猪乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上蚀斑技术的建立

目的:分析研究猪乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上蚀斑技术的建立。方法:配制甲基纤维素(MC)覆盖物、甲基纤维素(MC)覆盖物、结晶紫染色液,在进行蚀斑试验。结果:MC粘度直接影响蚀斑的形成,在粘度为1500的MC覆盖物中,JEV病毒不产生蚀斑;在粘度为4000的MC覆盖物中产生清晰的蚀斑。结论:蚀斑技术是病毒感染力测定的精确定量方法。     

乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上的蚀斑技术研究及其应用

乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2弱毒株免疫易感动物猪后,在猪体内主要是由T细胞识别抗原引起的细胞免疫,而只有极少部分参与体液免疫,这就给抗体的检测带来困难。参与体液免疫所产生的抗体可以通过ELISA方法检测到血清中的抗体,而参与细胞免疫所产生的抗体在血清中仅有少量存在。JEV SA14-14-2弱毒株可在BHK-21细胞上形成清晰的蚀斑,利用这一技术不仅可以测定JEV的蚀斑单位,还可通过蚀斑减少中和试验比较精确的测定乙脑阳性血清中中和抗体的效价,并可用于病毒的纯化和分型鉴定。     

猪乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上蚀斑技术的建立

目的:分析研究猪乙型脑炎病毒在BHK-21细胞上蚀斑技术的建立。方法:配制甲基纤维素(MC)覆盖物、甲基纤维素(MC)覆盖物、结晶紫染色液,在进行蚀斑试验。结果:MC粘度直接影响蚀斑的形成,在粘度为1500的MC覆盖物中,JEV病毒不产生蚀斑;在粘度为4000的MC覆盖物中产生清晰的蚀斑。结论:蚀斑技术是病毒感染力测定的精确定量方法。     

猪乙型脑炎诊断技术

猪乙型脑炎目前无特效的治疗方法,所以对其进行快速、准确的诊断意义十分重大。对猪乙脑的3种诊断方法:病毒的分离和鉴定、血清学诊断、分子生物学诊断技术进行一般性的阐述,并对其优缺点进行比较。     

siRNA抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞中复制的研究

选取口蹄疫病毒(FMDV)的VP1、IRES、2B、3D和L基因保守序列,设计、合成siRNA,并成功构建表达siRNA的穿梭载体,通过脂质体2000在BHK-21细胞上转染6个重组siRNA表达质粒,观察其对FMDV S72毒株复制的抑制效果.结果发现:病毒对照和空载体对照细胞死亡脱落,脂质体2000对照和细胞对照细胞状态良好; 6个siRNA转染孔细胞状态明显优于病毒对照孔,表明6个重组质粒转染后均可以显著抑制FMDV S72毒株的复制,其中靶向IRES1基因的siRNA对FMDV的复制抑制最为明显.     

水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞凋亡的初步研究

采用倒置相差显微镜、电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳等技术研究水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞凋亡．形态学观察结果显示,水泡性口炎病毒感染BHK-21细胞的形态变化具有较典型的凋亡特征,如细胞膜内陷、核染色质凝集边聚等;琼脂糖凝胶电泳出现180-200bp整倍数的DNA梯形带．上述结果表明水泡性口炎病毒可诱导BHK-21细胞凋亡。     

BHK-21细胞库的建立及其生物学特性鉴定

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株BHK-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果显示,2个来源的BHK-21细胞系均呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体为21对,二倍体均占主体;外源质粒在该2株细胞系中能进行复制和表达。这可为开展BHK-21细胞系及口蹄疫疫苗的研究与开发提供基础理论依据和细胞资源。     

猪乙型脑炎概述及其防治

乙型脑炎简称乙脑,人和动物均可感染,其中猪的感染率最高.由于乙型脑炎病毒传播途径是蚊虫且具有强烈的传染性,对养殖业的发展造成了严重的影响.本文主要对感染猪乙型脑炎病毒后的临床现象、流行病学特征及对其采取有效防控措施等进行简单概述,希望可以为养殖业防治猪乙型脑炎病提供有效的建议.     

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

 【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用 RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR）把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染 BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。     

伪狂犬病毒在BHK-21悬浮细胞中的增殖特性

为考察BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）工艺参数及病毒增殖过程中代谢动力学,将PRV接种于BHK-21悬浮细胞,考察接毒时细胞密度、病毒感染复数（MOI）及收毒时间对病毒效价的影响,测定培养过程中葡萄糖（Gluc）、乳酸（Lac）和谷氨酰胺（Gln）浓度,计算病毒增殖过程中各参数代谢速率。结果显示,将MOI为0.01的PRV病毒接种BHK-21悬浮细胞,其病毒滴度在42 h达最高8.5 lgTCID₅₀/mL。代谢参数检测结果表明,BHK-21细胞在接毒36 h后细胞开始出现死亡。PRV在BHK-21悬浮细胞中的增殖特性为伪狂犬病毒的规模化培养及疫苗开发提供了技术基础。     

浅谈猪乙型脑炎的防治措施

猪乙型脑炎是一种被世界卫生组织定为需要重点控制和预防的传染病。猪乙型脑炎是一种人畜共患的传染病,如果猪感染上了这种疾病,母猪会发生流产、产下死胎的现象,而公猪则会换上睾丸炎;人类也会被传染上猪乙型脑炎,人一旦患上这种病,就会引发脑炎,严重的时候,甚至会导致死亡。猪乙型脑炎的传播会严重影响人畜的健康,给经济带来重大的损失。因此,预防和治疗猪乙型脑炎是一件刻不容缓的事情。     

猪乙型脑炎的综合防治

介绍了乙型脑炎的病原学、流行病学和临床症状,并提出了病理解剖和综合防治措施。     

乙型脑炎病毒的分离与鉴定

通过收集母猪流产死胎和蚊子为病料 ,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离出病毒 ,进而采用血凝 (HA)实验、荧光抗体染色技术 (间接法 )、电镜实验、血清学实验及RT -PCR方法对所分离的病毒进行鉴定 ,结果表明所分离的病毒SC株为乙脑病毒 ,其PrM/E的同源性与JEV强毒株SA14相比达 98%。     

猪乙型脑炎的识别与防治

阐述了猪乙型脑炎的病原、流行病学特点、临床症状、病理变化及防治措施。     

共表达γ干扰素的乙型脑炎病毒与猪细小病毒核酸疫苗的构建及其免疫原性研究

为了构建和筛选良好的猪乙型脑炎和猪细小病毒的核酸疫苗,并提高核酸疫苗的免疫效果,用重叠PCR法把PPV VP2和JEV E10连接,再将扩增的IFN-γ连入构建载体pcDNA.VEI使其共同表达.用脂质体将pcDNA.VEI介导入Vero细胞,通过间接免疫荧光法检测目的基因的体外表达.用pcDNA.VEI和不表达IFN-Κ的pcDNAZ.VE分别免疫Balb/c小鼠,同时设立PBS、猪细小病毒灭活疫苗、乙型脑炎弱毒疫苗和pcDNA3.1空白质粒免疫对照组.共免疫两次,间隔2周检测免疫指标.结果表明,通过鉴定核酸疫苗的构建达到了预期目标,并可在荧光显微镜下观察到了其转染的Vero细胞.该核酸疫苗能够诱导脾淋巴细胞增殖.ELISA结果显示,与pcDNA.VE和阴性对照组进行比较,pcDNA.VEI所诱导产生的两种抗体都较高.pcDNA.VEI组能较稳定的诱导产生T细胞亚群,并检测到CD4+/CD8+比例于首免2周后都高于pcDNA.VE.因此表明该核酸疫苗能产生特异诱导体液免疫和细胞免疫且是安全的,证明了IFNγ基因具有免疫增强效果,为乙脑和猪细小病毒核酸疫苗研究提供了实验依据.     

贵州猪乙型脑炎血清流行病学的调查

为了解贵州省规模养猪场乙型脑炎(JE)的流行情况,为该病的诊断、预防和控制提供参考,应用乳胶凝集试验(LAT)对9个地区216个规模养猪场的2 906份血清进行检测。结果表明:查出阳性血清1 239份,占受检血清的42.6%,以黔南州(74.9%)和贵阳市(66.7%)的血清阳性率较高;133个猪场检测出阳性血清,阳性场率为61.6%,以贵阳市(92.3%)和遵义市(93.5%)的猪场阳性率较高。结论:贵州省猪群存在JE感染,且感染率较高,应采取积极的防治措施。     

广西猪乙型脑炎病毒的分离及初步鉴定

【目的】了解广西猪乙型脑炎（JE）地方流行毒株特点,为有效防控广西猪JE奠定基础。【方法】对从广西各地猪场采集疑似JE病例猪的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎、公猪精液、猪舍蚊子等靶组织样品进行猪乙型脑炎病毒（JEV）检测,并选择部分阳性样品进行JEV分离鉴定及病毒E基因遗传进化分析。【结果】在采集的465份JE疑似病料样品中,有72份为JEV阳性;通过接种BHK-21细胞、乳鼠及SPF鸡胚,分离获得两株JEV地方分离毒株,分别命名为GP株和LC株;遗传进化分析显示,GP株和LC株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%和99.8%;两株分离株与疫苗毒株SA14-14-2的核苷酸同源性分别为99.7%和99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%和99.6%,且均属GIII型JEV。【结论】广西受检猪群存在较严重的JEV感染,应引起重视并加强防控。     

广西猪乙型脑炎病毒的分离及初步鉴定

【目的】了解广西猪乙型脑炎（JE）地方流行毒株特点,为有效防控广西猪JE奠定基础。【方法】对从广西各地猪场采集疑似JE病例猪的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎、公猪精液、猪舍蚊子等靶组织样品进行猪乙型脑炎病毒（JEV）检测,并选择部分阳性样品进行JEV分离鉴定及病毒E基因遗传进化分析。【结果】在采集的465份JE疑似病料样品中,有72份为JEV阳性;通过接种BHK-21细胞、乳鼠及SPF鸡胚,分离获得两株JEV地方分离毒株,分别命名为GP株和LC株;遗传进化分析显示,GP株和LC株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%和99.8%;两株分离株与疫苗毒株SA14-14-2的核苷酸同源性分别为99.7%和99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%和99.6%,且均属G III型JEV。【结论】广西受检猪群存在较严重的JEV感染,应引起重视并加强防控。     

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据猪乙型脑炎病毒(JEV)基因序列,设计合成了一对引物,以JEV疫苗株为模板,建立了检测JEV的RT PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为430 bp的特异性目的片段;RT PCR产物测序结果与文献报道的JEV不同毒株的序列同源性达到98%~100%;敏感性测定该RT PCR可扩增到10 pg的JEV-RNA。结果表明,建立的RT PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强。