水稻幼穗响应稻曲病菌毒素胁迫早期的转录组分析

【目的】由稻曲病菌引起的稻曲病不仅造成水稻减产,而且还会产生对动物和植物有毒的真菌毒素。探明水稻幼穗对稻曲病菌毒素胁迫响应的分子机制,可为发掘水稻抗稻曲病基因以及抗病分子育种开辟新的思路。【方法】用稻曲病菌毒素处理水稻幼穗,采用转录组测序技术对水稻幼穗进行转录组测序,以水稻9311基因组作为参考基因组进行对比,利用TPM法计算基因表达量,设定参数（差异倍数的绝对值不小于2,且q值不大于0.05）筛选差异表达基因。结合基因差异表达分析、富集功能分析,鉴定水稻响应胁迫的关键基因,并利用实时荧光定量PCR技术对差异表达基因进行验证。【结果】在稻曲病菌毒素胁迫12 h后,水稻幼穗出现2526个差异表达基因（DEG）;通过GO富集、KEGG代谢途经和KOG功能分析,将差异基因划分为GO功能下的64个条目、32个代谢途径和KOG功能下23个类别,包括淀粉和蔗糖代谢、苯丙类生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸糖代谢等生物学过程。DEG中有66个植物转录因子,分属7种植物转录因子家族,包括WRKY和Myb两大转录因子。分析二萜类生物合成与淀粉和蔗糖代谢途径相关基因发现,OsCPS2、OsKSL4和细胞色素P450等基因表达量上调,而淀粉酶、β-呋喃果糖苷酶和UDP-焦磷酸化酶等基因表达量下调,推测这些基因在水稻响应稻曲病菌毒素胁迫时发挥重要的作用。【结论】稻曲病菌毒素作为非生物胁迫因素对水稻幼穗具有毒性;通过干扰淀粉和蔗糖代谢等途径而影响种子营养物质的合成,降低水稻抵抗病原菌侵染水稻的能力。     

菜豆壳球孢侵染芝麻过程中内参基因的筛选

为选择适合菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)侵染芝麻过程中实时荧光定量PCR分析的内参基因,11个基因作为候选内参基因。经过PCR扩增效率筛选,β-肌动蛋白(ACTB)、泛素连接酶(UBC)、α-微管蛋白(TUBA)、γ-微管蛋白(TUBC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、核糖体蛋白S5(RPS5-a,RPS5-b)和内部转录间隔区(ITS)8个基因符合要求,可用于稳定度筛选。利用实时荧光定量PCR技术,检测了这8个候选基因在菜豆壳球孢侵染芝麻8h、16h、24h和32h的表达情况。经Ge Norm软件分析,ACTB、GAPDH和RPS5-b等3个基因表达较稳定。经过最适内参基因数目分析,在菜豆壳球孢侵染芝麻过程中基因定量表达分析时,选择ACTB、GAPDH和RPS5-b的多基因组合作为内参,能够更准确地校正定量结果。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

苎麻实时定量PCR体系的建立

荧光定量PCR技术目前应用比较广泛,但是RNA质量、反转录效率、扩增效率和内参基因的选择等都会影响实时荧光定量PCR技术的准确性。研究以3个苎麻品种为材料,采用actin作为内参基因,利用2个苎麻基因进行实时定量PCR体系的建立。结果表明,采用试剂盒法提取的RNA可以满足RT-qPCR技术的要求,扩增曲线和熔解曲线都符合实验要求,actin基因可以作为内参进行苎麻相对定量分析研究。相对定量分析表明,研究建立的RT-qPCR方法可以应用于基因表达水平的研究。该研究为实时定量PCR在苎麻中的应用提供了参考。     

多个稻曲病菌效应因子的信号肽验证和表达分析

【目的】信号肽对效应因子的分泌至关重要,影响病原微生物的致病进程。前期鉴定到在稻曲病菌侵染水稻花器官过程中显著上调表达的10个效应因子基因,但这些效应因子是否含有功能性信号肽及其表达模式尚不明确。【方法】利用SignaIP-5.0数据库预测、烟草瞬时表达系统和酵母信号肽分泌实验,分析并鉴定这些效应因子的信号肽。利用实时荧光定量PCR技术,检测效应因子基因的表达模式。【结果】UV＿44、UV＿1548、UV＿1567等10个稻曲病菌效应因子均含有信号肽。烟草瞬时表达结果显示,含有信号肽的eYFP融合蛋白在细胞质壁分离后均能分泌到质外体空间。酵母菌信号肽分泌结果显示,分别携带这10个信号肽的酵母菌株可在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长,且与TTC发生显色反应。实时荧光定量结果表明,除了UV＿6754,其余9个效应因子基因的表达模式不尽相同,其中UV＿44、UV＿1567、UV＿3667、UV＿4213、UV＿4989、UV＿5215和UV＿8184的表达量在接种后显著升高。【结论】这10个稻曲病菌效应因子均含有分泌功能的信号肽,编码效应因子的基因在稻曲病菌侵染过程中具有不同的表达模式。该结...     

甘蔗基因表达定量PCR分析中内参基因的选择

以甘蔗接种黑穗病菌后0、6、12、24、48、60和72 h时间点的材料为研究对象,应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR Real-time qPCR)技术,探讨25S rRNA、GAPDH、β-actin和β-tubulin4个内参基因mRNA水平的表达情况.经geNorm程序统计学分析,4种内参基因的表达稳定性各异,25S rRNA>GAPDH>β-actin>-tubulin,其中以25S rRNA表达稳定性最好,且根据该基因设计的两对定量PCR引物都是可行的.同时,甘蔗PPO基因表达特性的定量PCR分析也显示,甘蔗PPO基因与植物的抗病性相关.结果显示,研究中所筛选的内参基因是合适的.     

澳洲坚果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

澳洲坚果是重要的热区经济作物,目前国内外尚无关于澳洲坚果实时荧光定量PCR分析内参基因的报道。选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的先决条件。为筛选澳洲坚果实时定量PCR最适内参基因,以澳洲坚果的根、茎、叶、果皮、果仁为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA,Actin,CYP,EF1a,EF1b,GAPDH,MDH,TUBa,TUBb,UBQ,UBC等11个常用的内参基因在澳洲坚果不同组织中的表达稳定性进行了分析。geNorm软件分析的最适内参基因数目为2,最稳定内参组合为MDH和EF1b,TUBa基因的稳定性最差。BestKeeper分析结果认为,MDH基因表达最稳定,EF1b次之,与geNorm结果一致。NormFinder软件稳定性分析显示,GAPDH最稳定,其次是CYP基因;TUBa基因表达最不稳定。ΔCt算法结果表明,18S基因表达最稳定,其次是GAPDH基因,MDH和EF1b排第3和第4。RefFinder综合排序为：MDH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ> TUBa。因此,MDH基因在澳洲坚果不同组织中表达最稳定,初步确认可以作为实时荧光定量PCR分析的校正内参基因,在澳洲坚果的基因表达模式分析中具有重要意义。     

菠萝蜜实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选菠萝蜜实时荧光定量PCR研究用的内参基因,以菠萝蜜不同发育阶段的果实、叶和花序为材料,分析GAPDH、18S rRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin 5个内参基因的表达情况,并对其表达稳定性进行分析。结果表明,在各组织不同发育阶段中,5个内参基因的表达丰度变化存在差异;geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种方法得出的结论有所不同,经RefFinder综合评价后,果实中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA;叶片中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin;花序中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。     

模式植物狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的内参基因actin及其应用

为了研究应用于狗尾草响应不同干旱及盐胁迫基因表达的内参基因,本研究从网站https://phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html上获得狗尾草A10品系8个actin基因的cDNA序列,设计荧光定量PCR引物,以不同程度的干旱及不同浓度盐胁迫处理的狗尾草幼苗cDNA做模板,进行荧光定量PCR试验,通过实时荧光定量PCR扩增片段电泳分析,扩增曲线及溶解曲线综合分析,结果表明登录号Sevir.9G114100对应的actin基因是8个actin基因中最合适的内标基因。并对所选内标的实用性进行了验证,验证的结果与转录组数据的结果保持一致,证明所选内标基因可用于后续狗尾草响应不同干旱及盐胁迫狗尾草转录组基因表达的验证工作,为深入研究狗尾草功能基因奠定分子基础。     

龙眼叶片PAL基因的克隆与表达研究

为获得龙眼PAL基因的序列，并研究该基因在转录水平的表达，采用反转录PCR获得PAL的保守序列，然后利用RACE法克隆PAL基因的3'cDNA和5'cDNA序列，再利用DNAMAN软件拼接获得PAL基因的cDNA全长序列。以actin基因作为内参进行实时荧光定量PCR，研究PAL基因在4个龙眼品种嫩叶中的表达差异。结果表明，克隆得到Dlpal基因的cDNA全长序列为2 532 bp，开放阅读框为2 101 bp，编码839个氨基酸，分子量为92.259 ku，等电点为7.38。BLAST比对结果显示，该序列与其它物种的PAL基因具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果表明，Dlpal基因在4个龙眼品种‘乌龙岭’、‘松风本’、‘立冬本’和‘石峡’的嫩叶间的表达量差异显著，其中在‘立冬本’中表达量最高，在松风本中表达量最低。初步证明PAL基因在不同品种的龙眼叶片中的表达量差异显著。     

不同氮处理茶树实时定量PCR内参基因筛选和验证

为筛选不同氮处理下茶树(Camellia sinensis)实时荧光定量PCR(q RT-PCR)试验体系中最佳内参基因,以茶树幼叶、成熟叶和幼根为材料,应用qRT-PCR分析GAPDH、18S rRNA、β-actin、RPL13、a-tubulin、Ru BP等6个内参基因在不同氮浓度和氮源处理下的表达变化,借助GeNorm和NormFinder程序对候选内参基因稳定性进行评价。结果表明,在不同氮浓度和氮源处理下,GAPDH、b-actin和RPL13表达稳定性较好,GAPDH+β-actin组合稳定性最佳,可用作茶树基因表达研究的内参基因;而a-tubulin和RuBP表达稳定性较差,不适合做内参基因。为进一步证实上述结果,分别以GAPDH、a-tubulin、GAPDH+β-actin组合为内参基因,分析茶树幼叶中硝酸根转运蛋白基因(CsNRT1.2)和铵根转运蛋白基因(Cs AMT1.1)的表达水平,发现以GAPDH和GAPDH+β-actin组合为内参基因时,目的基因的相对表达量随处理时间延长变化规律基本一致;而以a-tubulin为内参基因时,目的基因的变化规律与前两者存在明显差别。因此,根据特定试验体系选择合适的内参基因对于qRT-PCR定量结果的准确性和可靠性具有重要意义。     

大麦在网斑病菌侵染后的转录组学分析

近年来,由子囊菌亚门真菌网斑病菌(Pyrenophora teres)引起的大麦网斑病在我国大麦（Hordeum vulgare L.)主产区大面积发生并流行,导致大麦产量和品质下降。为探索大麦响应网斑菌侵染的分子机制,以抗网斑病种质材料BYT-CYA3（B）和敏感型材料美41/I（M）为研究对象,利用转录组测序技术（RNA-Sep）,分析了2个材料在接种网斑病菌后不同时间点的基因表达差异。结果表明,对比网斑病菌侵染后不同时间点的转录组测序数据,共鉴定出35 545个差异表达基因;网斑病侵染大麦3 h、6 h、12 h、24 h和72 h时,抗病材料与敏感型材料间富集到GO和KEGG途径的差异表达基因数目有明显区别;共获得435个网斑病菌侵染诱导表达基因;共筛选出182个主要参与过氧化物酶体（peroxisome）、代谢途径（metabolic pathways）、MAPK信号传导途径-植物（MAPK signaling pathway-plant）、植物-病原体相互作用（plant-pathogen）、植物激素信号转导（plant hormone signal transduction）、次生代谢物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）等生物学过程的差异表达基因,推测这些基因与大麦响应网斑病菌侵染有关。随机从中选取10个基因进行了荧光定量PCR检测,并对其转录组测序结果进行定量分析,发现荧光定量PCR结果与转录结果趋势一致。本试验从分子水平初步探索了大麦对网斑病菌侵染的响应机制,为深入研究抗病基因提供了候选基因。     

茶树α-tubulin基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

根据茶树α-微管蛋白(α-tubulin)的mRNA全长序列(GenBank登录号DQ340766)设计引物,以RT-PCR方法扩增茶树α-tubulin基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,并转化至大肠杆菌BL21trxB(DE3)中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式表达。以纯化后的α-tubulin融合蛋白制备兔多克隆抗体,用Westernblot方法检测抗体特异性。结果显示α-tubulin蛋白以包涵体形式大量表达,以融合蛋白制备的抗体对茶树体内的α-tubulin具有良好的特异性。     

铝胁迫下橡胶苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选

铝毒是热带地区酸性土壤上抑制作物生长的主要因素,但目前关于铝活化后对橡胶树生长和产胶的影响及橡胶树耐铝机制的研究很少。为了筛选出橡胶树在铝毒胁迫下稳定表达的内参基因用于实时荧光定量PCR分析,本研究选择了Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10种常见的基因作为候选内参基因,通过qRT-PCR检测,利用内参基因评价软件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct算法以及综合评价软件RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评估。综合评价结果表明,铝胁迫后表达稳定性排名前3的内参基因依次分别为UBC4、40S rRNA和FP。进一步选取UBC4、40S rRNA、FP基因和UBC4+40S rRNA+FP基因组合以及稳定性较差的GAPDH基因作为内参基因对橡胶树铝诱导苹果酸分泌转运蛋白基因HbALMT-1和HbALMT-2进行相对表达分析,结果显示2个目的基因相对于3个内参基因及其组合均显示出一致的表达水平,而稳定性较差的内参基因GAPDH未能准确地对目的基因的表达量进行校正。综上所述,筛选出UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因组合可作为铝毒胁迫不同天数下表达最稳定的内参基因,可用于铝毒胁迫下橡胶树相关基因的表达分析。     

二化螟实时荧光定量PCR内参基因筛选和表达稳定性评价

【目的】筛选特定试验条件下二化螟(Chilosuppressalis)稳定表达的内参基因,为二化螟基因表达研究奠定基础。【方法】根据二化螟转录组测序结果挑选出11个候选基因,利用实时荧光定量PCR测定其在二化螟不同发育历期、不同组织、温度处理、杀虫剂处理、取食不同饲料、取食不同水稻、dsRNA处理和混合样品的表达量,利用RefFinder、BestKeeper、Ge Norm和NormFinder等软件和ΔC_t值对11个候选基因的稳定性进行评估。【结果】5种分析方法表明,在二化螟不同发育历期稳定性较高的内参基因是AK、RPL10和EF1,不同组织中稳定性较高的内参基因是EF1、TUB和ACTB,不同温度下较稳定的内参基因为TUB、RPL10和EF1,杀虫剂处理样品中较稳定的是TF4和ACTA,取食不同饲料较稳定的是TUB、TF4、EF1和RPL10,取食不同品种水稻较稳定的是TUB和EF1,dsRNA处理样品中较稳定的是TUB、AK、ACTB和EF1,混合样品中较稳定的是EF1、TUB和ACTB。【结论】为不同试验条件下选择合适的内参基因提供了参考,也有利于在二化螟基因表达研究中获得更加可靠准确的数据。     

化学杀雄剂CH1诱导的小麦雄性不育花药转录组学及相关基因表达的分析

为了揭示化学杀雄剂CH1诱导雄性不育的作用机理,以小麦品种普冰151为试验材料,利用测序技术对化杀不育系(FHS)和正常可育系(FZC,对照)的花药RNA进行转录组学分析,筛选差异表达基因,并进行GO、KEGG富集分析及实时荧光定量PCR分析。结果表明,FHS和FZC之间筛选出差异表达基因共3 895个,其中上调表达基因1 334个,下调表达基因2 561个,主要富集在碳水化合物代谢、多糖代谢、外部结构组织、细胞壁组织等;经KEGG分析,差异基因主要集中在戊糖和葡萄糖醛酸转化、淀粉和蔗糖代谢利用等通路中。利用实时定量PCR技术对转录组数据中所筛选出的5个表达差异较大的基因进行验证,在花药发育的单核期,处理与对照相比,这5个基因表现出不同的上下调趋势;而在二核期和三核期,这5个基因都表现出明显的下调趋势,推测这5个基因的下调表达有可能与化杀不育系花粉的败育有关。     

盐胁迫条件下杂交水稻种子发芽特性和幼苗耐盐生理基础

 两个杂交稻组合汕优10号和两优培九种子分别放在H2O、50 mmol/L、100 mmol/L和150 mmol/L的NaCl溶液中于30℃下发芽，测定种子发芽性能和淀粉酶活性及幼苗保护酶活性、丙二醛（MDA）含量和脯氨酸、可溶性糖、果糖和蔗糖等相容性溶质含量。结果表明，盐胁迫条件下杂交水稻种子平均发芽时间延长，发芽指数降低，但发芽势和发芽率变化不明显。盐胁迫后明显降低两优培九种子α，β-淀粉酶活性，而汕优10号中， 除在50 mmol/L NaCl溶液中α-淀粉酶活性高于对照（H2O）外，其余处理均降低了α，β-淀粉酶活性。不同盐胁迫程度下杂交水稻幼苗超氧物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛含量及脯氨酸、可溶性糖、果糖和蔗糖等相容性溶质含量变化有差异，但未见规律性趋势。杂交水稻幼苗相对含水量和耐盐比率随着盐胁迫程度加深而明显下降。试验还表明，盐胁迫条件下杂交水稻组合汕优10号种子发芽性能比两优培九好，淀粉酶和保护酶活性、相容性溶质含量和相对含水量及耐盐指数和耐盐比率也均高于两优培九，说明汕优10号幼苗耐盐性强于两优培九。     

TSA诱导橡胶树次生乳管分化过程qRT-PCR内参基因的筛选

橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是进行基因表达分析的常用技术手段,合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A, TSA）诱导橡胶树次生乳管分化的实验系统,采用qRT-PCR技术分析TSA处理橡胶树萌条及对照内层树皮中22个候选内参基因的表达情况。结果显示：TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,稳定性最高的3个基因分别为UBC3、UBC4和eIF1Aa,而稳定性最差的3个基因分别为ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因为内参,分析组蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA处理下树皮中表达量相对于对照的变化,结果初步证实TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,UBC3是最佳的内参基因,ROC3不适合作为内参基因。     

油料作物内标准基因研究与应用

内标准基因（Endogenous Reference Gene）是指具有植物物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA序列。可用于对基因组中某一目的基因进行定量分析和验证PCR反应体系中是否存在抑制物质。基于其物种特异性,内标准基因还能用于食品搀假使杂的判定。油料作物涉及我们日常生活的方方面面,油料制品的鉴别和转基因油料作物的检测急需使用内标准基因。目前,油料作物内标准基因的研究与应用取得了长足进展,但是还没有对它们进行综合比较和分析的报道。本文根据国内外有关油料作物内标准基因的研究,阐述了各物种已开发的内标准基因。并对这些基因从引物位置、扩增片段的大小、拷贝数等特征进行比较和分析。本文综述了油料作物内源特异参照基因的研究概貌和存在问题,有助于对油料作物及其他作物内源特异参照基因的进一步开发和深入研究。     

甘蓝型油菜AnnBn1基因的克隆和表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术从甘蓝型油菜抗旱品系Q2中克隆了膜联蛋白(annexin)基因,命名为AnnBn1（GenBank登录号HM244482）,并对其进行了表达分析。AnnBn1的开放阅读框长度为954bp,编码317个氨基酸。序列分析显示,推测AnnBn1基因编码的氨基酸序列含有4个重复的结构域及钙离子结合位点,与拟南芥、番茄、棉花和玉米等物种的膜联蛋白具有较高的同源性。荧光定量PCR结果发现AnnBn1基因在Q2的根、茎、叶、芽等组织中均有表达,而且表达量基本相同。对3叶期幼苗进行10%PEG（聚乙二醇）溶液模拟干旱时发现,干旱胁迫后30h内,AnnBn1基因在茎、芽中的表达量升高了2～4倍,而在叶、根中显著升高了10倍以上。AnnBn1基因表达峰值也具有时空特点,干旱胁迫后20h茎和芽中表达量高,而在30h之后叶和根中表达量高。