猪血管紧张素转化酶2重组蛋白诱导表达和纯化条件的优化

[目的]本文旨在探索猪血管紧张素转化酶2(ACE2)在大肠杆菌中最佳表达条件和纯化蛋白的最佳方法。[方法]将已构建好的猪重组表达载体p ET-32a-ACE2转染至大肠杆菌BL21(DE3),通过改变IPTG诱导浓度以及诱导时间来对诱导表达条件进行筛选,实现目的蛋白高效表达后选用Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法,对获得的重组猪p ET-32aACE2融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE和免疫印迹等分析鉴定表达产物。[结果]当IPTG浓度为1 mmol·m L-1、诱导时间为10 h时,ACE2蛋白在BL21(DE3)中表达量最高,以包涵体形式存在。表达产物的相对分子质量约为100×103,与预期目的蛋白大小相符。选用的Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法纯化重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性。[结论]本试验建立猪p ET-32a-ACE2重组蛋白诱导表达的最佳条件:IPTG浓度1 mmol·m L-1,诱导时间为10 h。并且以KCl染色切胶法纯化该重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体效果更好。     

ω-ACTX-Hv1a与AcNPV poledrine基因的重组及重组融合蛋白的表达

合成ω-ACTX-Hv1a基因,并与斜纹夜蛾多角体蛋白(AcNPV Polyhedrin)基因重组,构建重组蛋白表达载体并在大肠杆菌中表达融合蛋白。通过对温度、时间和IPTG诱导浓度等诱导条件的改变,以获得最佳诱导表达条件,所获得的最大量的融合蛋白经初步的纯化获得纯度为大约90%。获得ω-ACTX-Hv1a与polyhedrine基因的重组蛋白工程菌株,为此基因应用于杀虫剂奠定了基础。     

油松苯丙氨酸解氨酶基因原核表达载体的构建及表达分析

利用基因重组技术,以油松PAL基因(TaPAL) CDS区(2 157 bp)作为外源基因的同源重组片段,构建了pET-28a-TaPAL重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达并进行分析.经SDS-PAGE电泳检测,在分子量80 KD处获得一条特异蛋白的表达条带,且其大小与预期相符.在温度28℃,IPTG浓度1.5 mmol· L-1,时间3h条件下,重组质粒的表达量最大.可溶性分析表明,在最佳诱导条件下,该蛋白主要以包涵体形式存在.粗酶活性测定表明,粗酶(在20℃、IPTG浓度1 mm01·L-1条件下诱导10 h)比活力为55.3μmol·min-1·gpro-1,即55.3U·g-1.构建的pET-28a-TaPAL重组载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出具有生物活性的融合蛋白.     

ω-ACTX-Hv1a与AcNPV polyhedrine基因的重组及重组融合蛋白的表达

合成ω-ACTX-Hv1a基因,并与斜纹夜蛾多角体蛋白(AcNPV Polyhedrin) 因重组,构建重组蛋白表迭栽体并在大肠杆菌中表达融合蛋白.通过对温度、时间和IPTG诱导浓度等诱导条件的改变,以获得最佳诱导表达条件,所获得的最大量的融合蛋白经初步的纯化获得纯度为大约90%.获得ω-ACTx-Hv1a与polyhedrine基因的重组蛋白工程菌株,为此基因应用于杀虫剂奠定了基础.     

红鳍东方鲀FoxO1基因的原核表达及纯化

采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA,采用RT–PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF,并构建其原核表达载体p ET–32/FoxO1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,通过IPTG诱导表达,对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定,结果表明:重组质粒p ET32a/FoxO1被成功构建;用IPTG进行诱导表达,融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应;纯化出了融合表达蛋白,获得了相对分子质量约为110 000的重组蛋白。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

牛樟芝se原核表达载体构建及重组蛋白的表达、纯化

鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)是多数中草药植物、药用菌中三萜合成途径中的限速酶,能影响三萜含量的积累。构建了牛樟芝鲨烯环氧酶基因(se)原核表达载体,并进行其重组蛋白诱导表达条件优化。以牛樟芝c DNA为模板扩增se,纯化后将其克隆到p MD18-T载体上,筛选阳性克隆并将其连接到原核表达载体p ET28a,构建重组质粒p ET-28a-se,经酶切验证后转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,利用L9(34)正交试验优化目的蛋白诱导表达条件及纯化。结果表明,不同正交处理间的蛋白表达差异显著(P0.05),其诱导因素的主次为时间温度IPTG浓度,诱导时间对重组蛋白表达影响最显著(P0.05)。而IPTG浓度和温度对重组蛋白表达影响并不显著(P0.05),且当IPTG终浓度为0.2 mmol/L,诱导时间为7 h,诱导温度为26℃时,对SE重组蛋白的诱导效果最佳。     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中稳定表达条件的优化及纯化

将狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因按正确的读码框克隆至GST融合表达载体pGEX-4T-1中,转化至大肠杆菌Rosetta株,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,相对分子量约为82 kD,与预期大小一致。Western-blot检测结果表明,融合蛋白能与多克隆阳性血清发生特异性反应。为获取大量ELISA包被用核蛋白,试验还借助SDS-PAGE方法对重组目的基因的表达条件进行了优化,比较了诱导温度、菌密度I、PTG浓度、诱导时间等参数对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件。结果表明:27~32℃,OD5500.3~0.4,IPTG 0.06 mmol/L、诱导至OD550值不再增加时为最佳诱导表达条件。优化后经扫描分析显示,所表达融合蛋白占菌体总蛋白的20%以上。经包涵体纯化和亲和层析纯化,可获得纯度较高的GST融合蛋白。     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.     

海州香薷金属硫蛋白(EhMT1)的原核表达和纯化及其多克隆抗体的制备

为研究耐铜植物海州香薷的金属硫蛋白(EhMT1)的结构与功能,运用分子生物学方法构建了pGEX-2T-EhMT1重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达得到大小为33×103左右的融合蛋白GST-EhMT1,与预期结果一致.对融合蛋白诱导表达的温度、时间、IPTG诱导浓度等条件进行了优化,成功构建了能大量表达可溶性GST-EhMT1的优良原核表达体系.诱导表达的融合蛋白经GST-Sepharose亲和层析纯化后,每升菌液获得的可溶性融合蛋白高达70 mg.用纯化的融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到较高的多克隆抗体效价.蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清可以特异性结合.     

蜡梅nsLTPs基因家族4个成员的原核表达研究

[目的]利用现代分子生物学技术探索蜡梅（Chimonanthus praecox）资源的药用价值。[方法]在有关蜡梅生物学特性研究基础上,构建蜡梅非特异性脂转移蛋白（nsLTP）基因家族4个成员（GenBank登录号：FJ889521、FJ904082、FJ904083、FJ904084）的原核表达载体CpLTP1-pET、CpLTP2-pET、CpLTP3-pET、CpLTP4-pET,并对诱导温度、IPTG浓度和诱导表达时间等条件进行了优化。[结果]在1.0mmol/L IPTG、37℃常规诱导条件下诱导6 h可获得高效表达,总表达产率可达到细菌全蛋白质总量的50%以上,包涵体表达远高于可溶性蛋白的表达;在0.5 mmol/L IPTG、28℃条件下诱导6 h能够获得较好的可溶性表达,利用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒获得4个纯化的重组蛋白。[结论]成功构建蜡梅nsLTP的原核表达载体,转化大肠杆菌Origami2（DE3）获得4个纯化的重组蛋白,可为后续的抗菌抗病毒活性研究提供研究材料,并为蜡梅资源药用价值的开发提供研究思路。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组长约15kb,含有8个开放的阅读框架（ORFs）。PRRSV基因组的顺序依次为：5’-ORFla-ORFlb-ORF（2—6）．ORFT-3’。鲁韦韦等分析表明,PRRSV的ORF7基因保守性较好,变异较小。此外,ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白）具有良好的免疫原性及反应原性,机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的。因此,N蛋白常可作为诊断抗原来检测PRRSV。     

重组麻疯树核糖体失活蛋白表达及其体外抗肿瘤活性研究

[目的]研究重组麻疯树核糖体失活蛋白的表达及其体外抗肿瘤活性。[方法]从麻疯树叶中克隆了curcin基因,在此基础上构建pET-22b/curcin重组表达载体,在大肠杆菌中成功表达29 KD的重组蛋白。[结果]经0.5 mM的IPTG在30℃诱导6 h,重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%,重组curcin以包涵体的形式表达。经溶解、复性、纯化,获得了纯度为95.6%的重组curcin蛋白。[结论]体外研究表明,重组蛋白对A549、HepG2的肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用,其IC50分别为92.246和691.42μg/ml,但是对HELA细胞增殖没有明显抑制作用。     

拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达研究

[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达.[方法]构建XCD1原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1,将XCD1连接到原核表达载体pET-32a＋,并对重组质粒进行测序鉴定,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3）,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.IPTG诱导表达获得目的蛋白,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.[结果]XCD1序列全长为1 242bp,与PCR产物大小一致.蛋白XCD1-pET-32a＋较适表达条件为在30℃0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5h.[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础.     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析

[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备

[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

鸭leptin基因在大肠杆菌中的融合表达及生物学活性分析

 【目的】研究鸭leptin在体外高效表达特点，探讨表达产物的生物学活性及其功能。【方法】构建重组鸭leptin基因原核表达菌株，重组菌株经不同浓度IPTG和不同时间诱导后，对表达蛋白进行提取、纯化、复性和浓缩，经注射昆明小鼠后，对小鼠的体重﹑采食量和体脂含量进行分析。【结果】鸭leptin在大肠杆菌中实现了高效特异性融合表达，融合蛋白分子量约为20 kD，其中16 kD为鸭leptin基因表达产物，目的蛋白在0.2 mmol•L-1 IPTG的诱导下，表达量最高约占菌体总蛋白的57%。重组蛋白纯化﹑复性﹑浓缩后，能够明显降低小鼠摄食量、体重和体脂含量。【结论】鸭leptin基因在大肠杆菌中进行了高效融合表达，表达产物具有明显的生物学活性。     

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(HgN2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9.将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代...