猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用

将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的质粒pET-ApxⅡ转化到大肠杆菌BL21(DE3)。挑选出表达量最高的克隆子，于37℃经IPTG诱导表达。对表达条件进行优化，并对包涵体进行了提纯和复性。用复性后的蛋白作抗原，建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接ELISA，试验的最佳反应条件为：最佳抗原稀释度为1：160，抗原包被液用Tris-HCl(pH8．0)，封闭液用含0．4％BSA的PBST，血清稀释度为1：40，二抗稀释度为1：6000，稀释液用含0．4％BSA的PBST，血清反应时间为30min，二抗反应时间为45min，底物反应时间为20min。与间接血凝(IHA)检测结果比较，建立的ELISA诊断方法具有良好的稳定性和可重复性，并具有较高的特异性和敏感性。用建立的间接ELISA对2503份临床送检血清进行了血清流行病学调查，结果表明，胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性率为63％。     

胸膜肺炎放线杆菌apxⅡCA基因的克隆、表达及ApxⅡ-ELISA检测方法的初步建立

根据国外已发表的胸膜肺炎放线杆菌 (APP) Apx 的基因序列设计了 1对引物 ,从我国 APP武汉株扩增出约3.5 kb的 apx CA基因。测序结果表明 ,该基因的大小与国外已报道的 1型和 9型 APP的 apx CA基因大小一致 ,同源性达 99%。将该基因连接到原核表达载体 p ET- 17b,构建了原核表达质粒 p ET- apx CA,并在大肠杆菌 BL 2 1(DE3)中表达出了大小约 10 5 0 0 0的 Apx 蛋白。提取包涵体蛋白作为抗原包被 EL ISA酶标板 ,对已知阳性、阴性血清和临床送检血清样品进行了 EL ISA检测 ,从而为最终建立 Apx - EL ISA检测方法奠定了基础     

猪胸膜肺炎放线杆菌间接ELISA检测方法的建立

【摘 要】用纯化的重组蛋白抗原作为ELISA包被抗原,通过对抗原包被浓度、血清稀释倍数、酶标二抗稀释倍数、抗原和血清反应时间、血清和酶标二抗反应时间、显色剂作用时间和中止液滴加量的优化,建立了检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接ELISA方法。通过特异性实验证明该ELISA方法特异性较强。将建立的ELISA方法与IDEXX公司的标准试剂盒进行了比较,二者的符合率较高,说明建立的ELISA方法比较敏感,为ELISA检测方法的商品化奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素基因的克隆与表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌保护性免疫机制,试验筛选猪胸膜肺炎放线杆菌3~8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆,测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素(AT-Adhensin)基因,根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该黏附素蛋白。结果表明,该蛋白与猪传染性胸膜肺炎康复期血清发生反应。     

应用PCR技术快速检测猪胸膜肺炎放线杆菌

为了研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的快速检测技术,试验采用GenBank中猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APXⅣA基因的序列设计了1对引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌的PCR方法。结果表明:猪胸膜肺炎放线杆菌血清1～10型均能扩增出预期片段,而金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性;用该方法检测自猪鼻腔采集的87份鼻拭子,有15份为阳性,72份为阴性。说明建立的猪胸膜肺炎放线杆菌PCR方法可用于猪胸膜肺炎的快速诊断。     

羊流产衣原体间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

以羊流产衣原体特异性外膜蛋白POMP90a为诊断标识,将其纯化后作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。试验的最佳反应条件为:最佳抗原浓度度为2μg/mL,血清抗体稀释度为1∶20,封闭液和稀释液用含0.5%BSA的PBST,酶标二抗稀释度为1∶5 000。由于传统的IHA试剂盒只能检测衣原体目,对于其种属不能区别,该方法比IHA适合确诊流产衣原体。因此,该研究建立的羊流产衣原体间接ELISA抗体检测方法具有良好的稳定性和可重复性,并具有较高的特异性和敏感性。     

猪肺炎支原体融合蛋白MHP-P46-P36的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

利用生物学软件分析猪肺炎支原体P46蛋白和P36蛋白的抗原决定簇,将抗原表位富集区进行串联,表达融合蛋白MHP-P46-P36。以融合蛋白MHP-P46-P36作为包被抗原,优化反应条件建立肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示：融合蛋白MHP-P46-P36以可溶性形式高效表达;ELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度10 mg/L, 1%BSA封闭60 min,一抗最佳稀释度1∶40且37℃60 min,二抗最佳稀释度1∶4 000且37℃60 min,最适显色时长15 min, cut-off值为D_{450 nm}=0.385;与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪蓝耳病病毒和猪圆环病毒阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性;阴阳性血清的组内和组间变异系数均小于7%,具有较好重复性;52个样品临床样本检测结果显示,建立的ELISA方法与IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒相比,阳性样本的符合率为83.09%。     

鸭坦布苏病毒病EDⅢ-ELISA方法的建立

为建立鸭坦布苏病毒抗体ELISA检测方法,采用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒ZJSBL01株E蛋白结构域III(EDIII)基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a,转化到BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得了重组EDIII蛋白。利用EDIII蛋白作为包被抗原,建立了检测DTMUV Ig G抗体的间接ELISA方法,并对反应条件进行优化。最终确定抗原包被浓度为4μg/m L、血清稀释度为1:40、抗原包被条件为37℃包被4 h、封闭液为含3%BSA的PBST、封闭条件为37℃封闭2 h、酶标二抗稀释度为1:1 000、底物反应时间为15min作为ELISA的最佳反应条件。当检测样品S/P大于0.306判定为阳性。建立的ELISA检测方法特异性强、重复性好,对开展鸭坦布苏病毒抗体检测及血清学调查具有重要意义。     

酶联免疫吸附法检测磺胺对甲氧嘧啶残留

用戊二醛法将磺胺对甲氧嘧啶 (SMD)与载体蛋白牛血清白蛋白 (BSA)偶联制备合成抗原 SMD- BSA用作免疫原 ,同法合成包被抗原 SMD- OVA(卵清蛋白 ) ,免疫家兔获得抗血清 ,用双向琼脂扩散试验和 EL ISA法对抗血清进行了定性定量测定。结果表明 ,抗血清特异性地针对 SMD,其效价为 1∶ 2 5 6 0。用所制备的抗血清建立了间接竞争EL ISA法。优选的 EL ISA的工作条件 :包被抗原最佳包被质量浓度为 5 0 mg/ L ,抗血清最佳稀释度为 1∶ 10 0 ,酶标抗体的最适工作稀释度为 1∶ 5 0 0。标准工作曲线表明 ,抗血清检测在 10～ 2 0 0 0 μg/ L 范围内呈良好的线性关系 ,超过2 0 0 0μg/ L则线性关系较差 ;该法检测底限为 6 3μg/ L ,低于国际规定残留限量 (10 0μg/ kg)和国内规定残留限量 (30 0μg/ kg)的要求。按建立的 EL ISA法测定了方法的回收率 ,无基础本底的牛奶样品回收率为 94 .7%。按药典剂量给鸡肌肉注射 SMD,连续注射 3d,在第 0～ 7天分别采血 ,按建立的 EL ISA方法测定了血清中的 SMD残留含量     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

以猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型标准株ApxⅠ天然外毒素为免疫抗原,接种Balb/c小鼠；设计编码ApxⅠN-端具有保护性抗原表位apxⅠA基因(1149 bp)的引物,构建原核表达载体pET-32a-apxⅠA,转化至E.coli BL21,获得分子质量约为41 ku的rApxⅠA作为包被抗原,用间接ELIS...     

突变缺失Apx毒素分泌蛋白基因apxⅢB和apxⅢD的胸膜肺炎放线杆菌血清2型的构建与鉴定

经鉴定,Apx毒素是猪胸膜肺炎的病原体—胸膜肺炎放线杆菌的重要毒力因子。在一些胸膜肺炎放线杆菌血清型中,Apx毒素是由apxⅢB和apxⅢD编码后经细胞膜分泌的。为了构建1株抗胸膜肺炎放线杆菌的活疫苗株,笔者将胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株-1536的apxⅢB和apxⅢD基因进行灭活,从而构建DeltaapxⅢB/DapxⅢD突变株(1536DeltaBDeltaD)。用活的1536DeltaBDeltaD胸膜肺炎放线杆菌对猪进行免疫后,能保护猪免于同源的野生型胸膜肺炎放线杆菌1536的攻击。因此,被损坏的Apx毒素分泌物可使胸膜肺炎放线杆菌的毒力减弱,并可作为开发胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗的有效策略。     

基于外膜蛋白Omp16的副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测副猪嗜血杆菌(H.parasuis)抗体方法,本研究以H.parasuis外膜蛋白Omp16为包被抗原建立了检测H.parasuis的间接ELISA方法。反应条件经优化为:抗原包被浓度为1μg/m L,血清稀释度为1:80;血清与抗原最佳作用时间为40 min,二抗稀释10 000倍,与一抗孵育30 min;TMB作用时间为30 min。利用该ELISA方法检测H.parasuis、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌和猪链球菌2型等血清,除H.parasuis为阳性外其余均为阴性,表明其特异性强。该ELISA方法可检测到最高稀释度为1∶512的阳性血清,敏感性高。重复性试验显示,其批内和批间的重复试验变异系数(CV)分别在3.62%~8.97%和4.3%~9.50%。该ELISA检测方法与进口ELISA试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总体符合率分别为87.8%,90.7%和88.6%。本研究建立的间接ELISA方法,为H.parasuis血清流行病学调查及疫苗免疫评价等提供了重要手段。     

猪放线杆菌性胸膜肺炎的防治措施

<正>猪放线杆菌性胸膜肺炎是一种伴有胸膜肺炎的出血性坏死肺炎,其病原为猪胸膜肺炎放线杆菌。近些年该病在我县的发病率呈上升趋势,很大程度上困扰着养猪户,特别是在规模化养猪场倘若暴发猪放线杆菌性胸膜肺炎将造成严重的经济损失。笔者结合工作实践经验,着重对猪放线杆菌性胸膜肺炎的科学防治措施进行了探讨,供大家参考。1病原猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,App)为小球杆菌,呈革兰氏阴性,形态为多形性或线状,有(不完全)荚     

免疫磁珠技术分离猪胸膜肺炎放线杆菌

利用表达并纯化的胸膜肺炎放线杆菌保守外膜蛋白作为抗原,免疫家兔制备抗血清,并利用纯化后的IgG包被免疫微球,确定了包被磁珠所需的IgG浓度及包被时间,建立了利用免疫磁珠技术检测胸膜肺炎放线杆菌的操作流程。该方法能检测本室保存的胸膜肺炎放线杆菌的14个标准血清型,敏感性高于直接涂布平皿法,用此方法分离送检的20个疑似菌株,分离出10个菌株,与apxⅣ-PCR检测结果相比,符合率为100％。该方法也能从人工感染猪的肺和扁桃体回收到病原。用建立的免疫磁珠技术检测了从河南、湖南和湖北等地送检的病料,成功分离了5株可疑胸膜肺炎放线杆菌,经apxⅣ-PCR鉴定为胸膜肺炎放线杆菌。上述结果表明,建立的免疫磁珠技术可用于胸膜肺炎放线杆菌的分离。     

猪囊尾蚴头节抗原的制备及间接ELISA方法的建立

采用Sephadex G-200层析技术纯化猪囊尾蚴头节抗原,用纯化抗原包被ELISA板,建立间接ELISA方法。通过各种条件优化,最终确定最佳试验条件为:抗原最适包被量为30mg/L;血清稀释度为1∶800;血清最佳反应时间为60min。结果表明,该方法具有较好的稳定性和重复性,可用于分泌抗猪囊尾蚴头节单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选。     

猪圆环病毒2型CaP蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

本研究旨在建立以PCV2 Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0 mmol·L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg·mL-1;血清最佳稀释度为1:40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1 h;血清反应时间为37℃30 min;酶标二抗最适作用时间为37℃45 min;底物最佳反应条件为37℃显色15 min.用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2 ELISA试剂盒得到的结果基本一致.本试验成功建立了PCv2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测.     

涪陵区集约化猪场猪传染性胸膜肺炎血清学调查

为了调查猪传染性胸膜肺炎在我区集约化猪场的流行情况,我们采用血清学方法于2009年11月对本区19个集约化猪场未免疫猪传染性胸膜肺炎疫苗的哺乳仔猪和成年种猪进行抽样调查,380份血清样品用间接ELISA对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIV蛋白进行抗体检测。结果表明,血清样品阳性率为28．95％,其中哺乳仔猪和成年种（母）猪抗体阳性率分别为15．79％和42．22％。     

淄博地区猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

此次分离的细菌为猪胸膜肺炎放线杆菌,有血清5型和血清7型两个血清型,其中血清5型13株(65%)血清7型7株(35%),血清5型为相对优势的血清型;小白鼠致病性实验结果发现,同一血清型的猪胸膜肺炎放线杆菌接种小鼠后的发病情况和剖检变化基本相同。药敏试验表明所分离的胸膜肺炎放线杆菌对头孢三嗪、丁胺卡那霉素、庆大霉素等高度敏感,而对氟哌酸、氨苄青霉素、呋喃妥因有抗性。     

间接ELISA检测禽霍乱抗体方法的建立

用多杀性巴氏杆菌 TJ8菌株制备ELISA抗原 ,与抗鸡 Ig单抗 1 B7酶结合物建立了检测鸡血清抗体水平的间接 ELISA方法。交叉试验、阻断试验、重复性试验等表明该方法重复性好、特异性强 ,灵敏度高。确立了将鸡血清 1 0 0倍稀释监测 ELISA效价(ET)的回归方程 y=1 .4981 + 0 .391 9x(P>0 .0 5 ) ,可用于定量测定。间接凝集试验与ELISA方法的比较试验表明 ,EL ISA法比间接血凝试验敏感性高 4倍以上     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。