稻瘟菌生长缓慢突变体的筛选及遗传分析

通过在西红柿燕麦片培养基(OTA)上培养稻瘟病菌的方法,筛选了P131小种的ATMT(agrobacterium-tume-faciens mediated transformation)转化子库中的1 500个转化子,获得10个突变体,其中生长缓慢型突变体8个.将生长缓慢突变体CD8504与野生型菌株S1528进行有性杂交,分离了单子囊孢子后代33个.分离检测结果表明,生长缓慢型突变体CD8504的突变表型与潮霉素抗性标记共分离,说明生长缓慢型突变体CD8504是由于外源质粒位点插入引起的.     

农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化

建立并优化了农杆菌介导转化瓜类炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)获得T-DNA插入突变体体系,包括农杆菌使用浓度、农杆菌与炭疽菌孢子共培养时间、抗生素配合使用抑制农杆菌污染等.所用的转化载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP除了抗生素选择标记外还携带有融合GFP-GUS报告基因.转化106个孢子平均可获得约150～200个潮霉素抗性转化子.PCR检测表明,所有潮霉素抗性转化子菌株都能从其基因组DNA中扩增到转化载体中的GUS基因片段,而且都能产生GFP荧光或GUS染色阳性.转化子菌株经过连续继代培养后保持稳定.随机对36个转化子菌株进行致病性测定,发现1个转化子菌株对黄瓜致病性下降,1个丧失致病性,而大多数表现为野生型致病性.农杆菌介导转化瓜类炭疽菌体系的建立,为进一步构建大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆鉴定奠定了基础.     

稻瘟菌品种特异性改变突变体筛选及其遗传分析

通过筛选稻瘟菌(Magnaporthe grisea)P131小种的REMI(Restriction enzyme mediated integration)转化体库,获得1株对水稻品种爱知旭品种特异性改变的突变体MS220。Southern及质粒拯救分析表明:外源质粒在基因组中的整合为单位点、双拷贝反向串联插入。以质粒拯救所获得的侧端序列为探针,通过对爱知旭的毒性菌株和无毒菌株在插入位点处的RFLP分析,结果表明:两者在SacI酶切的泳道内出现了明显的多态性,由此推测,控制野生型菌株P131的无毒相关基因,由于外源质粒插入而发生突变。因此,可以以此为标记,克隆控制该表型的基因。     

大丽轮枝菌菌核型菌株T-DNA插入突变体库的构建及微菌核发育异常突变体的筛选

为阐明大丽轮枝菌微菌核形成发育的分子机理,利用农杆菌介导的遗传转化方法,建立了包含2 000个转化子的大丽轮枝菌菌核型菌株V08DF1的T-DNA插入突变体库,并在查氏、查氏-根或PDA培养基上培养,观察各转化子的菌落形态。从中筛选出130个菌落特征与野生型菌株V08DF1有明显差异的突变体菌株,其中14个突变体菌株为微菌核发育受阻。对这14个微菌核发育异常的突变体菌株进行T-DNA插入的PCR验证,均能扩增到潮霉素抗性基因,Southern杂交显示其中7个为单拷贝插入,5个为双拷贝插入,2个为三拷贝插入,表明T-DNA已经成功整合到这些突变株的基因组DNA中。     

基因枪介导小麦条锈菌毒性突变的研究

为了得到带有明确遗传标记的毒性突变菌株,应用基因枪转化技术,以小麦条锈菌野生白化菌系为转化受体,以含有潮霉素抗性基因(Hyg)的质粒为插入载体,对基因枪介导小麦条锈菌插入突变的条件进行了研究。结果表明,当小麦条锈菌夏孢子萌动2 h,可裂膜承载压力为1 100 Psi时进行轰击转化,所得的小麦条锈菌夏孢子在含有潮霉素的培养基上萌发率最高,为36.09%。进一步将转化的小麦条锈菌夏孢子进行扩繁,在筛选品种上筛选,将筛选到的突变体在其上继代培养4代,获得了两个稳定的毒性突变菌株MM-2、MM-3。MM-2菌株对南大2419的毒性减弱,反应型由野生菌系的4型变为2型;MM-3菌株在南大2419的反应型由野生菌系的4型变为2、3型,毒性发生分化。采用中国鉴别寄主对突变体的毒性研究表明,各突变菌株的毒性均较原始菌系发生了明显改变。进一步用Hyg基因特异PCR在两个突变菌系中均扩增到目的片段,表明MM-2、MM-3的突变是由Hyg基因插入引起的。     

农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体p CAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。     

限制性内切酶介导的玫烟色拟青霉原生质转化体系构建

丝孢类害虫生防真菌的生态适应性和环境抗逆性决定着生防菌剂的田间适用性,兼具多个抗逆性状的菌株一般只能通过相关功能基因的遗传操作和定向选育而获得,但这类真菌遗传操作的可行方法目前相当有限.本文利用限制性内切酶介导插入法将含有草丁膦抗性标记的Bar基因的质粒pAN52-1N-Bar转入玫烟色拟青霉Pfr116菌株的原生质体中,转化效率约为6～13个转化子μg-1质粒DNA.通过对Pfr116菌株突变转化子的基因组DNA进行PCR产物检测及基因组DNA单酶切片段的Southern杂交分析,证明Bar基因已整合到随机抽取的转化子基因组中,且都在基因组上单位点插入,转化子对草丁膦的抗性具有遗传稳定性.由此构建的原生质体转化体系具有低拷贝、转化率较高,遗传稳定强的特点,不失为一种丝孢类生防真菌遗传操作的有效方法.     

黄瓜T-DNA插入突变体库的构建

[目的]为了进一步研究黄瓜基因的功能,本文构建了黄瓜T-DNA插入突变体库。[方法]以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,将T-DNA插入突变载体pROK2后转化黄瓜;通过筛选压力梯度试验,确定遗传转化体系最适合的卡那霉素(Kan)筛选浓度;使用PCR检测和斑点杂交方法鉴定T0和T1代转化植株;以‘长春密刺’植株为对照,统计T1代植株表型。[结果]确定100 mg·L-1为最适合的Kan抗性芽筛选浓度。T0代植株PCR检测结果初步证明,pROK2成功整合到14S1和14S2两个T0代株系基因组中。14S1自交后获得55个T1代单株,对其进行PCR检测,发现其中12个单株均扩增出了35S和NPT-Ⅱ片段。以Dig标记的35S和NPT-Ⅱ为探针,对这12个单株及随机从剩余T1代中选取的11个单株进行斑点杂交检测,得到了2个含有35S和NPT-Ⅱ杂交信号的单株:14S1-27和14S1-34。性状调查统计显示:T1代植株在生长各阶段相对于野生型无明显突变表型。[结论]pROK2重组质粒成功整合到了14S1株系的基因组中。对14S1自交后代的PCR检测和斑点杂交检测结果进一步证明了14S1为转化植株,确定14S1为插入突变体。结合T-DNA插入位点鉴定技术可进一步开展相关基因分离及功能研究工作。     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失。通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体。【结论】获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL~(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL~(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

Screening and identification of mutants of Magnaporthe grisea by REMI

The plasmid pUCATPH was used to establish a transformation system in wild-type isolate M131 of Magnaporthe grisea. Six hundred and thirty-nine transformants were obtained by restriction enzyme-mediated integration (REMI) with hygromycin B (hyg B) resistance as a tag. Morphological analysis of two of the REMI mutants confirmed that they produced little melanin under black light and continued for three generations. Pathogenicity identification of six mutants screened proved that they made pathogenicity changes on three sets of differential varieties with different resistance genes. Rep-PCR analyses showed that two morphological mutants and two pathogenicity mutants differed from wild-type isolate M131 at the molecular level. RFLP analyses were performed to study the four mutants at the molecular level and the integration sites of the plasmid DNA. The results showed that the plasmid was inserted into all four mutants and that the insertion sites were random. Translated from Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science Edition), 2006, 27(2): 91–94 [译自: 扬州大学学报]     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles

Bombardment of three mutants of the chloroplast atpB gene of Chlamydomonas reinhardtii with high-velocity tungsten microprojectiles that were coated with cloned chloroplast DNA carrying the wild-type gene permanently restored the photosynthetic capacity of the algae. In most transformants of one of the mutants, a fragment with a 2.5-kilobase deletion was restored to normal size by a homologous replacement event; in about 25 percent of the transformants the restored restriction fragment was 50 to 100 base pairs smaller or larger than that of wild type. About one-fourth of the transformants of this mutant contained unintegrated donor plasmid when first examined. This plasmid persisted in four different transformants after 65 cell generations of continuous liquid culture but was lost from all transformants maintained on plates of selective medium. The restored wild-type atpB gene remains in all transformants as an integral part of the chloroplast genome and is expressed and inherited normally.     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体的筛选及Vmzfp3基因的功能分析

本研究采用接种离体枝条的方法,对150个苹果树腐烂病菌的T-DNA插入突变体库中的突变体进行了致病性的筛选,经过多次试验得到了3个致病力明显减弱的突变体,编号为X4379,X4368,X4468。基因组重测序结果显示,突变体X4379有2个T-DNA插入位点,分别是锌指蛋白3(Vmzfp3)和跨膜蛋白42(Vmtme42)。以苹果树腐烂病菌的全基因组序列为依托,设计引物,构建敲除载体以及互补表达载体。运用PEG的方法转化苹果树腐烂病菌,分别获得Vmzfp3和Vmtme42的敲除转化子和互补转化子。对Vmzfp3和Vmtme42基因敲除转化子、互补转化子以及野生型苹果树腐烂病菌菌丝形态和致病力进行分析。与野生型菌株03-8相比,Vmzfp3的敲除转化子的菌丝生长速率明显减慢,致病力也明显下降,其互补转化子使得这些功能缺陷均得以恢复。Vmtme42的敲除转化子无明显区别。由此证明基因Vmzfp3对病菌的菌丝生长,病菌的致病力具有调控作用。     

根癌农杆菌介导的稻瘟病菌近等菌系的构建与初步应用*

 利用根癌农杆菌C58C1介导转化1株致病力极弱的野生型稻瘟病菌菌株CY2,成功地获得3000多个转化子,混合接种于携带25个不同抗病单基因的水稻近等基因系上,获得4株单胞致病突变体;继代培养和PCR检测表明,这些突变体均为T-DNA插入CY2的后代,而非自发突变或外源菌株污染。将4株突变体与实验室已保存的20株致病突变体分别回接水稻近等基因系,推断其携带的致病基因类型,结果表明突变体分别针对13个抗性单基因的18个单基因系发生了突变,其中针对Pi-a,Pik-s,Pi-sh单基因系表现出较高的侵染频率。由于这些突变体均来自同一个菌株,仅致病性存在差异,属于近等菌系,利用其分析出102个水稻品种中的34个品种的抗病基因组成,其中,抗病基因Pik-s,Pi-a,Pi-sh,Pi-19(t)分布频率较高,分别达70.59%,61.76%,52.94%和44.12%,且带有这类基因的糯稻品种多于杂交水稻。     

农杆菌介导尖孢镰刀菌西瓜专化型转化体系的建立及突变体筛选

以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)FO-11-06菌株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(含pATMT1)介导的西瓜枯萎病菌的转化,并研究了转化介质和pH值对转化效率的影响。结果表明:在25℃下,采用乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600=0.15、尖孢镰刀菌分生孢子含量为1×106个/mL、pH值为5.1～5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH值为5.3时,转化效率最高,达到每106个分生孢子产生553个转化子。不同共转化介质对转化效率影响明显,玻璃纸和硝酸纤维素滤膜转化效率较高,每106个分生孢子获得551个和549个转化子,显著高于滤纸。通过转化,获得尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子1 989个,对生长速度、菌落颜色和产孢量等性状进行分析,发现有46个性状特异的突变体。研究结果为进一步研究尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长发育、致病机制和相关基因的功能奠定了基础。     

农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定

【目的】优化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的技术体系,并对转化子进行筛选鉴定,比较其生物学特性和致病性差异。【方法】以苹果炭疽病菌LXS010101分生孢子为转化受体,利用携带重组双元载体的农杆菌进行转化;对获得的转化子进行遗传稳定性测定、PCR检测及Southern blot分析;选取一定数量的转化子,比较其菌落形态、生长速率及分生孢子发育等主要生物学性状及致病性的差异。【结果】苹果炭疽病菌的最优转化体系为：病菌分生孢子悬浮液浓度1×105个/mL,共培养温度和时间分别为22℃和24 h,共培养基中添加200 μmol•mL-1乙酰丁香酮,其转化效率达到1×105个孢子可获得439个转化子。随机选取30个转化子进行鉴定,发现T-DNA已整合进炭疽病菌基因组中,在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,且能够稳定遗传。与野生型菌株相比,转化子的菌落形态没有发生明显变化,但23.33%的菌株生长速率显著减低;转化子ATJ-3和ATJ-15不能产生分生孢子,在28个产孢菌株中,分生孢子萌发率显著减低的菌株占39.29%,附着胞形成比例显著减低和形态异常的菌株占25.00%。致病性测定结果显示,11个转化子的致病力显著降低,其中菌株ATJ-19完全丧失致病能力。【结论】优化的苹果炭疽病菌遗传转化技术体系,可用于炭疽病菌致病相关基因的克隆及致病分子机理的研究。     

Expression of the Escherichia coli lacZ gene on a plasmid vector in a cyanobacterium

A biphasic plasmid vector was used to introduce the Escherichia coli K-12 lac operon into the unicellular cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6. The PR-6 transformants expressed beta-galactosidase at nearly as high a level as did Escherichia coli transformants. In order to accomplish this, it was necessary to obtain PR-6 mutants that could be transformed by plasmids with unmodified recognition sites for the endogenous PR-6 restriction endonuclease Aqu I. These mutants were generated by a variation of the ectopic mutagenesis techniques that have been used in other naturally transforming bacteria. The ability to assay the expression of lacZ in PR-6 paves the way for the construction of gene fusions with various PR-6 promoters and quantitation of their expression under specific in vivo conditions.