白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本研究根据已发表植物抗坏血酸过氧化物酶基因APX的同源保守序列设计引物, 采用RT-PCR扩增超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号的DNA, 获得APX基因开放阅读框, 长度为753 bp, 编码250个氨基酸残基, 推导的氨基酸序列具有APX蛋白的典型特征。生物信息学分析显示, 与已报道的大白菜的APX氨基酸序列同源性达到99%, 该酶蛋白具有高度的进化保守性, 其保守序列属于植物的POD超家族, APX相对分子质量和理论等电点依次为27.7 kD和5.58;APX基因无信号肽, 是一个亲水性蛋白, 可推测其定位于细胞质中;二级结构预测表明陇油7号的APX是由不规则卷曲和α-螺旋组成的稳定蛋白。实时荧光定量PCR和酶活性分析显示, 该基因表达和酶活性受低温胁迫诱导, 表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。     

小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C₁₄₁₇H₂₂₄₆N₃₉₄O₄₂₃S₅,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。...     

甘薯近缘野生种Ipomoea trifida(4x) GISH分析

以甘薯近缘野生种I. trifida (2x)为探针, 与I. trifida (4x) 2个株系“695104”和“697288”的体细胞染色体进行基因组荧光原位杂交, 结果显示, 2株系都与I. trifida (2x)有很近的亲缘关系, 但2株系的信号存在差异。“695104”几乎所有染色体整条都有均匀明亮的信号, 应为I. trifida (2x)基因组直接加倍而来;而 “697288”与“695104”不同, 虽然各条染色体也均有杂交信号, 但信号的区域与亮度有差异, 较为复杂, 可分为三种情况。第1种是整条染色体有均匀明亮的信号, 亮度与分布区域同“695104” , 有41条;第2种是几乎整条染色体有信号, 但亮度较第一种暗, 有14条;第3种为染色体部分区域有信号, 亮度较前二者更暗, 有5条。推测 “697288”是在加倍同时或之后又发生了基因组重组与部分变异。     

棉花抗坏血酸过氧化物酶基因GhAPX的克隆及耐冷性初步鉴定

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是活性氧H2O2的清除剂,对抵抗植物逆境发挥着重要的作用。为了探究棉花APX基因的耐冷功能,本实验应用RT-PCR和RACE技术从苗期耐冷型棉花品种‘新陆早25号’叶片中克隆得到一个APX基因GhAPX,并对转基因烟草的主要抗氧化酶活性和快速荧光参数进行了分析。结果表明,该基因c DNA全长1763 bp,开放阅读框1137 bp,编码379个氨基酸。Blastx比对表明该基因与已克隆的棉花气孔APX相似性最高,达99%。进化分析表明该基因与刚毛怪柳关系较近,与拟南芥(AtAPX)和小麦(TaAPX)关系较远。蛋白质结构分析显示该基因属于植物过氧化物酶基因家族,亚细胞定位结果显示该蛋白位于叶绿体中。实验成功构建了植物表达载体PZP35S-GhAPX。转基因研究发现,转GhAPX基因会提高烟草的POD和CAT活性。在4℃冷害条件下,转基因烟草的POD和CAT活性及Fv/Fm和pI均大于野生(对照)株,且下降幅度和速度均小于野生植株,而SOD活性在转基因和野生植株间差异不大,初步推测GhAPX基因可以提高棉花幼苗的低温冷害抵抗力。本研究为揭示GhAPX基因的功能及其与棉花耐冷性的关系提供了理论参考。     

陆地棉抗坏血酸过氧化物酶基因家族全基因组生物信息学分析

【目的】抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是过氧化物酶家族中的1类成员,可以清除活性氧。APX家族的生物信息学分析有助于更好地了解该家族基因。【方法】利用生物信息学方法,从中国农业科学院棉花研究所提供的陆地棉序列中鉴定出14条APX基因家族序列,并对这14个成员的染色体定位、亚细胞定位、进化关系、理化性质、信号肽、保守基序以及其编码蛋白的结构特征进行了预测分析,并初步分析了部分基因的表达。【结果】APX基因分布广泛,分散在不同的染色体上;且大部分APX蛋白定位在细胞质,是亲水性脂溶蛋白;有3个保守基序,保守性较强;基因起源和进化比较复杂;二级结构的主要元件为α-螺旋和无规则卷曲。根据表达分析推测,第1亚组和第2亚组的基因在棉纤维发育的不同时期起作用。【结论】这些结果有望为APX家族成员的结构与功能挖掘提供参考。     

银杏过氧化物酶基因POD1的克隆及表达分析

利用RACE技术从银杏中克隆到过氧化物酶基因(GbPOD1,FJ599670)的cDNA全长。GbPOD1基因编码序列为1 092 bp,编码一条长为329Aa的成熟阴离子POD蛋白,预测成熟蛋白分子量为35.8 kDa,等电点为8.10。Southern杂交及进化树分析结果表明,GbPOD1和其他物种的POD源自于相同的祖先,属于植物类型III的POD同工酶编码基因,为多基因家族。RT-PCR分析表明,GbPOD1在银杏的根、茎、叶和果中都有表达,在茎中的相对表达量最高,其次为根和果,而叶部位表达水平最低。植物激素MeJA、金属离子Cu和Cd以及MV和WOU的处理能显著诱导GbPOD1基因的表达。研究结果显示,在银杏叶片中,GbPOD1属于多功能基因,具有潜在的参与重金属污染清除及伤害处理防御方面的功能。     

刺槐纤维素合酶基因(RpCesA2)克隆、表达及SNP分析

利用同源克隆及RACE结合方法,首次从刺槐(Robinia pseudoacacia)茎部cDNA中获得纤维素合酶基因RpCesA2并获取基因组DNA序列。通过生物信息学分析,发现该基因内部含有3 291 bp完整编码区,编码1 097个氨基酸残基的蛋白;包含纤维素合成酶蛋白典型结构域:如1个锌指结构(zinc finger)及8个跨膜区(Transmembrane domain),与拟南芥纤维素合成酶基因CesA1至CesA10蛋白序列相似性达56.27%(At CesA8)~79.67%(AtCesA2)。通过构建系统进化树,发现RpCesA2基因与CesA5、CesA6、CesA9基因亲缘关系较近。组织特异性Realtime-PCR结果表明,RpCesA2基因在刺槐根、茎、叶片、叶柄4个组织部位具有不同的表达模式:第一时期、第三时期均在叶片中表达量最高,第二个时期茎中表达量最高。在此基础上,对10个刺槐无性系单株RpCesA2序列进行测序比对分析,检测到50个单核苷酸多态性(SNP)位点,其出现频率为1/130。CDS区域共有22个SNPs,其中15个是同义突变,7个为错义突变,非同义突变与同义突变比率为0.47。该研究结果为RpCesA2基因进一步连锁不平衡作图与关联研究提供理论依据,并最终有助于刺槐纤维素合成途径研究、标记辅助分子育种。     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛WRKY基因家族的生物信息学分析

WRKY基因家族是一类含有WRKY保守结构域的转录因子大家族,是植物中最大的转录调控因子家族之一.目前已有多种植物WRKY家族的分析鉴定报告,但关于甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)中WRKY家族的报告却很少.本研究利用生物信息学方法对甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛Ipomoea trifida(Kunt...     

甘薯二羟基黄酮醇还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据其它作物的二羟基黄酮醇还原酶（DFR）基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR方法从甘薯块根中分离出花青素合成相关基因DFR基因,并定名为ibDFR。该基因全长1232bp,编码398aa。核甘酸序列分析表明,与牵牛相似系数达85%,与烟草的相似系数达到67%,与马铃薯的相似系数达75%。将ibDFR连接到pET30a（＋）载体中,检测ibDFR在大肠杆菌中的表达。实验结果表明ibDFR蛋白质分子量大小与推算一致,能在大肠杆菌中转录表达。     

甘薯抗逆相关基因IbERF3的克隆与表达分析

为了提高甘薯的抗逆能力,通过RACE的方法克隆到一个含有AP2结构域的ERF家族基因,该家族基因在植物逆境调控中起重要作用。该基因cDNA全长1025 bp,编码区为669 bp,编码223个氨基酸,该基因在甘薯中未曾报道,将其命名为IbERF3。通过进化树分析发现,IbERF3在茄目类作物中具有一定的保守性。通过定量PCR研究发现,IbERF3在甘薯根、叶中都有表达,且在叶片中的表达量最高,同时研究发现,在干旱、盐胁迫处理后IbERF3在根和叶片中表达量都显著上升。在用植物激素ABA处理后,IbERF3的表达量逐渐上升并在24 h时达到最大。因此,推测IbERF3在甘薯抗逆途径中起重要作用。     

小金海棠金属硫蛋白基因MxMT2克隆与生物信息学分析

以苹果属植物小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为试材,将差异筛选消减cDNA文库得到的27个金属硫蛋白cDNA片段序列构建成本地数据库,通过电子拼接和RT-PCR相结合的方法,分离到了小金海棠金属硫蛋白基因MxMT2(Genbank登录号为GQ906589),该基因全长610个碱基,开放阅读框(ORF)为240bp,编码80个氨基酸,推测分子量7.74kDa。该基因具有金属硫蛋白基因的典型结构域特征,编码的氨基酸含有14个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈Cys-Cys、Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys形式排列。通过系统进化树分析,小金海棠MxMT2与沙梨、杏树、美洲李等植物保持了较近的亲缘关系,与欧洲山毛榉、旱柳、红小豆、鼠尾草等植物亲缘关系较远。     

甘薯香豆酸3'-羟化酶基因的克隆和表达分析

香豆酸3'-羟化酶(coumarate-3-hydroxylase,C3H)是绿原酸代谢途径中的关键酶之一。为了揭示甘薯绿原酸生物合成途径和挖掘绿原酸合成相关基因,本研究从甘薯中克隆一个C3H的同源基因IbC3H。该基因全长1656 bp,包含一个1530 bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸。IbC3H蛋白具有典型P450家族蛋白结构特征,与牵牛花(Ipomoea nil)、马铃薯(Solanum tuberosum)、浆果状椒(Capsicum baccatum)和烟草(Nicotiana attenuate)中相应蛋白的同源性分别达到97.2%、85.4%、84.8%和84.8%。IbC3H启动子序列中含有脱落酸、赤霉素、乙烯和干旱等多个激素和胁迫响应元件,以及髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(MYB)、碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)、和WRKY蛋白等转录因子结合元件。荧光定量PCR结果显示,IbC3H在甘薯叶片中表达量最高,在茎中次之,而在块根中的表达量最低,与甘薯不同组织绿原酸含量正相关。本研究结果为进一步揭示IbC3H在绿原酸生物合成中的功能提供了依据。     

一个玉米氯离子通道基因(clc)的电子克隆及生物信息学分析

氯离子通道植物生理代谢中起着重要的角色.通过电子克隆的方法获得玉米氯离子通道的cDNA全长序列.发现该基因包括5个外显子和4个内含子,并对其表达产物进行生物信息学分析,其表达产物与拟南芥ATCLC-A,ATCLC-B具有较高的相似性.     

甘薯块根储藏蛋白(Sporamin)启动子克隆及功能验证

提取甘薯“川薯34”总DNA,设计引物,通过高保真PCR扩增获得了长为1 144bp的甘薯储藏蛋白(Sporamin)基因启动子SpoA-p.PLACE在线分析表明:Sporamin启动子具有基本的启动子元件CAAT-box,并包含大量与储藏蛋白表达相关、抗逆相关及蔗糖表达相关的功能组件.构建植物表达载体pBI-SpoA-p::GUS、农杆菌工程菌株EHA105:pBI-SpoA-p::GUS后导入烟草及甘薯,分别得到15株烟草和10株甘薯的阳性转基因植株,GUS染色分析表明烟草各部位中只在根中有基因表达,甘薯根、茎和叶各部位未检测到活性.5％蔗糖诱导处理24 h后,在烟草根、茎及叶均观察到GUS活性;在甘薯中只有根有GUS活性.因此,可以看出此启动子为甘薯根部特异的表达启动子,并受蔗糖诱导而表达.     

野巴旦杏AlsCBF基因的克隆及生物信息学分析

对克隆获得的野巴旦杏基因AlsCBF进行生物信息学分析,从而为该基因的功能鉴定提供理论基础,以期为新疆巴旦杏的抗寒育种提供基因来源。通过采用RT-PCR和RACE方法从野巴旦杏中克隆到植物抗逆途径关键转录因子CBF基因全长并命名为AlsCBF,GenBank登录号为HQ908653。生物信息学分析表明：该基因全长1171 bp,其中编码区长714 bp,编码237个氨基酸,其蛋白的分子式为C₁₁₅₆H₁₈₃₂N₃₃₂O₃₅₆S₁₅,相对分子质量为26.5581 kDa,理论等电点为6.76,该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。肽链可能含有8处丝氨酸磷酸化位点,1处苏氨酸磷酸化位点。三维结构预测表明其符合AP2结构域模型特点。本研究通过对AlsCBF基因的生物信息学分析,获得了该基因的相关信息,并与已有研究结果进行比对分析,推测该基因在植物抗寒过程中有重要的作用。