双孢蘑菇同核原生质体育种技术研究：Ⅱ.同核原生质体的杂交

为建立双孢蘑菇同核原生质体杂交育种体系,本文对同核原生质体亲合性反应及杂交异核体F_1代的农艺性状和F_2代的分离与变异规律进行了研究。结果表明:双孢蘑菇同核原生质体的杂交是一个较复杂的性亲合与核迁移过程,其杂交率较低。在按气生型×气生型、气生型×匍匐型、匍匐型×匍匐型组合的520个杂交配对中,共获得113个杂交异核体,平均杂交率为22%。本研究同时建立了以菌落形态、菌丝生长速度、羧甲基纤维素酶相对活性以及酯酶同功酶电泳为手段的杂交异核体鉴定体系。     

双孢蘑菇同核原生质体育种技术研究：Ⅰ.同核原生质体的分离与鉴定

通过对溶壁酶组成及浓度,渗透压稳定剂、菌丝培养方法等研究,建立了有效的双孢蘑菇原生质体制备与再生系统。采用1.5％Lywallzyme、0.6M KCl为渗透压稳定剂,25℃酶解4小时,原生质体的产量可达到10~7个/ml;纯化后的原生质体在0.6M蔗糖为渗透压稳定剂的PDMA培养基中,25℃恒温培养5～7天,再生率达1%以上,根据原生质体再生菌落出现时间的先后顺序,并以菌落形态特征、菌丝生长速度。羧甲基纤维素酶(Cx酶)活性及子实体形成能力上的差异为鉴定同核体的主要标记,从两种形态类型,不同来源的12个双孢蘑菇菌株中均分离到同核原生质体,同核率为2％～15%,平均为11.75％。     

灵芝原生质体技术研究进展

综述了原生质体技术在灵芝育种方面的研究进展,包括灵芝原生质体的制备与再生、灵芝原生质体融合育种技术、诱变育种技术、单核化杂交育种技术以及灵芝原生质体基因工程育种技术,提出了现有研究中存在的问题,展望了灵芝原生质体技术的发展前景。     

双孢蘑菇性亲和性相关分子标记的初步筛选

以传统的形态，生理生化分析和最新的DCS－PDMA性亲和性测定方法为基础， 结合群体分离分析和RAPD技术来源于同一双孢蘑菇异核体菌株的12个不育同核原生质体个体进行分析，筛选与性亲和性相关的分子标记。研究结果表明，供试的12个不育同核原生质体个体被分成两大类性亲和性类型，其中一类（A^ ）包括不育同核原生质体个体B、C、D、E、F、G、H、I、J、L，另一类（A^-）则仅仅包括不育同核原生质体个体K和M，同时筛选到一个与性亲和性相关的分子标记OPA16 1500。从而为间地利用双孢蘑菇本身特有的交配型作标记来指导杂交育种工作和进一步将性亲和性基因定位分离克隆奠定了坚实的基础。     

应用原生质体技术培育双孢蘑菇杂交新菌株

应用原生质体技术从双孢蘑菇气生型与匍匐型二类品种中制备出原一质体同核本并进行杂交配对。结果表明,从１６个组合中得到６个杂交菌株,其中２个不能结实,４个结实正常,且主要农艺性状明显优于双亲。     

浓香乳菇原生质体再生及再生株特性研究

浓香乳菇[Lactarius camphoratus(Bull.)Fr.]香气浓郁、抗菌性强,是理想的食品风味剂和天然香料源,但难以人工栽培。本文探索了适于浓香乳菇原生质体制备及再生的实验系统,但从随机挑选的120个再生株中未检测到单核体。研究表明,部分再生株的菌落形态及生长速度与亲株明显不同,且与亲株呈三种类型的拮抗反应,但再生株与亲株的酯酶同工酶及蛋白质电泳图谱完全一致。针对浓香乳菇再生株的多种特性,提出了几种可能的变异机理,并对原生质体单核化的可行性作了分析。     

双孢蘑菇遗传育种研究进展

综述了人工选择育种、杂交育种、原生质体融合育种和基因工程育种等双孢蘑菇遗传育种研究的现状及进展,并展望了上述研究领域的发展趋势。     

黑木耳原生质体制备、再生及单核体荧光鉴定

利用正交试验研究了黑木耳原生质体制备、再生的最佳条件,结果表明,原生质体制备最佳条件是酶解温度31℃、酶浓度1．0％、菌龄5d、酶解时间4h,原生质体再生的最佳条件是酶解温度27℃、酶解时间4h、酶浓度1．5％、菌龄11d。稳渗剂种类对黑木耳原生质体再生率的试验结果表明,采用0．5mol／L蔗糖为稳渗剂,各黑木耳菌株的原生质体再生率最高。HW2号菌株原生质体经核染色其单核化比率最高;在荧光显微镜下观察菌丝核相,单、双核清晰可辨。     

双孢蘑菇原生质体同核体的验证

同核体(homokaryon)是进行双孢蘑菇遗传分析和菌种选育的基本材料。我们曾经报道过应用原生质体技术可以在实验室条件下较方便地用菌丝体分离出大量的原生质体同核体(protoplasted homokaryon),这无疑为加快双孢蘑菇遗传育种研究的进程创造了条件。但是由于双孢蘑菇的菌丝一般是多核的,而且又没有锁状联合标记,因此对所获得的原生质体同核体的真实性缺乏一种简单可靠的检测手段,而只能根据它们在再生时间上的先后顺序以及菌落的形态特征进行推定。鉴此,本研究,旨在寻找到可行的方法对推定的原生质体同核体进行有效的验证,结果报道如下: 1 材料与方法 1.1 供试菌株 双孢蘑菇176菌株,上海市农科院食用菌所提供。P_9、P_(11)、P_(12)、P_(14)、P_(15)、P_(20)、P_(21)、P_(22)为随机挑选出的八个推定的176原生质体同核体。 1.2 培养基及配方 ①PDM:马铃薯200g,葡萄糖     

香菇单核原生质体的制备

从食用菌菌丝体中制备出的单核或同核原生质体,是一种不同于孢子单核体的新的育种材料,是原生质体技术在食用菌杂交育种中的重要应用.它为充分利用丰富的野生种质资源,扩大现有栽培种的基因型,缩短育种周期开辟了一个新的途径.本文以香菇为材料,研究了其单核原生质体的形成及其规律.     

新疆杏树苹果锈果类病毒的检测与全序列分析

 在以往研究苹果锈果类病毒ASSVd的基础上,以通过斑点杂交检测ASSVd为阳性的杏树为试验材料,利用RT-PCR技术扩增出苹果锈果类病毒全长特异片段,通过回收克隆测序,发现杏树苹果锈果类病毒基因组长为330nt,将克隆测序结果在GenBank中登录,获得10条序列,登录号为：EU031487－EU031496。在此基础上,利用原位RT-PCR检测技术,进一步证明杏树叶片中有苹果锈果类病毒存在,主要分布在细胞核中。该研究证实苹果锈果类病毒也能侵染杏树,丰富了苹果锈果类病毒的寄主。     

抑制性消减杂交技术(SSH)在辣椒抗病基因研究中的应用

基于抑制性PCR及差减杂交技术建立的抑制性消减杂交技术,因其假阳性率低、敏感性高、效率高等优点广泛应用于植物基因差异表达研究.对该技术的原理、主要优缺点及其在辣椒植物抗病性机制研究中的应用进行了综述.     

风信子再生花芽中胚珠特征基因homads1的表达

 以风信子花被片为外植体，通过控制外源植物生长调节剂6-BA和2,4-D浓度诱导再生胚珠的分化。细胞学观察显示，离体条件下胚珠的发育过程与自然状态下基本一致。利用原位杂交技术分析风信子胚珠特征基因homads1在再生胚珠分化过程中的表达模式。在胚珠形态发生之前，homads1 mRNA就已在心皮状结构边缘的某些细胞中积累，之后集中在由此处产生的胚珠原基和幼嫩的胚珠中，表明homads1 mRNA在启动再生胚珠的分化的过程中起重要作用。分别提取不同发育时期再生花芽的总RNA，以homads1的特异序列设计引物，进行RT-PCR分析。结果显示，在降低6-BA和2,4-D浓度后5 d的再生花芽中即检测到了homads1 mRNA的积累，而在高浓度6-BA和2,4-D条件下持续培养的花芽中均未检测到该基因的转录产物，表明低浓度6-BA和2,4-D诱导homads1在再生花芽中的表达。     

Cryopreserved callus,a source of protoplasts for citrus improvement

Summary

The availability and maintenance of embryogenic callus is a major limitation for large-scale application of somatic hybridization for citrus breeding. The suitability of cryopreserved callus as source of protoplasts was evaluated. Sweet orange callus were frozen by slow cooling and stored for two years in liquid nitrogen. Cryopreserved callus were fast thawed and used as source of material for protoplast isolation, protoplast fusion and plant regeneration, in comparison with control non-cryopreserved callus. No differences were found in protoplast yield, quality, growth and regeneration capacity between both callus types. Protoplasts isolated from cryopreserved callus were also successfully used in somatic fusion assays. Plants regenerated from protoplasts of the two sources had the same phenotypic characters and no differences were detected by microsatellite analysis. Availability of cryopreserved callus facilitates the development of breeding programmes based on somatic hybridization, avoiding the risks and high labour needs associated with standard maintenance by periodical subcultures.     

菊花矮化类病毒的分子检测与序列分析

 菊花矮化病由菊花矮化类病毒（Chrysanthemum stunt viroid,CSVd）引起。从北京、海南万宁、合肥和哈尔滨共采集了122个野生及商业种植的菊花样品,使用改进的CTAB法提取菊花总RNA后,通过斑点杂交检测CSVd,应用RT-PCR对阳性样品进行克隆、测序。斑点杂交结果表明,在检测的122个样品中有14个样品感染了CSVd,感染率为11.5%;除哈尔滨外的其余3个地区均有CSVd的发生。序列比较分析结果表明,中国的CSVd分离物与韩国和日本分离物的序列最为接近,对其二级结构进行分析发现,与CSVd的参考序列（NC002015）相比,所获得的中国CSVd分离物的序列中虽然有21个碱基发生了突变（大多位于二级结构上的致病区内）,但并未影响其折叠成稳定的拟棒状结构。     

美味猕猴桃‘徐香’与长果猕猴桃远缘杂交亲和性的解剖学研究

 以美味猕猴桃（Actinidia chinensis var. diliciosa）‘徐香’与长果猕猴桃（A. longicarpa）进行远缘杂交,利用荧光显微镜观察了花粉管行为,常规石蜡切片法观察了受精及胚发育过程的差异,统计了杂交当代种子数量和坐果率。结果表明：种间杂交长果猕猴桃的花粉粒能在美味猕猴桃‘徐香’柱头的乳突细胞表面萌发、生长,但生长速度比对照缓慢;花粉管在花柱中生长时出现波纹状弯曲、停止生长、胼胝质沿管壁不规则沉积等现象;受精过程延迟;胚胎发育出现异常;坐果率较低。种子总数明显少于种内杂交和种内自然授粉的数量,但正常种子的质量与后者大致相同。     

Variation of brain derived neurotrophic factor and its mRNA expression in infancy rats after experimental bacterial meningitis

AIM: To investigate the expression and effect of brain derived neurotrophic factor (BDNF) mRNA and its protein in infancy rats after exposure to bacterial meningitis. METHODS: Three week old rats were used to construct the models of bacterial meningitis (n=30) and mormal(n=18). At 24 h, 48 h, 5 d after inoculating, the expression of BDNF mRNA and its protein were detected by in situ hybridization and immunohistochemical staining methods, respectively. RESULTS: The increase in BDNF mRNA expression was detected by in situ hybridization at 24 h in experiment(0.13320±0.02750) compared to control(0.06269±0.01147)(P＜0.01). Expression of BDNF mRNA was declined at 48 h, but its expression was still stronger than that in controls at 5 d(P＜0.05). The expression of BDNF protein was enhanced and reached to its zenith at 24 h in this experiment (0.16896±0.02717) (P＜0.01), compared to controls(0.08700±0.03413), and it declined after 48 h, then restored to the control levels at 5 d(P＞0.05). Meanwhile, in the brain from the experiment rats, strong positive hybridization and immunoreactivity were observed in the infiltrated inflammatory cells in leptomeninges, subarachnoid cavity, ventricles and brain parenchyma. CONCLUSIONS: These results support the hypothesis that BDNF might play a neuroprotective role in brain damage process in bacterial meningitis attacked rats. BDNF might take part in imune response. These results also support the hypothesis that BDNF has some relationships with other inflammatory mediators during acute inflammatory response of bacterial meningitis.     

45S rDNA在蒿属5种植物染色体中的分布

 以小麦45S rDNA为探针,通过荧光原位杂交（FISH）技术,研究了45S rDNA在蒿属（Artemisia）5个物种染色体中的分布情况。结果发现,在根尖体细胞有丝分裂中期,中亚苦蒿（A. absinthum Linn.）有1对染色体出现杂交信号;大籽蒿（A. sieversiana Ehrhart ex Willd.）和黄花蒿（A. annua Linn.）各有两对染色体上出现信号;欧亚艾蒿（A. abrotanum Linn.）和牡蒿（A. japonica Thumb.）各有4对染色体出现杂交信号。信号位点除了分布在随体上,主要分布在非随体染色体的端部,而在欧亚艾蒿中发现1对信号位点分布在近端部,而且信号间的强弱也不尽相同。基于FISH技术的核型分析,不仅能够提供稳定、可靠的细胞学标记,而且进一步丰富了染色体分析的基础资料。     

百合抗镰刀菌资源鉴定及抗病相关基因筛选

 对20个百合种质资源的组培苗进行尖孢镰刀菌百合专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）室内接种鉴定;以筛选出有较好抗性的大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowivzii Baker）为材料,以镰刀菌诱导12和24 h的作为处理组,无菌水处理作为对照组,采用SMART技术构建了百合经镰刀菌诱导后的抑制差减正、反向两个SSH文库。在正向文库中选择了4个抗病相关的ESTs,用半定量RT-PCR分析这些ESTs的表达情况。经接种鉴定,20个百合种质资源中,对百合镰刀菌表现高抗的有3个,中抗9个,感病8个;SSH文库ESTs片段大小为200 ~ 2 000 bp。依据斑点杂交结果,从正向SSH文库中挑取50个单克隆进行测序和比对分析,得到6种共10条抗病相关EST。通过半定量RT-PCR对其中的4条抗病相关ESTs：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase,S/TPK）、谷胱甘肽S–转移酶（glutathione S-transferase,GST）、过氧化物酶（peroxidase,POD）和亲环素（cyclophilin,CYP）的表达情况进行了分析,证明它们在一定程度上都受百合镰刀菌诱导而表现上调表达,推测其可能参与了百合对镰刀菌枯萎病的抗病过程。