口蹄疫病毒R株基因组序列分析研究

根据GenBank上发表的口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）全基因序列数据，设计了多对引物，采用RT-PCR的方法，分别对R株编码区和非编码区基因进行扩增，将各片段克隆至pMD18-T载体，进行核苷酸序列测定．按顺序拼接各基因的序列，将结果序列与GenBank上各FMDV毒株的序列进行比较和同源性分析．序列的比较和分析表明，R株编码区全长为6966个核苷酸，共编码2322个氨基酸；非编码区5’端内部核糖体结合位点（intemal ribosome entry site，IRES）长约450个核苷酸，3’非翻译区（untranslatable region，UTR）从TAA始至Poly（A）前长度为94个核苷酸，所测出Poly（A）尾长度为18个核苷酸．与GenBank世界流行毒株的序列比较，编码区核苷酸序列同源性为88％～90％，推导氨基酸序列同源性为88％～95％．     

口蹄疫病毒G-01株基因组编码区的序列分析

参考GenBank中注册的O型口蹄疫病毒(FMDV)全基因序列,分段设计了9对引物,应用RT-PCR方法对G-01株的基因组编码区序列进行了克隆和序列测定,获得了该毒株基因组编码区的核苷酸序列(6 966 bp)并推导出其编码的氨基酸序列(2 322 aa).将获得的G-01株基因组编码区的核苷酸序列与参考的14株FMDV基因序列进行比较,结果表明,本毒株的3A蛋白的92～101位缺失10 aa,VP1基因的133～160位的关键位点没有变化,该毒株与以HKN/2002株为代表的7株O型毒株的同源性较高,与HKN/2002株遗传关系最近,而与另外7株O型毒株同源性较低,其遗传关系也较远.由此推断G-01与HKN/2002株属于遗传关系较近的毒株,这2株病毒有着相同的进化起源.     

口蹄疫病毒泛亚株全衣壳基因克隆和序列结构分析

应用RT PCR和nPCR实现了口蹄疫病毒O/PanAsia/10株的全衣壳基因的克隆和序列测定.对核苷酸和氨基酸的序列分析表明,与经典O型毒株比较存在较大变异.其中4种结构蛋白的变异顺序是VP1>VP3>VP2>VP4.P1基因G+C值约55%.全衣壳蛋白相对分子质量约8 0×104.主要结构蛋白VP1呈碱性,等电点约9 5.     

35株非洲猪瘟病毒全基因组序列的系统生物学分析

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)源于非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)感染所引起的烈性传染病,主要是以蜱和野猪为天然宿主。ASFV感染能够导致家猪及野猪直接死亡,死亡率近乎100%。目前在非洲、欧洲、亚洲等地区均出现大面积爆发,却尚未出现对该病毒进行预防的商业化疫苗。因此,需要对病毒基因组信息有更深入的了解。通过对不同地区发生的ASFV全基因组进行多序列比对、系统进化树构建、保守区域检测等,获得与ASFV毒力、进化等相关的基因片段,并研究这些基因片段在不同区域的病毒株中的关系。结果表明:Ⅶ与Ⅱ基因型相比较,后者出现很多大片段基因序列的增加,这些增加的片段主要出现在V110、360、505/530多基因家族中。其中,对多基因家族中MGF 505/530-7R、MGF360-1L基因研究分析表明,不同基因型之间由于这些基因的差异影响巨噬细胞的存活能力、病毒复制强弱与病毒变异和进化有关,结果为研究病毒进化及未来病毒疫苗研发提供新的方向。     

A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列的测定及其基因特征分析

[目的]测定A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列并分析其基因特征,为研究我国最近发生的A型口蹄疫病毒的致病性、流行规律以及筛选适用的疫情防控疫苗株奠定分子基础。[方法]应用RT-PCR方法,分段扩增、克隆A/HeN/1/2009株基因,并进行基因测序;借助DNAStar分子生物学软件,从分子流行病学角度分析A/HeN/1/2009株与参考毒株之间可能的遗传衍化关系。[结果]该毒株基因组全长8 171 nts[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],其中5'-UTR和3'-UTR分别为1 080、92 nts,蛋白编码区为6 999 nts。分析A/HeN/1/2009株遗传衍化关系显示,该毒株划为东南亚拓扑型Laos03系的VN09亚系,同源性依次为87.3%～91.8%、93.7%～94.5%和96.9%～98.4%。[结论]VP1中A24V、N85R、S196T,3A中I61V、T128S、E147G和A134V在该毒群的进化过程中扮演重要角色;A/SH/1/2009株VP1 140-160基序为RSD。     

Asia1型口蹄疫病毒基因组的测序分析

对中国口蹄疫病毒Asia1/JS/2005毒株的全基因组进行了分段扩增并测序。结果表明,该毒株的基因组全长为8 174 nt,其中 5’UTR 为1 092 nt;ORF为6 990 nt;3’UTR为92 nt。利用DNAstar软件对该毒株和Asia1型其他24毒株基因组序列进行同源性分析表明,该毒株的非结构蛋白和5’UTR比较保守。研究还发现了可能与生物学功能相关的新的保守和变异区域。系统树分析表明Asia1/JS/2005, Asia1/1/YZ/2006,Asia1/WHN/2006,Asia1/HN/2006和Asia1/YS/2005属于同一分支,表明这些毒株间有着紧密的遗传关系,其中与其亲缘关系最为密切的是Asia1/YS/2005。     

常规PCR法扩增口蹄疫病毒基因组5’端序列的探索

【目的】扩增口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)基因组5’端序列,为获得基因组全长准备基础。【方法】将FMDV O/Akesu/58 CE39A株液氮冻存基因组RNA反转录三次,对c DNA的5’端序列进行扩增、克隆、测序。【结果】以c DNA1与c DNA3为模板,用LA Taq DNA polymerase、EX Taq DNA polymerase、Prime STARHS DNA polymerase及3对引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均未扩增出5’端目的片段;以c DNA2为模板,用LA Taq DNA polymerase为扩增酶,两对引物Ⅰ、Ⅱ均能扩增出5’端目的片段,且所测得的序列长度787 bp、797 bp与参考序列核苷酸同源性分别为86.2%和86.3%。【结论】常规PCR法扩增5’端序列较其它技术具有价格便宜、操作简便等优点,但扩增成功率偏低。试验共进行了72次PCR,成功率为6/72,说明FMDV 5’端序列的扩增难度大,应合理设计反转录引物和扩增引物。为许多RNA病毒反向遗传学研究提供了更多的选择。     

三桠苦叶绿体基因组结构和序列特征分析

为了探明岭南地区特色中药三桠苦的叶绿体基因组结构和序列特征,以三桠苦叶片为材料,采用试剂盒法提取DNA和构建测序文库,利用Novaseq平台进行高通量测序,再结合生物信息学手段进行序列拼接、注释和特征分析。结果显示：三桠苦叶绿体基因组为158 992 bp的环状四分体分子,含有134个基因;在三桠苦叶绿体基因组内找到86个简单重复序列,主要是A/T单核苷酸重复;检测到26 907个密码子,以A/T结尾的密码子有着更高的使用频次;序列比较分析表明,三桠苦与同科植物在非编码区存在更明显的序列变异;系统进化树揭示不同来源的三桠苦亲缘关系最近,但在基因组成和碱基序列上呈现出多样性。     

五指毛桃叶绿体基因组结构与序列特征分析

【目的】阐明药食两用植物五指毛桃的叶绿体基因组结构及其系统进化关系,为其资源利用和产品开发等研究提供基因组信息。【方法】采用高通量测序技术对五指毛桃叶绿体基因组测序,并借助生物信息工具和软件进行序列拼接、注释、比对和系统进化分析。【结果】五指毛桃叶绿体基因组为环状双链四分体分子,长度160 340 bp, GC含量为35.9%,包含130个基因。该基因组含有26 679个密码子,偏好使用以A/T结尾的密码子;共有93个简单重复序列,其中以A/T形成的单、二核苷酸重复为优势重复基序。五指毛桃与其他榕属植物相比,叶绿体基因组序列同源性较高,碱基变异位点数量较少,主要分布在非编码区域如rpoB-trnC、trnT-trnL、rpl32-trnL等,与薜荔具有最高的序列相似度。【结论】五指毛桃叶绿体基因组具有典型的高等植物叶绿体基因组结构和基因组成,存在密码子偏好性,包含类型丰富的简单重复序列,且与同属植物薜荔的亲缘关系最近。     

猪细小病毒河南分离株全基因组克隆及序列分析

[目的]进一步了解河南地区猪细小病毒(PPV)的变异特点.[方法]利用PCR方法,对河南郑州、周口、济源等地采集的疑似PPV感染的病料进行检测.PCR检测为阳性的病料经处理后,同步接种猪睾丸细胞盲传6代,对4株PPV全基因组进行分段克隆及测序,并与GenBank登录的国内外PPV流行株全基因组进行比较.[结果]获得的4株PPV全基因组序列全长均为4679 bp.4个毒株之间的核苷酸同源性介于99.6％ ～99.8％,与其他毒株间核苷酸同源性为98％～100％,遗传进化较为稳定.[结论]为PPV在河南地区分子流行病学调查及遗传变异分析奠定了基础.     

口蹄疫病毒诱导PK-15细胞发生自噬的研究

[目的]探究Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能否诱导自噬的发生,分析细胞自噬对口蹄疫病毒复制的影响。[方法]用未经处理的PK-15细胞和自噬抑制剂3-MA处理的PK-15细胞分别感染口蹄疫病毒,通过蛋白免疫印迹和共聚焦激光显微镜检测自噬的诱导情况。[结果]自噬标志分子LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白水平的比值增加,并且LC3特异的绿色荧光聚集;自噬抑制剂3-MA处理细胞后口蹄疫病毒复制水平显著上调。[结论]Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能够诱导发生自噬,而自噬又促进口蹄疫病毒的复制。     

利用离子交换层析方法分离与纯化口蹄疫病毒抗原

[目的]利用离子交换层析方法分离与纯化口蹄疫病毒抗原。[方法]利用阴离子交换树脂制备高纯度的FMDV抗原,通过对样品及缓冲液pH、流速、缓冲液的盐浓度、样品上样体积等条件的摸索,确定最佳的FMDV抗原洗脱条件。[结果]当缓冲液pH为8.0、流速1.2 m L/min、盐浓度450 mmol/L、上样体积1.5 m L时,FMDV抗原的纯化效果最佳。[结论]该研究结果可为离子交换层析在FMDV抗原的分离与纯化提供依据。     

猪ESD真核表达质粒的构建及其抑制口蹄疫病毒复制的研究

[目的]探究猪ESD蛋白的抗病毒功能,通过构建猪ESD真核表达质粒,研究其是否能够抑制口蹄疫病毒在PK-15细胞中的复制。[方法]从PK-15细胞中提取总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增出猪的ESD基因,构建到pc DNATM3.1/Myc-His A真核表达载体上。通过Western blotting和实时定量PCR检测ESD蛋白的表达情况及其抗病毒功能。[结果]获得了猪ESD真核表达载体,转染后能够正常表达。FMDV感染PK-15细胞后,ESD转录水平显著上调;过表达ESD蛋白显著抑制FMDV的复制;下调表达ESD蛋白显著促进FMDV的复制。[结论]猪ESD蛋白能够抑制FMDV在PK-15细胞中的复制。     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒组装研究

[目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础.[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒样颗粒.[结果]大肠杆菌表达的口蹄疫衣壳蛋白主要以可溶性存在,在缓冲体系中融合标签被切除衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成病毒样颗粒,其大小约25 nm左右.FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入没有影响衣壳蛋白VP1的空间结构.[结论]口蹄疫loop可变区引入外源抗原是可行的,但外源多肽的大小及理化性质会影响病毒样颗粒的组装效率.     

口蹄疫植物疫苗的研究进展

植物疫苗是利用植物表达重组抗原蛋白来生产疫苗。在植物中表达的抗原能够保持其自身的免疫原性。论文简要阐述了近10年来用植物表达系统生产口蹄疫疫苗的研究进展、优缺点及其应用前景。     

口蹄疫病毒O型病毒VP1蛋白表达及鉴定

利用大肠杆菌p ET-30a表达系统表达口蹄疫病毒(FMD)O型野毒株完整的VP1蛋白,并以Western blot试验进行鉴定。结果表明:VP1蛋白以可溶性表达,大小约为25 ku,可与标准O型口蹄疫病毒阳性血清特异结合。由此说明,口蹄疫病毒VP1原核表达蛋白有良好的反应原性,为构建口蹄疫病毒病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)和快速特异诊断试剂研制奠定基础。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

口蹄疫的流行与防制

口蹄疫(FMD)是一种危害严重的偶蹄动物传染病,本文从流行病学、临床病理变化以及消毒技术、治疗措施和疫病控制等方面对口蹄疫的流行与防制的研究作以综述.     

口蹄疫病的预防控制

介绍了口蹄疫病的病原,分析了其致病特点和临床表现,最后详细研究了其预防和控制的措施。