内蒙古羊源细粒棘球蚴Eg95基因原核表达及蛋白鉴定

在克隆内蒙古羊源细粒棘球蚴疫苗候选基因Eg95的基础上,构建原核表达载体pET-Eg95并转化E.coli BL21(DE3),优化表达体系,获得Eg95纯化蛋白.将Eg95基因从克隆质粒pMD19-T-Eg95亚克隆到原核表达载体pET44a(+)上,构建原核表达载体pET-Eg95,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,优化表达条件.纯化的 Eg95 融合蛋白经 SDS-PAGE和Western Blot鉴定其正确性和免疫学活性.原核表达载体pET-Eg95在大肠杆菌中高效表达,优化的原核表达条件为:当菌液OD600值为0.6时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,37℃,振荡培养5 h.纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定为目的蛋白并具有生物学活性.原核表达载体pET-Eg95构建正确并可高效表达可溶性Nus-Eg95融合蛋白,可作为特异性抗原应用于免疫印迹法检测血清抗体.     

欧李ChIRT1基因的克隆与生物信息学分析

欧李(Cerasus humilis)是蔷薇科矮生灌木,果实中的钙、铁等营养物质丰富.铁调转运基因1(IRT1)编码的蛋白是ZIP金属转运家族中主要的铁转运蛋白,负责植物中金属离子的转运,尤其是铁的吸收.本研究从欧李叶片中提取RNA,逆转录得到cDNA;参照小金海棠(Malus xiaojinensis)MxIRT1基...     

草原樱桃PGIP基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆草原樱桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因,并进行生物信息学分析。以草原樱桃叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列设计引物,通过PCR扩增获得约1 kb的DNA片段。序列分析表明,该基因全长1 193 bp,包含有1个完整的开放阅读框,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长990 bp,编码330个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列,GenBank登录号为GU068977;该基因与中国李、杏、桃、马哈利樱桃、梅等李属植物的PGIP基因序列一致度达95%～99%。系统进化分析显示,属内亲缘关系较近、属间亲缘关系较远的特点。克隆了草原樱桃PGIP基因,为樱桃抗病育种提供一条新的基因资源。     

甘蓝型油菜BnAPX1基因的克隆与生物信息学分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种利用抗坏血酸作为电子供体的H₂O₂清除剂,在植物抵御逆境胁迫中起到重要作用。为进一步探究甘蓝型油菜APX1基因的功能,本研究通过RT-PCR法从甘蓝型油菜中克隆得到一条长度为753 bp的APX1 CDS序列,将其命名为BnAPX1。生物信息学分析表明,BnAPX1基因共编码250个氨基酸,相对分子量为27.546 14 kD,等电点为5.49,不稳定系数为36.73,属于稳定性蛋白;该蛋白的二级结构中无规则卷曲为42.00%,α-螺旋为39.20%,延伸链为10.40%,β-转角为8.40%;亚细胞定位预测结果显示该基因编码的蛋白位于过氧化物酶体中,其编码的蛋白没有跨膜结构,没有信号肽,属于非分泌蛋白。BnAPX1蛋白含有K+binding site、Substrate binding site、Heme binding site结合位点,属于植物过氧化物酶类似家族。     

稗草EcHPPD基因的克隆及生物信息学分析

旨在克隆稗草对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)基因为探究其基因功能提供基础,从而更好地开发除稗剂。以稗草叶片为材料,用同源克隆和c DNA末端快速克隆(RACE)技术克隆Ec HPPD基因序列,用生物信息学软件分析其特征。Ec HPPD基因的编码序列全长1317 bp,其编码蛋白质由439个氨基酸组成,相对分子质量为46.659 k D,等电点为5.30。稗草与同处禾本科的Dichanthelium oligosanthes(OEL23409.1:8-249)的HPPD蛋白进化程度最为相近。Ec HPPD三级建模蛋白结构由两条链构成,有2个Fe²⁺结合位点,并能与吡唑特活性中心骨架通过氢键相互作用。Ec HPPD可能与HGO、HPT1、TAT3、AT5G36160、TAT7等11个蛋白产生互作。本研究报道了Ec HPPD基因序列并对其进行了生物信息学分析,为创制新的HPPD抑制剂提供理论依据。     

羔羊棘球蚴病的诊疗

<正>2013年8月20日,驻马店市泌阳县某羊场的20只羔羊有5只发病,出现以消化机能障碍、呼吸困难和渐进性消瘦等为特征的疾病,用抗生素、抗病毒类药物治疗3天,效果不佳,羔羊的发病数和死亡数逐渐增加,于25日来驻马店市动物疫控中心就诊。根据流行病学调查结果、临床症状和病理变化,初步诊断为羔羊棘球蚴病,及时进行治疗,使病情得到控制。1.临床症状     

桑葚MaMYB44基因的克隆与生物信息学分析

本研究对桑葚(Morus alba L. cv.‘Cheongil’) MaMYB44转录因子进行了生物信息学等的研究,首先对桑葚中MaMYB44基因进行克隆。通过生物信息学分析,发现MaMYB44基因长度为720 bp,编码239个氨基酸,分子质量为58 215.61 Da,理论等电点5.10;通过分析桑葚蛋白MaMYB44的疏水性可知,其中的氨基酸呈现疏水性;通过桑葚MaMYB44蛋白进行跨膜区分析表明,Ma MYB44所有氨基酸都在细胞膜外,无跨膜结构,所以并不是跨膜蛋白;即使有信号肽结构的存在,但是螺旋结构并不存在;然后构建植物表达载体,获取阳性质粒,亚细胞定位后显示MaMYB44基因定位于细胞核中;进一步RT-qPCR分析得出结果,MaMYB44基因在茎中的表达量最高,其次是果实、叶、根。可初步推测该基因主要在桑葚茎中表达并行使功能。     

黄瓜CsPYCR的克隆及生物信息学分析

本研究以黄瓜低霜霉威残留品系‘D0351’为材料,克隆了在霜霉威胁迫后上调表达的基因Cs PYCR,并采用生物信息学方法对该基因进行分析,以明确该基因在降低黄瓜果实内霜霉威残留过程中的作用机制,为下一步通过遗传转化试验鉴定基因功能提供理论基础。结果表明：该基因全长831 bp,编码276个氨基酸,属于PLN02688蛋白家族。该基因编码的蛋白质有可能为细胞质中的疏水蛋白质,无明显信号肽,无跨膜结构。与甜瓜(XM＿008457466.2)同源性较高。该基因启动子中包括与乙烯、脱落酸等激素相关的顺式作用元件以及防御和应激反应相关的顺式作用元件,且含有多个与逆境胁迫相关的MYB家族蛋白转录因子结合位点,推测其可能在降低黄瓜霜霉威农药残留过程中发挥重要作用。     

蓖麻GST的基因克隆及生物信息学分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是谷胱甘肽结合反应的关键酶,催化谷胱甘肽结合反应的起始步骤,主要存在于胞液中,有多种形式,其在病理学上有一定的重要性。本研究通过克隆GST基因以及对其进行相关的生物信息学分析。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增该基因,经分析该基因可编码219个氨基酸,并且通过相关分析得到这219个氨基酸组成的蛋白为稳定的亲水性蛋白,有一个明显的区段存在信号肽,在该蛋白中α-螺旋和无规则卷曲是主要的二级结构方式,根据序列同源比对,蓖麻、麻疯树和榴莲聚类到一起,说明相对于其他物种,它们的同源性较高。这些分析结果为蓖麻谷胱甘肽S-转移酶生物合成及其功能的进一步研究提供一定的理论与实践依据。     

山胡椒LgCMK基因克隆与生物信息学预测分析

CMK是MEP途径中的第四个关键酶,对于萜类合成代谢具有重要的影响。本研究基于实验室前期获得的山胡椒果实的转录组数据,经过注释筛选出CMK基因,首次从山胡椒中克隆得到萜类生物合成关键基因LgCMK并对其生物信息学预测分析。结果显示:LgCMK基因的开放阅读框为1 221 bp,编码406个氨基酸,分子量为44.78 k D,理论上等电点为6.26,属GHMP蛋白超家族。对Lg CMK蛋白的氨基酸序列理化性质进行分析,发现蛋白亲水性指数为-0.332,不稳定性指数为41.77,属于亲水性不稳定蛋白;亚细胞定位预测结果显示该蛋白定位于叶绿体中。同源性和系统进化分析结果表明,与香樟、博落回和罂粟同源蛋白相似度较高分别为96.8%、75.96%和73.0%,不同物种的CMK具有较近的亲缘关系,与香樟同属一支,亲缘关系最近。通过本研究生物信息学分析将有助于对LgCMK深层次功能探究提供借鉴作用,同时为山胡椒的种质改良提供基因资源。     

枸杞LbCO基因的克隆与生物信息学分析

CONSTANS(CO)基因是高等植物叶片中光周期途径的关键成分,生物钟及光信号控制CO基因的表达。本研究以宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)品种之一‘宁杞7号’叶片为实验材料,通过转录组测序结果筛选,利用RT-PCR技术扩增得到‘宁杞7号’的CO基因cDNA全长序列,命名为LbCO。利用生物信息学手段对所获得的序列进行结果及功能预测,结果显示:LbCO基因的cDNA序列全长1224 bp,编码407个氨基酸,分子质量为44.83 k D,理论等电点pI=5.58,不稳定指数为39.66,是一种稳定的非分泌蛋白。该蛋白亚细胞定位于细胞核,二级结构中无规则卷曲占比最高(54.48%),其次为α-螺旋(28.99%)。系统进化分析表明枸杞LbCO蛋白与其它物种的CO蛋白具有较高的同源性,其中与辣椒属CO蛋白亲缘关系最近。本研究为后续进一步探讨该基因编码的蛋白在调控枸杞花期研究方面提供理论参考。     

毛竹中黄酮-C-糖基转移酶基因的克隆和生物信息学分析

糖基转移酶是催化黄酮糖苷形成的关键酶。黄酮糖苷类化合物具有抗氧化、清除自由基、调节血脂和血糖等生理作用。基于毛竹基因库测序的完成,本研究通过RT-PCR技术首次获得一条完整的毛竹黄酮-C-糖基转移酶基因开放阅读框,将其命名为PeCGT,其基因的序列长度是1342 bp。对其编码蛋白的理化性质、保守结构域以及二级结构和空间结构等进行了生物信息学分析。结果表明:PeCGT基因编码的蛋白含有447个氨基酸,分子量是47.76 kD,理论等电点为4.91,酸性氨基酸(Asp+Glu)个数为54,碱性氨基酸(Arg+Lys)个数为35。PeCGT蛋白是疏水型蛋白,不存在信号肽,存在于线粒体中。结构域预测分析结果表明,PeCGT编码的氨基酸序列具有明显的糖基转移酶特征的保守域结构PSPG。通过同源性分析,其与乌拉图小麦(Triticum urartu)、节节麦(Aegilops tauschii subsp.Tauschii)和二穗短柄草(Brachypodium distachyonhiihii)具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明:PeCGT基因在叶中的表达量最高,在根中几乎不表达,在茎中有部分表达。此研究结果为以后毛竹黄酮-C-糖基转移酶的表达和功能鉴定提供了一定的帮助。     

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。     

中间锦鸡儿WRKY12基因克隆与生物信息学分析

WRKY转录因子是植物信号网络中不可缺少的部分,是最大的调节子家族之一。本研究从中间锦鸡儿干旱转录组及基因表达检测数据中,挑选出对干旱、冷、盐、碱及ABA都响应明显的CiWRKY12基因,对其进行克隆及生物信息学分析。结果显示:CiWRKY12基因的开放阅读框为696 bp,编码232个氨基酸,含有一个典型的WRKY保守结构域,属于GroupⅡc亚族。对转录因子CiWRKY12与其它8种植物的同源蛋白的理化性质和一、二、三级结构进行生物信息学比较分析,发现这9个蛋白无规则卷曲比例较高,大部分属于不稳定蛋白;亚细胞定位预测表明大部分的蛋白定位于细胞核内;多重序列比对显示WRKY保守结构域保守性很高,其三级结构上也呈现较高的相似性,推测这9个转录因子可能具有相似的转录调控功能。通过本研究生物信息学分析将有助于对CiWRKY12深层次功能研究提供借鉴作用。     

鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆及生物信息学分析

为了解GM-CSF的基因及蛋白质特性,本研究以pUC-GM-CSF为模板,根据GenBank中登录的GM-CSF序列设计引物扩增GM-CSF基因,随后将其克隆至 pMD18-T载体,并对鉴定正确的重组质粒 pT-GM-CSF进行测序分析,然后对GM-CSF基因进行同源性分析、ORF分析、氨基酸序列分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、亚细胞定位分析及二级结构预测。结果表明：该基因ORF的全部长度为453 bp,能够编码150个氨基酸,并且在GM-CSF基因所编码的蛋白质中有4个丝氨酸和3个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。同时,GM-CSF蛋白的最大疏水性为2.267,且有8.91%的可能位于细胞外,有0.8%的可能位于细胞壁,有0.24%的可能位于细胞质。同时,该蛋白质的二级结构主要由无规卷曲、α螺旋和延伸链构成。本研究通过对GM-CSF基因进行生物信息学分析,为探究其免疫增强机制奠定基础。     

蓖麻eIF5A基因克隆与生物信息学分析

真核细胞翻译起始因子5A(eIF5A)是一种广泛存在真菌、动植物体内的蛋白质翻译起始因子,也是一种对调控生物生长发育、衰老及环境适应等产生重要作用的影响因子。本研究利用设计的蓖麻蛋白翻译起始因子5A基因的引物对蓖麻‘2129’基因组DNA进行PCR扩增并进行生物信息学分析。结果发现,该目的片段长为480bp,通过对该基因进行理化性质分析发现其分子量为39670.20Da,等电点(pi)为5.22,是一种疏水性不稳定蛋白,通过多序列比对和系统发育树分析发现,蓖麻eIF5A与同属大戟科的麻疯树亲缘关系最近,而与锦葵科的陆地棉亲缘关系最远。以上结果将为今后揭示蓖麻eIF5A蛋白功能提供重要的线索。     

毛白杨PtoMnSOD基因克隆及生物信息学分析

为了揭示毛白杨锰超氧化物歧化酶基因PtoMnSOD在植物抗逆中的功能。本研究通过RT-PCR方法获取毛白杨PtoMnSOD基因序列,并对该基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。结果显示:PtoMnSOD基因开放阅读框(ORF)为699 bp,编码232个氨基酸,具有PF00081和PF02777两个保守结构域,属于MnSOD亚家族。其编码的蛋白含有20个磷酸化位点,是无跨膜结构、无信号肽且定位于线粒体的不稳定亲水性蛋白。同源序列比对显示,不同物种的MnSOD氨基酸序列具有很强的保守性。研究结果为进一步开展毛白杨锰超氧化物歧化酶基因PtoMnSOD的功能研究奠定了理论基础。