转Hu-IFN-α基因草鱼雌核发育F1的遗传配型分析

The Hu-IFN-α gene, which was transducted into downstream promoter of β-actin gene of common carp (Cyprinus carpio), was recombined by DNA recombination technology. These recombined genes were injected into 1-2 cell fertilized eggs of grass carp (Ctenophatyngodon idellus) by microinjection technology, we gained transgenetic fish by molecular detection methods. In order to analyse the genetic expression of tranHu-IFN-α gene gynogensis F₁, which male individualization were gained by raising methyltestosterone, molecular genetic marker technology was used. In our research, 30 random primers were picked out from 48 and were used into RAPD-PCR, the result indicated that 1 169 clear, steady and repeated DNA finger printing bands were achieved. On the basis of gentic distance matrix among tranHu-IFN-α gene gynogenesis F₁ group, the genetic relationship of gynogenesis F₁ were analysed by UPGMA, the results showed the genetic patterns are close between the 3# male gynogenesis F₁ and the the 23# female of gynogenesis F₁, 5# and 27#, 2# and 28#, 2# and 30#. The data indicated that these group could be served as parent of tranHu-IFN-α grass carp (Ctenophatyngodon idellus) pure line.     

重组Hu-IFN-α基因在草鱼中的整合和表达

采用显微注射法将人α干扰素(HuIFNα)重组基因转入草鱼Ⅰ～Ⅱ细胞期的受精卵,然后对转化培育出的草鱼个体提取血液总DNA进行PCR和Southern杂交检测及ELISA检测,以研究重组基因在受体基因组上的整合和表达情况。实验结果显示:HuIFNα重组基因能整合在草鱼基因组上,但其整合是随机的,整合位点没有固定区域,而且整合在受体草鱼基因组上的HuIFNα基因的表达率较低,表达水平在个体间有很大差异。大部分转基因个体外源基因表达水平集中在39～74pg/mL之间,表达最高个体HuIFNα浓度为1450pg/mL。     

异精雌核发育草鱼F1与普通草鱼的SCAR标记鉴别初报

以赤眼鳟生理失活精子诱导的雌核发育草鱼F1群体(CC)和与之母本同源的普通草鱼群体(PC)为材料,采用RAPD和SCAR分子标记相结合的技术,在100条RAPD随机引物扩增的16条有效引物中扩增筛选出7条群体差异条带,其中1条为异精雌核发育草鱼群体中特有,其余均表现为异精雌核发育草鱼群体缺失;对7条RAPD特异条带的回收中仅得到S32和S336的特异条带。经回收、克隆、测序后根据序列信息设计了4对SCAR引物,其中S336的2对SCAR引物在两群体间扩增出的条带一致,特异性消失;S32的2对SCAR引物能扩增出两群体间的特异条带;对S32-Scar1F/S32-Scar1R扩增出的SCAR标记S321643进行大样本检测结果表明:该标记在异精雌核发育草鱼群体中的出现频率为0(0/55),在普通草鱼群体中出现频率为76.7%(46/60)。     

雌核发育草鱼近交F_1代的生化遗传特性

运用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对雌核发育草鱼近交F1代、同龄正常两性生殖草鱼、鲤的乳酸脱氢酶（LDH）、酯酶（EST）、超氧化物歧化酶｛SOD｝以及血红蛋白、血清蛋白进行了分析。结果表明，雌核发育草鱼近交F1代EST、SOD同工酶以及血红蛋白电泳图谱与正常两性生殖草鱼电泳图谱存在有一定差异；雌核发育草鱼近交F1代的生化状性中未直接体现鲤遗传物质的影响。     

雌核发育草鱼的遗传结构分析和微卫星鉴别方法的建立

采用微卫星标记检测草鱼群体的遗传多样性,并根据纯合度的变化建立了雌核发育草鱼的鉴别技术。结果显示,8个位点共扩增出33个等位基因;在普通草鱼中,平均纯合度和PIC分别为0.203 1和0.552 8;在雌核发育群体中,则为0.716 1和0.357 2;2个群体间遗传相似度为0.873 3。其中,5个位点在雌核发育草鱼中纯合度明显提高,雌核发育草鱼在这5个位点的扩增总条带数为5~7个,普通草鱼则为8~10个,由此可100%区分2个草鱼群体。通过概率计算,理论鉴别概率达到99.92%。研究表明,雌核发育技术对草鱼的群体遗传结构改变较大,是快速建立纯系、固定优良性状的有效手段;根据群体遗传纯合度的改变、扩增条带数目差异,应用多态性微卫星分子标记可以简单、有效地区分雌核发育群体(或与之相似的高度近交群体)与普通群体。     

ENU诱变草鱼及其雌核发育后代的微卫星遗传分析

为了获得雌核发育ENU诱变草鱼(Cetpharyngodon idellus)群体的相关遗传参数,实验采用Partec Cy Flow倍性分析仪测定ENU诱变草鱼群体(Q群体)和雌核发育ENU诱变草鱼群体(E群体)相对DNA含量分别为24.02和23.80,二者的DNA含量接近,均为二倍体。选取28个微卫星标记对Q群体和E群体多样性进行了检测。结果表明,E群体和Q群体的平均等位基因分别为3.7143、5.1786,平均有效等位基因分别为2.1857、4.0028,平均期望纯合度分别为0.5122、0.2814,平均期望杂合度分别为0.4878、0.7186,多态信息含量(PIC)平均值分别为0.4282、0.6606。从个体在微卫星位点的纯合率分析,在E群体中,每个个体的纯合度均小于1.00,说明没有完全纯合的个体。从每个微卫星位点在群体的纯合率分析,除了微卫星位点5476,HLJC118和HLJC81外,其他位点的纯合度以不同的速率得到明显的提高。综上所述,经过减数雌核发育方法,ENU诱变草鱼群体的各微卫星位点的纯合度以不同的速率得到提升,遗传多样性明显降低,此方法可以获得纯合度较高的雌核发育ENU诱变草鱼个体,为ENU诱变草鱼良种选育提供了重要的遗传数据资料。     

雌核发育草鱼群体及两个普通草鱼群体的微卫星遗传分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)养殖群体(YZ)为母本,以紫外线灭活的鲤鱼精子激活草鱼卵子,冷休克抑制第二极体排出的方法诱导获得异精雌核发育草鱼群体(CH)。利用12对微卫星引物对YZ群体、YS (扬州广陵长江系家鱼原种场引进草鱼群体)群体、CH群体进行PCR扩增并分析,共检测出194个等位基因,其中75.8个有效等位基因。YZ群体、YS群体、CH群体的平均等位基因数依次为13.0、12.6、4.7;平均有效等位基因数依次是7.7、6.6、2.3;平均期望杂合度依次为0.87、0.82、0.56;平均多态信息含量依次为0.84、0.79、0.49。从每个个体在微卫星位点的纯合率看,YZ群体中个体的纯合度在0.00～0.33, YS群体r中个体的纯合度在0.00～0.42, CH群体中个体的纯合度在0.42～0.92。这表明与YZ群体和YS群体相比,CH群体的遗传多样性显著下降,并且在每个位点的纯合率CH群体均高于普通草鱼群体,表明人工诱导减数雌核发育可加速草鱼大多数基因位点的纯合,是快速建立高纯品系的有效手段。同时,本研究筛选并利用微卫星位点组合建立了雌核发育草鱼子代不同家系及其母本亲缘关系的简易、高效鉴别技术,旨在为雌核发育草鱼标记辅助育种打下基础。     

草鱼自然群体和人工繁殖群体遗传多样性的研究

运用 4 0个 10碱基随机引物对长江中游草鱼自然群体和草鱼人工繁殖群体进行了随机扩增多态DNA (RAPD)分析。在所用引物中 ,有 9个能在草鱼不同个体扩增出多态DNA带 ,占引物总数的 2 2 5 %。结果表明 ,长江中游自然繁殖草鱼群体个体间的遗传相似度在 0 92 94～ 0 986 2之间 ,平均值为 0 96 4 9,遗传变异度在 0 0 138～ 0 0 716之间 ,平均值为 0 0 4 5 1;Shanonn表型多样性指数 (Ho)为 10 0 6 6 4 ;Shannnon多样性值(H)为 0 0 4 6 6 ;草鱼人工繁殖群体个体间的遗传相似度在 0 972 5～ 0 995 4之间 ,平均值为 0 984 2 ,遗传变异度在 0 0 0 4 6～ 0 0 2 75之间 ,平均值为 0 0 15 8;Shannon表型多样性指数为 3 5 732 ,Shannnon多样性值为 0 0 16 5。人工繁殖草鱼群体的遗传变异度和Shannon表型多样性指数均明显低于长江自然繁殖群体。     

草鱼、赤眼鳟及其杂交F1遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD-PCR分子标记技术分析了草鱼、赤眼鳟及其正、反交子一代的遗传多样性。从100条引物中筛选出13条扩增效率高、多态性高的有效引物,对4个群体共120尾个体样本进行扩增,获得115个基因位点,扩增产物大小集中在300~3 000 bp,草鱼、正交F_1、赤眼鳟和反交F_1多态位点率分别为85.22%、77.39%、80.87%和70.43%,Shannon信息指数分别为0.392 4、0.396 9、0.443 3和0.358 3。结果表明,赤眼鳟的遗传多样性最丰富,正交F_1的遗传多样性优于草鱼,反交F_1的多样性最差。遗传同源性和遗传距离聚类分析表明,正交F_1和反交F_1与赤眼鳟的遗传关系更近。种群平均遗传分化指数为0.302 6,表明4个群体之间的遗传分化程度较高,30.26%的变异来源于群体间。     

两个人工雌核发育系鲢近交F1遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD技术对两个人工雌核发育系鲢近交F1遗传距离、遗传相似度及群体遗传多样性进行分析,用普通鲢和鲤作对照。结果表明：GSCⅠ、Ⅱ系近交F1系内个体间平均遗传相似度分别为0．9722、0．9807,高于对照鲢和鲤的0．9546、0．8727;两系近交F1的遗传多样性指数分别为0．0629、0．0529,低于对照鲢和鲤的0．1018和0．2132,表明GSCⅠ、Ⅱ系系内近交的F1保持了较高的纯度。LIPGMA和NJ系统树清晰反映了两个系近交F1与对照组个体问的相互关系。26个随机引物的RAPD扩增结果显示,5个引物OPG04、OPG17、OPP01、OPM11、OPM16可以扩增出区分两个系近交F1的特异标志带。     

草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列克隆与分析

应用PCR和Genome Walking技术克隆获得长度为168 bp的草鱼（ Ctenopharyngodon idellus）α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列和2063 bp的5＇侧翼序列。将草鱼α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列与已知几种鱼类α-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列比对,相似度为68%~86%。将草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列进行生物信息学分析,确定了其转录起始区域及转录起始位点（ TSS）;在TSS上游30 bp处有1个TATA-box,-58 bp处有CCAAT-box;在5＇侧翼序列中还发现有GATA-1、OCT-1、GR、HNF-3、AP1和SP1等转录因子结合位点。草鱼α-淀粉酶基因5＇侧翼序列的克隆,为进一步研究不同食性鱼类α-淀粉酶基因侧翼序列的差异、鱼类α-淀粉酶基因的表达、功能及调控机理奠定基础。     

人工雌核发育鲢近交F2微卫星DNA变异分析

采用17对鲢微卫星引物,以野生鲢、养殖鲢、雄鲤作对照对人工雌核发育鲢近交F2及其亲本进行了微卫星分析。结果表明:人工雌核发育鲢近交F2、养殖鲢和野生鲢群体的平均等位基因数范围为2.1～4.0;平均观测杂合度范围为0.2762～0.9588;期望杂合度范围为0.2774～0.7360;遗传多样性指数范围为0.4500～1.2258,人工雌核鲢近交F2为0.4500,显著低于养殖鲢(1.0273)和野生鲢(1.2258),揭示人工雌核发育鲢近交F2遗传多样性水平较低,纯合度较高。从遗传距离来看,人工雌核发育鲢近交F2与对照群体之间的遗传距离都要大于野生鲢与养殖鲢群体之间遗传距离,表明人工雌核发育鲢近交F2发生了一定程度的遗传分化。     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

雌核发育抗病草鱼养殖对比实验及抗病原因分析

草鱼（Grass carp,Ctenopharyngodon idellus）,鲤科（Cyprinidae,雅罗鱼亚科（Leuciscinae）,草鱼属（Ctenophar yngodon）,是我国主要的淡水养殖品种之一,在水产养殖业中占有非常重要的位置.近年来,由于长期的近亲交配繁殖,草鱼种质衰退严重.具体表现在生长速度减慢,规格变小,病害频发,尤以草鱼出血病、烂鳃病和肠炎病这三大顽疾著称,给广大养殖户和渔业生产造成巨大的经济损失,极大地限制了水养殖业的健康发展.     

雌核发育橙黄色锦鲤的遗传、性腺发育及外形等特征研究

用经紫外线灭活的团头鲂精子激活橙黄色锦鲤的卵子,在4℃的水温下冷休克处理卵子30 min使其染色体加倍,获得了孵化率为30.6％、存活率为24.2％的雌核发育锦鲤,表明该雌核发育锦鲤研制方法具有较高的效率.利用外周血细胞培养方法制备了雌核发育锦鲤染色体并利用核型分析方法对其核型进行了分析,发现雌核发育锦鲤染色体数目为100,核型公式为22 m+34 sm+22 st+22 t;表明雌核发育锦鲤为二倍体,其核型与锦鲤母本一致.利用石蜡切片方法,随机选取10尾1龄雌核发育锦鲤性腺进行检测,发现其性腺全部为卵巢;并且在繁殖季节随机检测100尾2龄雌核发育锦鲤,没有l尾能挤出精液,表明雌核发育锦鲤全部为雌性,为证明雌性锦鲤的性别决定类型为XX提供了重要证据.此外,还对雌核发育锦鲤与母本的的SOX基因遗传关系、外形、体色等进行了比较,结果表明雌核发育锦鲤与母本有相同的SOX基因扩增片段,为证明其为雌核发育锦鲤而非杂交后代提供了重要证据;同时,雌核发育锦鲤保留了母本体态优美的特点,且具有色泽更鲜艳等优点,表明该雌核发育方法产生了遗传改良效果.雌核发育锦鲤的获得为该观赏鱼的提纯复壮、遗传改良以及性别决定和性别控制研究奠定了基础.     

草鱼PGC-1α基因的表达及饲喂n-3 HUFAs对其影响

获得了草鱼过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)部分cDNA序列(GenBank注册号为HM015283),并进行了序列同源性分析;采用实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法,检测了PGC-1α基因在草鱼不同组织的表达状况;研究了投喂高不饱和脂肪酸(HUFAs)对草鱼肝胰脏PGC-1α基因时序表达的影响。结果显示,所获得的草鱼PGC-1α基因部分cDNA序列长度为612bp,与人、牛、小鼠、斑马鱼和金鱼等动物的同源性为75%～97%;该基因在草鱼肝胰脏、肾脏、肌肉、心脏、鳃等10个组织中均有表达,其中在肾脏和心脏中表达丰度最高,在精巢和脾脏中表达丰度最低;草鱼摄食HUFAs饲料后第7天PGC-1α基因的表达水平极显著升高,随后又迅速下降。研究首次克隆得到草鱼PGC-1α基因部分cDNA序列,并发现该基因在草鱼能量代谢水平高的组织中表达较高,且其表达受到HUFAs的调控,其时序表达模式为先升高,然后恢复到正常水平。     

团头鲂耐低氧新品系雌核发育群体遗传结构的微卫星分析

为了指导团头鲂耐低氧群体的后续选育工作开展,利用筛选出的20对微卫星引物,比较分析了团头鲂耐低氧群体(TN)及其减数分裂(TNM)、有丝分裂(TNDH)雌核发育后代群体的遗传结构;结果显示,团头鲂TN、TNM、TNDH及团头鲂"浦江1号"(TPJ1)对照的平均等位基因数(N_a)分别为3.90、3.55、3.45、4.25,平均观测杂合度(H_o)分别为0.7853、0.3934、0.2768、0.8075,平均期望杂合度(H_e)分别为0.6491、0.5563、0.4870、0.6855,平均多态信息含量(PIC)分别为0.5695、0.4796、0.4181、0.6105,TPJ1对照群体的遗传多样性最高,TN群体较TPJ1群体的遗传多样性有所降低,但不存在显著差异,仍保持了较高的遗传杂合度,而2个雌核发育群体(TNM和TNDH)的遗传多样性显著低于TPJ1和TN群体,TNDH群体的遗传多样性显著低于TNM群体。Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数也表明团头鲂TPJ1和TN群体出现杂合子过剩现象,而TNM、TNDH雌核发育群体则出现了杂合子缺失现象,纯合子比例高。聚类分析表明,TPJ1和TN群体聚类成一个分支,而TNM、TNDH雌核发育群体聚类成另一分支,产生了一定程度的遗传分化。在TN群体中实施雌核发育可加速遗传物质的纯合,可用于团头鲂进一步耐低氧性状基因的纯化。     

牙鲆连续四代减数分裂雌核发育家系的遗传特征分析

为了研究纯合度和遗传相似度在牙鲆(Paralichthys olivaceus)连续四代减数分裂雌核发育家系中的变化规律,本研究利用分布在不同连锁群上的24个高重组率微卫星标记对牙鲆连续减数分裂雌核发育二代(G2)、三代(G3)、四代(G4)家系及普通家系对照组进行了遗传分析。结果显示,24个微卫星位点在对照组、G2、G3、G4家系中,分别检测到96、42、32和32个等位基因,平均等位基因数分别为4.00、1.98、1.33和1.33;期望杂合度分别为0.6416、0.3472、0.1694和0.1492;纯合度分别为0.3503、0.6528、0.8306和0.8508;遗传相似系数分别为0.5822、0.9238、0.9890和0.9988。24个位点中已有17个纯合,但尚有7个保持杂合状态。同时,将上述结果和已发表的减数分裂雌核发育一代(G1)家系的数据进行分析,结果表明,诱导连续减数分裂雌核发育不仅能提高个体的纯合度,同时也可提高子代个体间的遗传相似度;纯合度和遗传相似度在G1、G2和G3家系中能够得到逐步提高,代际之间差异显著(P<0.05);但在G4家系中趋于稳定,与G3家系差异不显著。G4家系的遗传相似性(0.9988)已高于连续20代全同胞交配所获得的理论值(0.9860),连续诱导减数分裂雌核发育是快速建立鱼类近交系的良好方法。     

牙鲆连续两代减数分裂雌核发育家系的遗传特征

对牙鲆(Paralichthys olivaceus)减数分裂雌核发育二倍体(Meio-G1)再次诱导减数分裂雌核发育,获得连续两代雌核发育二倍体家系(Meio-G2),以Meio-G1亲本与1尾普通牙鲆雄鱼人工授精获得的家系作为对照组(control)。利用15个微卫星标记对3个家系进行遗传特征分析。结果显示,15个微卫星位点在Meio-G1、Meio-G2和对照组3个家系中,分别扩增到30、28、50个等位基因,平均等位基因数为2.0、1.9、3.3,平均观测杂合度(Ho)分别为0.875 3、0.774 2、0.908 3,平均纯合度分别为0.124 7、0.221 5、0.091 7。3个家系个体间的平均遗传相似系数分别为0.891 7、0.923 8、0.520 2,亲代与子代之间的平均相似系数分别为0.916 6、0.930 4、0.560 3。高重组率的Poli9-8tuf、Poli18tuf、Poli107tuf 3个位点在Meio-G1和Meio-G2中观测杂合度均为1.0,低重组率的Poli33tuf、Poli24MHFS两个位点在Meio-G1和Meio-G2中均全部纯合,观测杂合度为0。结果表明,Meio-G2的纯合度、个体间平均相似系数以及亲子之间的平均相似度均略高于Meio-G1,显著高于对照组家系,证明连续两代诱导减数分裂雌核发育,能提高鱼类纯合度和遗传相似度,具有固定母本遗传性状的作用。