5株鹅细小病毒分离鉴定及VP3基因遗传进化分析

从江苏省各市鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织中分离到5株病毒分离物。经过实验室鉴定,该5株病毒分离能与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应,并均能使用针对小鹅瘟病毒VP3基因特异性引物扩增出与目的条带大小一致的DNA片段。将PCR产物纯化、连接、转化、TA克隆等一系列实验后将获得阳性重组质粒送测序。另外,为了探究该病毒的遗传进化方向,本研究同时对鹅细小病毒VP3基因进行了系统进化分析。     

2020年广东肇庆地区鹅细小病毒VP1基因遗传进化分析

2019～2020年从广东肇庆地区的部份鹅场中收集到12份疑似小鹅瘟病例,对疑似小鹅瘟病例进行病原核酸鉴定,对阳性病例进行病毒分离和VP1基因的序列扩增和遗传进化分析.结果表明,12份疑似小鹅瘟病例中,共检测到7份阳性样品,阳性检测率为58.3％.从阳性病例样本中分离获得7株小鹅瘟病毒毒株,其中1株与Ⅰa亚群毒株核苷酸...     

小鹅瘟病毒PCR诊断方法的建立及初步应用

为了建立小鹅瘟病毒PCR诊断方法,试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列设计1对VP3基因的特异性引物进行PCR扩增。结果表明:该法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段,而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带;病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为2.175 fg/μL;用该法对延边地区疑似小鹅瘟的44只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为91%。     

小鹅瘟病毒GD-06株的分离鉴定

从广东某地死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾中分离到一株病毒。采用鹅胚增殖病毒，通过电镜观察到细小病毒样粒子；人工感染7日龄健康易感雏鹅，引起100％的发病和死亡，并具有典型小鹅瘟的临床症状和剖检特征。经琼脂扩散试验，用此株病毒感染的鹅胚液制备的小鹅瘟沉淀抗原能与小鹅瘟病毒阳性血清发生特异性反应。针对编码主要结构蛋白VP3的基因设计合成一对引物，扩增出与预期长度相符的特异性DNA片段。     

一株小鹅瘟病毒的生物学特性分析

从江苏省某发病鹅场中分离到1株疑似小鹅瘟病毒,纯化后病毒通过电镜观察可见直径约20~25 nm的病毒粒子;琼脂扩散试验结果显示该毒株与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应,与其他阳性血清未发生反应;人工感染雏鹅,可致发病和死亡,通过基因序列测定及遗传进化分析进一步确认该分离株为小鹅瘟病毒。该流行株与当前市售的小鹅瘟弱毒活疫苗具有较大的遗传差异,可为新疫苗的开发提供基础。     

1株小鹅瘟病毒的分离与鉴定

自山东省某鹅场病死鹅组织病料中分离到1株小鹅瘟病毒,命名为SD株。对其进行了PCR检测、电镜观察、回归动物试验和特异性鉴定。结果表明,该分离株的VP3基因扩增片段为436 bp,与小鹅瘟病毒基因序列同源性达到95%以上;病毒形态与小鹅瘟病毒基本一致;鹅胚尿囊液毒肌肉接种4日龄雏鹅10日内80%死亡,死亡雏鹅剖检主要病变为肿大,表面有坏死斑,十二指肠肠腔膨大,肠道黏膜脱落。该分离株的确定为小鹅瘟的精准防控提供了依据。     

广东地区小鹅瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定分析

本研究利用鹅胚从广东地区一鹅场送检的病死鹅病料中分离到一株小鹅瘟病毒,命名为ZJF。对其进行动物回归,发现是一株强毒。对该毒株进行了全基因序列克隆测定,拼接后获得了ZJF株的全基因序列,序列全长为5 046 bp。VP1基因与安徽2011年分离株Yan-1核苷酸、氨基酸同源性最高为99. 7%、99. 3%,进化树显示处于同一小分支中,具有相同的进化祖先;与早前广东地区分离株GDa GPV核苷酸、氨基酸同源性相对较低为94. 5%、97. 4%,进化关系也相对较远。研究结果进一步完善了我国广东地区小鹅瘟的流行病学信息。     

江苏省盐城市3株白羽肉鸭源鹅细小病毒的分离鉴定及其VP3基因遗传进化分析

为分离鉴定导致2017年江苏省盐城市樱桃谷鸭出现短喙、长舌、生长抑制以及死淘率迅速增加的病原,研究其基因遗传进化特点,探讨临床解决方案,用PCR方法,对这一地区3家养鸭场的发病鸭进行检测;对鹅细小病毒阳性样品进行病毒分离,并对其VP3基因进行扩增测序和遗传进化分析。结果显示:从发病鸭中分离到3株可引起鸭短喙与矮小综合征的病毒,分别命名为YC1、SQ1、SQ2;3株病毒VP3基因与我国樱桃谷鸭发生的鸭源鹅细小病毒核苷酸同源性在99%以上,与番鸭中分离的短喙与矮小综合征病毒核苷酸同源性为95%～99%,与经典小鹅瘟核苷酸同源性也在95%以上。结果表明,这3家养鸭场暴发的短喙与矮小综合征均由新型鹅细小病毒感染所导致。该毒株与欧洲分离株的亲缘关系更近,提示这3株病毒可能通过引种传入我国,或者由欧洲分离株进化而来。     

小鹅瘟病原学与检测方法的研究

从患病雏鹅的病料样本中分离鉴定出一株小鹅瘟野生强毒.采用鹅胚增殖病毒,以琼脂扩散试验从感染鹅胚尿囊液中检出小鹅瘟病毒抗原;以感染鹅胚尿囊液人工接种5日龄健康雏鹅,复制出与自然感染病例相类似的病变; 通过电镜观察到典型的小鹅瘟病毒粒子.该分离毒株核酸分子量为5 000 bp.制备的小鹅瘟沉淀抗原可以检测患病雏鹅血清中的抗体,监测治疗血清的滴度和疫苗接种的效果.标记的小鹅瘟荧光抗体能直接检测患病雏鹅组织中的病毒抗原.针对编码主要结构蛋白VP3的基因设计合成一对引物,扩增出与预期长度相符的特异性DNA片段.     

广东地区小鹅瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定分析

本研究利用鹅胚从广东地区一鹅场送检的病死鹅病料中分离到一株小鹅瘟病毒,命名为ZJF,对其进行动物回归,发现是一株强毒。对该毒株进行了全基因序列克隆测定,拼接后获得了ZJF株的全基因序列,ZJF株序列全长为5 046 bp。其中VP1基因与安徽2011年分离株Yan-1核苷酸、氨基酸同源性最高为99.7%、99.3%,进化树显示处于同一小分支中,具有相同的进化祖先;与广东地区分离株GDaGPV核苷酸、氨基酸同源性相对较低,为94.5%、97.4%,进化关系也相对较远。另外ZJF与GDaGPV相比在ITR区有两处14 bp碱基的缺失。研究结果进一步完善了我国广东地区小鹅瘟的流行病学信息。     

华南地区小鹅瘟和番鸭"三周病"分离野毒株部分VP基因的序列差异分析

为了研究华南地区小鹅瘟病毒(GPV)和番鸭"三周病"病毒(MDPV)分离野毒株部分VP基因的序列差异情况,试验从华南地区分离到疑似5株小鹅瘟病毒和2株番鸭"三周病"病毒野毒,并分析其变异情况.结果表明:华南地区小鹅瘟病毒分离野毒株的VP基因均与小鹅瘟病毒具有较近的亲缘关系,说明VP基因可能和致病性有关;番鸭"三周病"病毒分离野毒株的VP基因与小鹅瘟病毒的相似性相对较低,但均与GenBank注册登陆的小鹅瘟病毒处于同一较大分支上.     

小鹅瘟套式PCR诊断方法的建立及初步应用

本试验根据GenBank发表的小鹅瘟病毒B株基因序列,设计了两对VP3基因的特异性引物,进行PCR扩增,建立了小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法,该方法能特异性地扩增出406 bp的小鹅瘟病毒VP3基因片段而对其他病毒基因组DNA均没有扩增出条带。本方法对病料中小鹅瘟病毒基因组DNA的最小检测量为0.02175 fg/μL。通过对延边地区疑似小鹅瘟的80只病死雏鹅进行了检测,阳性检出率为95%。结果表明,本试验建立的小鹅瘟病毒套式PCR诊断方法具有极高的敏感性和特异性且检出率极高,可作为一种有效的临床诊断方法。     

6株鹅细小病毒的分离及其VP3基因序列分析

为了解吉林省不同地区小鹅瘟流行情况,从吉林省磐石、白城、九台、德惠、辽源与镇赉地区鹅养殖场采集疑似小鹅瘟雏鹅的肠管,处理后接种SPF鹅胚成功分离到6株病毒(暂命名为PSH、BCH、JLJT、DH、LY与ZL株),经PCR鉴定为鹅细小病毒。VP3基因序列分析结果显示,分离到的6株鹅细小病毒VP3基因与近年来国内流行毒株同源性较高,核苷酸与氨基酸同源性分别为93.1%~99.6%与95.9%~99.4%。其中,BCH株、JLJT株与LY株属同一分支,与浙江和扬州等地区分离的鹅细小病毒相似性较高,达到99.4%~99.6%;ZL株、DH株与PSH株属同一分支,相似性较低。试验表明,吉林省流行的鹅细小病毒与我国南方地区流行毒株同源性较高,与其他地区流行毒株存在一定差异。     

免疫雏鹅发生小鹅瘟的原因分析

2018年6月,安徽某鹅场接种过小鹅瘟蛋黄抗体的2批雏鹅发生小鹅瘟,再次用小鹅瘟蛋黄抗体产品进行紧急接种,有一定的控制效果,但仍有雏鹅死亡。为分析其原因,采集了8只9-12日龄病死鹅的肝脏和脾脏,用PCR扩增检测水禽细小病毒的VP3基因,选8份阳性样品测定了鹅细小病毒(GPV)VP1部分序列并进行了序列分析。结果显示,16份组织样品均为阳性。在443 nt VP1区,所测8株病毒之间的序列同源性为100%,与GPV亚洲强毒分支之间的序列同源性为99%。随后,用琼脂扩散沉淀试验分析了2株待检毒株与GPV参考毒株的抗原相关性,并测定了2种小鹅瘟蛋黄抗体产品的效价。结果显示,待检毒株与参考毒株具有相同的沉淀抗原,2种小鹅瘟蛋黄抗体产品的效价分别为1∶2和1∶16。表明免疫雏鹅仍发生小鹅瘟的原因并非源自GPV变异,而是与某些蛋黄抗体产品的抗体效价较低有关。     

小鹅瘟病毒贵州株的分离与鉴定

采用鹅胚接种、动物感染、电镜观察及病原核酸与结构蛋白分析等方法对贵州省某养殖场疑似小鹅瘟病例进行了病原的分离与鉴定.结果:该病例组织病料可使鹅胚呈现特征性病变,雏鹅人工感染后能表现出与自然感染病例相似的症状;电镜下病毒粒子直径为20～25 nm,无囊膜,具有典型细小病毒特征;经1%琼脂糖凝胶电泳,病毒核酸扩增片段约为5100 bp;经SDS-PAGE发现,病毒结构蛋白由3条多肽组成,即VP1、VP2、VP3,分子量依次为88、68、57 ku.实验成功分离得到了一株贵州小鹅瘟病毒流行毒株.     

霍尔多巴吉鹅源小鹅瘟病毒VP3基因的克隆及序列分析

采用聚合酶链式反应(PCR)方法对国内霍尔多巴吉鹅源小鹅瘟病毒分离株(GPV-H)的结构蛋白VP3基因进行扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序.结果表明,GPV-H株VP3的核苷酸序列全长1 605 bp,编码534个氨基酸,与GenBank发表的13株小鹅瘟病毒VP3相比,核苷酸同源性在92.5％～98.9％之间.通过基因进化树分析可以看出,GPV-H株与波兰和匈牙利分离到的5株病毒亲缘关系较近.     

6株鹅细小病毒的分离鉴定及VP3基因序列分析

为了解吉林省不同地区小鹅瘟流行情况,从吉林省磐石、白城、九台、德惠、辽源、镇赉地区鹅养殖场采集疑似小鹅瘟病料,接种SPF鹅胚后分离到6株病毒(暂命名为PSH、BCH、JLJT、DH、LY、ZL株),经PCR鉴定为鹅细小病毒。VP3基因序列分析结果显示,分离到的6株病毒VP3基因、蛋白与近年来国内流行的鹅细小病毒同源性较高,分别为93.1%～99.6%与95.9%～99.4%。其中,BCH株、JLJT株、LY株属同一分支,与浙江、扬州等地区分离的鹅细小病毒相似性较高,达到99.4%-99.6%;ZL株、DH株、PSH株属同一分支,相似性较低。试验表明,吉林省流行的鹅细小病毒与我国南方地区流行毒株同源性较高,与其他地区流行毒株存在一定差异。     

小鹅瘟病毒荧光RPA恒温快速检测方法的建立与应用

旨在建立一种以重组酶聚合酶扩增技术（RPA）为基础的快速检测方法,用于小鹅瘟病毒的快速检测。小鹅瘟是一种常见的水禽传染病,严重危害我国养鹅业的健康发展。为了快速准确对小鹅瘟进行诊断,减少该病的危害,本研究以小鹅瘟病毒VP3基因保守片段为靶点,利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）建立了一种准确高效的小鹅瘟病毒RPA恒温快速检测方法,并对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统PCR和传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,该检测方法具有较高的灵敏度,可检测到10 copies/μL的病毒核酸;具有良好的特异性,只特异性地扩增鹅细小病毒,而与鹅副黏病毒、鹅源鸭瘟病毒、小鹅流行性感冒病毒、鹅副伤寒病毒、大肠杆菌和曲霉菌均未发生交叉反应;同时该方法重复性检测的变异系数低于6%,具有很好的重复性。阳性符合试验表明该检测方法与荧光定量PCR符合率为99%。该方法可以很好地应用于小鹅瘟的大规模临床样本检测,为小鹅瘟病毒的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。     

鹅细小病毒PCR检测方法的建立及应用

根据鹅细小病毒VP3基因设计合成一对引物,结果特异性地扩增出与预期片段大小相符的430bp核苷酸片段,建立了用于检测鹅细小病毒的PCR方法。此方法检测鹅细小病毒结果与病毒分离培养、电镜检查结果一致。通过特异性、敏感性及临床应用实验证明,每5μL样品中获得阳性扩增结果中最小检出量为2．5×10^-1.58 ELD50;此方法用于临床检测鹅细小病毒是特异的、敏感的、可行的,本次实验建立的PCR方法使我省小鹅瘟的诊断,监测和防制工作上升到分子生物学水平。     

小鹅瘟病毒山东株的分离鉴定及VP3基因序列分析

从山东某患病鹅群中分离到一株病毒。根据小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因全序列,设计了一对特异性引物,提取病毒DNA进行PCR反应,成功扩增出372 bp的特异条带。将PCR产物纯化后,与pMD18-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10,经Amp和蓝白斑筛选和PCR鉴定后,对阳性克隆进行测序。测序结果表明该小鹅瘟病毒毒株的VP3基因片段与GenBank已公布的GPV相应序列的同源性在94.1%~98.4%之间。