转Hu-IFN-α基因草鱼的分子验证及抗性研究

采用显微注射法将人α-干扰素抗病基因转移到草鱼受精卵中,获得转基因群体,通过PCR及Southern杂交对转基因草鱼进行分子水平的检测,以进一步验证外源人α-干扰素是否整合入草鱼基因组.结果表明,外源人α-干扰素抗病基因已整合人草鱼基因组中.采用腹腔注射法,对转基因鱼进行草鱼出血病病毒接种攻毒试验,结果显示转基因草鱼比对照组的抗病毒能力有显著提高.     

转Hu-IFN-α基因草鱼的遗传研究

为了分析外源基因在转基因鱼F1中的遗传特征和规律，采用PCR检测技术对Hu-IFN-α基因在转基因草鱼及其杂交F1，雌核发育F1中的遗传表达情况进行检测．检测结果为：对1120尾转基因草鱼的PCR阳性检测，检出率为60％；258尾转基因草鱼杂交F1，阳性检测率为53．8％；36尾转基因草鱼雌核发育F1，阳性率为91．7％，说明Hu-IFN-α基因成功导入草鱼中，并能遗传给F1．     

转Hu-IFN-α基因草鱼F1代人α-干扰素表达水平的研究

为探明人α-干扰素在转Hu-IFN-α基因草鱼F1代中的表达水平,以转Hu-IFN-α基因草鱼F1群体为材料,随机抽取332尾鱼分离其血清后,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测人α-干扰素基因在转基因草鱼F1代中的表达情况.结果表明:转人α-干扰素基因草鱼F1代表达率为52.1%,表达水平偏低,其表达水平受外界因素影响.     

转Hu-IFN-α基因草鱼的雌核发育及生理转雄性研究

为快速获得转Hu-IFN-α基因抗病草鱼纯系,从转Hu-IFN-α基因草鱼中,挑选9尾高表达水平的雌鱼作为亲本,经人工雌核发育,得到子一代水花89尾,与普通草鱼的雌核发育结果相比,两者孵化率差异不显著,但畸形率前者比后者高．从雌核发育子一代鱼苗中随机选取45尾鱼苗投喂含甲基睾丸素的饲料,进行生理转雄性试验,获得生理转雄性鱼苗21尾．     

转人-α-干扰素基因草鱼饲喂大鼠的安全性研究

为研究转人-α-干扰素基因草鱼的食用安全性,以转人-α-干扰素基因草鱼肉糜饲喂大鼠，在30d内对试验鼠进行了临床观察，试验结束时，对试验鼠进行了血液学检测、解剖学观察和组织学检查，结果表明，饲喂转人－α干扰素基因草鱼肉糜的大鼠临床表现正常，血液学指标，解剖学形态和重要器官功能组织学图像与对照组动物没有显著差别。     

转Bt基因抗虫红麻福红952后代的分子杂交验证

利用花粉管通道法将抗虫质粒DNA导入受体红麻品种福红952,在受体品种中获得Bt抗虫目的基因的表达.分别用PCR和Southern杂交技术,对所转化的红麻转基因4个世代的株系进行分子验证,结果表明：4个世代中都检测到B t抗虫目的基因片段,说明外源基因已经整合到红麻的基因组中并获得了稳定遗传.     

人α-干扰素基因在转基因草鱼中的表达

为提高草鱼对出血病的抗性，采用显微注射法，将克隆在鲤β－肌动蛋白基因启动子下游的人α－干扰素基因转移到草鱼受精卵中，获得了大量转基因个体。抽取转基因鱼血浆，以酶联免疫吸附法检测了转基因草鱼中人α－干扰素基因的表达情况。从672尾转基因草鱼中检测出158尾有α－干扰素的表达，阳性率为23．51％，其中表达水平最高个体血浆中α－干扰素质量浓度为1450pg/mL。基因表达量随季节和个体发育时期有所变化。     

转hu-IFN-α基因草鱼血液生理生化指标的分析

采用先进的人体血液测定仪，测定了转hu-IFN-α基因草鱼和普通草鱼血液的各项生理生化指标，统计分析结果表明，转h-IFN-α基因草鱼与普通草鱼血指标值（红细胞数，白细胞数，血红蛋白，红细胞压积）之间没有明显差异，但血浆生化指标中白蛋白，白蛋白／球蛋白比值转基因鱼高于普通草鱼，在转基因组内，血常规的歧值较高，说明转基因在个体中可能存在着不同的表达水平。     

转Bt基因抗虫红麻福红952后代的分子杂交验证

利用花粉管通道法将抗虫质粒DNA导入受体红麻品种福红952,在受体品种中获得Bt抗虫目的基因的表达.分别用PCR和Southern杂交技术,对所转化的红麻转基因4个世代的株系进行分子验证,结果表明:4个世代中都检测到B t抗虫目的基因片段,说明外源基因已经整合到红麻的基因组中并获得了稳定遗传.     

转Hu-IFN-a基因草鱼的雌核发育及生理转雄性研究

为快速获得转Hu-IFN-a基因抗病草鱼纯系,从转Hu-IFN-a基因草鱼中,挑选9尾高表达水平的雌鱼作为亲本,经人工雌核发育,得到子一代水花89尾,与普通草鱼的雌核发育结果相比,两者孵化率差异不显著,但畸形率前者比后者高.从雌核发育子一代鱼苗中随机选取45尾鱼苗投喂含甲基睾丸素的饲料,进行生理转雄性试验,获得生理转雄性鱼苗21尾.     

京巴犬α-干扰素全基因的克隆与分子进化分析

根据基因库(CenBank)中收录的犬α-干扰素(IFN-α)基因核苷酸序列(AB102731),设计并合成了1对引物,PCR扩增京巴犬IFN-α全基因,并克隆、测序.结果表明,犬IFN-α基因全基因序列为564 bp,包含1个开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸.序列比较分析发现,京巴犬IFN-α基因序列与GenBank发表的其它品种犬IFN-α基因序列核苷酸同源性为96.3%以上,氨基酸同源性为94.1%以上,其中与AB102731核苷酸同源性最高,为99.5%.仅有3个碱基差异.京巴犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.京巴犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

转人α-乳清白蛋白基因番茄的获得

由农杆菌介导、采用叶盘法将人α-乳清白蛋白基因导入番茄外植体,经过筛选培养,获得了18株抗性植株.PCR分析和GUS染色检测结果表明外源基因已经导入到番茄中.这一结果为进行人α-乳清白蛋白生物反应器研究奠定了基础.     

鸭α-干扰素基因疫苗肌肉注射免疫鸭抗鸭瘟强毒感染的研究

将本实验室构建的鸭α-干扰素基因疫苗(pcDNA-SDIFN-α)分别按每只50、100、200μg3个剂量肌肉注射免疫樱桃谷鸭,以PBS、空载体质粒pcDNA3.1(+)和鸭瘟弱毒疫苗为对照,免疫15d后攻击感染鸭瘟强毒,于攻毒后2h、6h、12h、24h、3d、6d、9d、14d、22d、26d、33d和40d采全血,同时取死亡鸭的各组织器官,采用实时荧光定量PCR对鸭瘟病毒在鸭外周血中的动态变化和在各组织器官中的分布及含量进行检测。结果表明:①3个剂量pcDNA-SDIFN-α和鸭瘟弱毒疫苗都对鸭产生良好保护作用,免疫鸭未发生死亡;而PBS和空载体对照组3只鸭中有1只鸭死亡,死亡鸭心、肝、脾、肾、胰和各段肠管中均检测到鸭瘟病毒DNA且其含量大于pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血病毒DNA含量;②3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量比PBS和空载体对照组低,差异显著(P<0.05),特别是在2h差异极显著(P<0.01);攻毒后24h内,3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量均低于鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭,差异显著(P<0.05);3个不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组之间外周血鸭瘟病毒DNA含量差异不显著(P>0.05),攻毒初期,200μg免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量最低,100μg次之,50μg最高。研究表明,pcDNA-SDIFN-α肌肉注射免疫鸭后能产生一定的抗鸭瘟强毒感染的作用,并在攻毒初期表现出一定的量效关系。     

鱼类干扰素系统的初步研究

根据哺乳类β-干扰素基因的保守区合成了两对简并引物。用其中的一对(5’TCCTGC／TTGTGC／TTTCTCCACN3’和5’GTCTCAT／GT／ACCAG／CCCAGTGCN3’)作PCR引物。从草鱼(Ctenopharygodon idellus)DNA中扩增获得了一预期大小的片段(约278bp)。Southern杂交的结果表明该片段与人的β-干扰素基因有一定的同源性。     

鱼类干扰素系统的初步研究

根据哺乳类β-干扰素基因的保守区合成了两对简并引物。用其中的一对(5’TCCTGC／TTGTGC／TTTCTCCACN3’和5’GTCTCAT／GT／ACCAG／CCCAGTGCN3’)作PCR引物。从草鱼(Ctenopharygodon idellus)DNA中扩增获得了一预期大小的片段(约278bp)。Southern杂交的结果表明该片段与人的β-干扰素基因有一定的同源性。     

狸猫α-干扰素全基因的克隆及生物信息学分析

根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序。用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析。结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点。IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

水牛α-乳清蛋白基因的克隆及序列分析

根据报道的奶牛α-乳清蛋白基因核苷酸序列设计和合成4对引物,采用PCR扩增的方法克隆并测定了水牛α-乳清蛋白全基因的核苷酸序列.结果表明,克隆的水牛α-乳清蛋白基因全长3 038 bp,包括5′侧翼区,3′侧翼区,3个内含子和4个外显子(该序列已被成功提交到GenBank,序列接收号为EU422984).核苷酸序列比对结果表明,水牛α-乳清蛋白基因与报道的奶牛该基因的核苷酸序列同源性为97.53 %.水牛α-乳清蛋白成熟肽的氨基酸序列与奶牛相比有两个氨基酸的差异.与奶牛相比,水牛α-乳清蛋白基因5′调控区发生了多处插入突变和碱基替换突变,这些插入和替换突变可能与水牛乳汁中α-乳清蛋白的高水平表达有关.     

草鱼LXRα基因的克隆及表达研究

【目的】克隆草鱼肝X受体α亚型(Liver X Receptorα,LXRα)cDNA序列,分析其在草鱼不同组织中的表达情况及n-3HUFA对草鱼肝胰脏LXRα基因表达的影响。【方法】以草鱼肝胰脏组织为材料,采用RT-PCR技术对其LXRα基因cDNA进行克隆分析,运用生物信息学的方法分析该基因序列同源性。检测LXRα基因在草鱼10种组织中的表达情况。以含0.52%n-3HUFA的饲料饲喂草鱼95d后,用实时定量PCR法检测n-3HUFA对肝胰脏LXRα表达的影响。【结果】克隆得到了草鱼LXRαcDNA序列(GenBank注册号为:FJ965309),其ORF序列长度为1 230bp,编码409个氨基酸,预测该蛋白分子式为C2083H3343N581O611S30,分子质量为47 263.7u,等电点pI为7.91,半衰期为30h。该蛋白质具有哺乳动物的LXRS特征:包括DNA结合位点(DBD)、p-box,配体结合域(LBD)、激活功能-2(AF-2)区域、D-box、D区域(D region)和属于2个锌指结构的8个半胱氨酸;与其他物种LXRα的同源性为70.7%~100%,其中与鲤鱼和斑马鱼的同源性分别达100%和94.6%。LXRα基因在草鱼肝胰脏、肌肉、心脏、鳃、精巢、肾脏、脑、脾脏、肠、腹腔脂肪等10种组织中均有表达,其中在精巢中表达水平最高(P0.05),在肌肉中表达水平最低(P0.05);饲喂n-3HUFA可显著抑制草鱼肝胰脏LXRα基因的表达水平(P0.01)。【结论】克隆获得了草鱼LXRα基因cDNA序列,该基因在多种组织中均可表达,其编码的氨基酸序列与其他物种相似性较高,在动物进化中比较保守;n-3HUFA可通过影响草鱼肝胰脏LXRα基因的表达,调控草鱼的脂质代谢。     

运用AS—PCR方法及SOE技术研究猪α干扰素

采用AS－PCR方法和SOE技术相结合的策略，通过找出猪α干扰素基因内部的特异位点，设计引物扩增出两个DNA片段并将其连接为全长基因。所得片段编码序列长501bp，共编码166个氨基酸，与已知PoINF-α1基因有5个碱基差别，导致3个氨基酸不同。     

藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.