编码蛋白长度分别为344 aa和229 aa,理论等电点分别为10.04和7.36,分别分布在第4和10号染色体上,均定位于细胞核;系统进化树和保守结构域分析表明,CsAS1和CsAS2蛋白间氨基酸序列和空间结构高度保守,且分别与葡萄和水稻的AS蛋白亲缘最近;CsAS1和CsAS2在茶树中的表达模式分析显示,CsAS1基因在茶树芽中的表达量最高,CsAS2基因在茶树根中的表达量最高,且CsAS1和CsAS2基因在茶树一芽二叶中的表达量均受到外源IAA和GA₃的诱导表达;启动子元件和转录组数据分析结果显示,CsAS1和CsAS2基因启动子序列中均含有多个非生物逆境胁迫响应的元件,且受到不同逆境胁迫的抑制或诱导表达.综上所述,CsAS1和CsAS2基因可参与茶树叶片的形态建成及非生物逆境胁迫的响应过程,可为进一步研究CsAS1和CsAS...     

欧美杨PdPP2C基因的克隆与功能分析

欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。PdPP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受NaCl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转PdPP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明PdPP2C基因作为一种蛋白磷酸酶提高了拟南芥的抗逆性。      

肠杆菌20yhhs基因的克隆及功能分析

利用基因工程方法培育草甘膦抗性作物,是当前利用草甘膦的主要途径,然而,优良草甘膦抗性基因资源的缺乏是限制抗草甘膦转基因作物发展的限制因素,挖掘新型草甘膦抗性基因资源势在必行。极端环境微生物是分离重要功能基因的资源库。研究分离获得了一株高抗草甘膦菌株肠杆菌20,为解析其高抗草甘膦胁迫的分子机制,基于非靶位点草甘膦抗性机理,利用原核表达系统鉴定了其草甘膦离子转运相关基因yhhs的功能,进而对肠杆菌20耐受高度草甘膦胁迫的分子机制进行了讨论。     

蝗虫节律基因pdp的克隆及功能分析

[目的]研究不同条件下蝗虫（Locusta migratoria）节律基因pdp（Pyruvate dehydrogenase phosphatase）的mRNA表达水平,进一步揭示蝗虫节律的分子机制。[方法]通过中国科学院动物研究所内的转录组数据库中找出pdp基因的原型来设计引物,以群居型东亚飞蝗的头部的反转录cDNA为模板,克隆出pdp基因的全序列。把一天24 h等分成8个点,进行定时取样,以qRT-PCR技术进行不同时段pdp基因表达量的测定;并在不同处理条件下。测定pdp基因的表达量。[结果]节律基因pdp在蝗虫的不同处理条件下变化不大。[结论]该研究对了解飞蝗节律规律、种群特点及有效防虫具有重要的现实意义。     

猪尿酸氧化酶基因的克隆及表达

本研究主要涉及猪尿酸氧化酶(urate oxidase,EC 1.7.3.3)的原核表达载体的构建及蛋白表达,并对其酶活性进行测定。从猪肝组织细胞中提取总的RNA,利用RT-PCR技术克隆pUOX(porcine urate oxidase),插入原核表达载体pET-22b中,构建重组表达载体pET-22b/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。通过IPTG诱导获得的重组蛋白经SDS-PAGE检测,在约34 ku处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致。测定该重组蛋白的酶活力达到1.962 U,这为后期实验奠定了重要的基础。     

紫花苜蓿MsCIPK2的克隆及功能分析

【目的】CIPK是植物响应逆境胁迫信号通路中一类重要的蛋白激酶,可与CBL形成CBL-CIPK复合物,启动细胞内相关应答基因的表达而应对各种非生物胁迫。发掘并研究紫花苜蓿MsCIPK基因响应非生物胁迫的分子机理,有助于揭示紫花苜蓿抗逆生物学基础,为紫花苜蓿抗逆育种提供新的基因资源。【方法】通过PCR技术克隆MsCIPK2,使用生物信息学工具分析基因序列,利用qRT-PCR技术分析MsCIPK2,以及与其互作的4个CBL基因（MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10）在紫花苜蓿各组织中的表达水平,在烟草叶片表皮细胞中,瞬时表达pCAMBIA1302-GFP-MsCIPK2融合表达载体,通过激光共聚焦显微镜观察进行亚细胞定位,利用酵母双杂交技术分析MsCIPK2与4个MsCBLs蛋白互作情况,利用发根农杆菌诱导紫花苜蓿产生过量表达MsCIPK2的毛状根,利用qRT-PCR技术分析转基因毛状根株系中相关基因的表达水平。【结果】通过PCR扩增获得MsCIPK2片段,该基因CDS为1 230 bp,编码409个氨基酸,具有典型的CIPK家族的ATP结合位点、激活环、NAF motif和PPI motif等结构域。MsCIPK2在紫花苜蓿根中表达量最高,在花中表达量最低。亚细胞定位结果显示,MsCIPK2蛋白定位于内质网。酵母双杂交试验结果显示,MsCIPK2蛋白与MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10蛋白具有相互作用,且与MsCBL10蛋白相互作用较强。MsCBL2、MsCBL6和MsCBL10在紫花苜蓿根中表达量最高,MsCBL7在荚中表达量最高。qRT-PCR结果表明,过量表达MsCIPK2的毛状根中响应非生物胁迫基因ATPase、P5CS、CYP705A5、COR47、HAK5和RD2的表达量均明显上调。在200 mmol·L^-1 NaCl和20%PEG处理条件下,与对照相比,过量表达MsCIPK2毛状根的丙二醛含量降低,SOD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量增高。【结论】紫花苜蓿MsCIPK2与MsCBLs蛋白互作,主要在根中表达并响应盐和干旱胁迫,过量表达MsCIPK2可以提高紫花苜蓿的耐盐性和耐旱性,MsCIPK2可作为提高紫花苜蓿抗逆育种的候选基因。